ИСТИНА

Белок человека Ku – это гетеродимер, состоящий из субъединиц Ku70 и Ku80. Основная его роль в клетке – участие в репарации двухцепочечных разрывов в ДНК путем негомологического объединения концов и в V(D)J рекомбинации. В этих процессах Ku эффективно связывается с концами двухцепочечной ДНК в местах разрывов, при этом его способность взаимодействовать с внутренними областями ДНК до сих пор однозначно не показана. Тем не менее существует большое число литературных свидетельств участия этого белка в регуляции транскрипции клеточных и вирусных генов, включая транскрипцию одного из наиболее опасных вирусов – вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Важно отметить, что участие Ku в транскрипции может определяться его взаимодействием как с белками, так и с ДНК. Наибольшее число вопросов вызывает именно ДНК-опосредованное участие Ku в транскрипции, поскольку, исходя из структуры этого белка, сложно понять, как он может взаимодействовать с внутренними областями ДНК и, в частности, с промоторами генов. Известно, что Ku не способен связываться с замкнутыми плазмидными ДНК, однако, существуют данные о способности Ku сиквенс-специфично взаимодействовать с некоторыми промоторными областями ДНК, например, с промоторами вирусов MMTV и HTLV [Giffin et al., J Biol Chem, 1997]. Предполагается, что при транскрипции ВИЧ-1 Ku непосредственно взаимодействует с вирусным промотором, хотя механизм этого взаимодействия детально не установлен. Целью нашей работы было изучение участия Ku в транскрипции ВИЧ-1. В первую очередь, было исследовано влияние внутриклеточного уровня Ku на транскрипцию гена репортерного белка люциферазы светлячка, находящегося под контролем промотора ВИЧ-1 в конструкции на основе вектора pGL3. Оказалось, что эффективность транскрипции снижается при снижении уровня отдельных субъединиц Ku в результате их нок-дауна. Чтобы изучить, может ли Ku влиять на транскрипцию за счет непосредственного взаимодействия с внутренними областями ДНК, была проведена серия in vitro экспериментов. Была разработана бис-цистронная конструкция, позволяющая одновременно нарабатывать белки Ku70 и Ku80 в клетках E.coli, и получен рекомбинантный препарат белка. Методами «торможения в геле» и футпринтинга была изучена способность рекомбинантного белка связываться с синтетическими ДНК-дуплексами, содержащими последовательности из промоторных областей ВИЧ-1 и MMTV, фланкированные с обоих концов ДНК-шпильками и короткими дуплексами, предотвращающими «наползание» Ku со свободных концов ДНК. Полученные результаты позволяют нам предположить, что Ku может взаимодействовать с внутренними областями ДНК в местах формирования неканонических структур, например, шпилек и «крестов». Помимо этого, нами был синтезирован аналог низкомолекулярного ингибитора STL127705, предложенного в работе [Weterings E., et al., DNA Repair, 2016], и показано, что это вещество подавляет связывание Ku как с линейной ДНК, так и с ДНК с «закрытыми концами». Таким образом, Ku, очевидно, может влиять на транскрипцию за счет взаимодействия с неканоническими структурами ДНК в составе промоторов. Комплекс Ku с ДНК является потенциальной мишенью для создания противовирусных и противораковых препаратов с принципиально новым механизмом действия. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант РФФИ №18-04-00542 А)