ИСТИНА

Неорганический пирофосфат является метаболитом многих биосинтетических процессов. Неорганические пирофосфатазы гидролизуют его, тем самым сдвигая равновесия реакций в сторону биосинтеза. В некоторых бактериальных клетках присутствуют два типа фермента – мембранная пирофосфатаза, действующая как H+ (Na+)-помпа и растворимая, преобразующая энергию гидролиза в тепловую энергию. Мембранный фермент практически не поддается регуляции, а уровень пирофосфата в клетке остается постоянным. Отсюда вытекает необходимость регуляции растворимого фермента. Растворимые неорганические пирофосфатазы второго семейства, содержащие нуклеотид-связывающие CBS-домены (CBS-РРазы), являются ярким примером регуляции. Каждая из двух одинаковых субъединиц димерного белка имеет в своем составе пару CBS-доменов, связывающую одну молекулу адениновых нуклеотидов (AMP, ADP, ATP). АМР и ADP ингибируют, а ATP активирует фермент. В данной работе было обнаружено, что регуляция CBS-РРазы происходит по кооперативному механизму, который имеет два уровня: кооперативность связывания субстрата и кооперативность связывания адениновых нуклеотидов. Оба типа кооперативности положительны и, действуя вместе, усиливают зависимости активности фермента от концентраций пирофосфата и адениновых нуклеотидов. Также был выявлен еще один класс активаторов CBS-РРаз – диаденозинполифосфаты (APnA, n = 3-6). Кроме активации фермента в несколько раз, они устраняют оба типа кооперативности в регуляции; по своему сродству к CBS-РРазе APnA превосходят мононуклеотиды на 2-3 порядка. Методом калориметрического титрования было установлено, что стехиометрия связывания АМР, АDP и ATP составляет 2:1, а APnA – 1:1 в расчете на димер фермента. Таким образом, CBS-РРаза регулируются исходя из энергетического состояния клетки. Когда клетки не хватает энергии (бóльшая часть ATP гидролизована до ADP и AMP), активность CBS-РРазы мала и пирофосфат накапливается. Когда энергии много, уровень активаторов (ATP и APnA) повышен и пирофосфат гидролизуется. Работа выполнена в рамках гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований №12-04-01002 на базе НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского.