ИСТИНА

Ядерный скелет, основным структурным компонентом является ядерная ламина, обеспечивает механическую прочность клеточного ядра, а также участвует в позиционировании хромосом внутри ядра, в частности, при помощи заякоривания специфических хромосомных локусов на ядерной периферии. Поскольку взаимодействие хромосом с ядерной оболочкой/ламиной является неслучайным и коррелирует с транскрипционной активностью генов и таймингом репликации, возможная активная роль ламины в регуляции этих процессов представляется весьма вероятной. В частности, прочная связь хроматина с ламиной может создавать топологические проблемы при репликации периферического гетерохроматина, что, в свою очередь, требует временной диссоциации реплицирующегося хроматина от ядерной ламины для эффективной репликации. Действительно, исследование динамики внутриклеточной локализации искусственного гетерохроматического хромосомного локуса размером около 90 м.п.н, ассоциированного с ядерной оболочкой, в ходе клеточного цикла показало, что репликация данного локуса сопровождалась перемещением его внутрь ядра (Li et al., 1998). Поскольку в этой работе вопрос структурной организации и динамики периферического ядерного скелета в области прикрепления трансгенного локуса не было исследовано, в настоящем исследовании мы изучили корреляцию между изменениями в трехмерной организации ламины и перемещениями хромосомного локуса в S-фазных клетках, используя ту же модельную систему. Компактный гомогенно окрашеный хромосомный локус, содержащий тандемные повторы Lac-репрессора выявлялся на периферии ядра начиная с середины G1-фазы до средней S-фазы. При этом трансгенный локус находился в тесном контакте с ядерной ламиной, что наблюдалось как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. В середине синтетического периода локус деконденсировался и перемещался внутрь ядра, где происходила его репликация. В G2 реплицированный локус снова контактировал с ядерной периферией. При этом изменения положения данного хромосомного локуса и его декомпактизация сопровождались изменениями в морфологии ламины, визуализуемой при помощи специфических антител, либо при помощи экспрессии в данных клетках GFP- или mRFP-ламинов. Декомпактизация искусственного хромосомного региона сопровождалась формированием глубоких инвагинаций ламины, при этом перемещающийся внутрь ядра хромосомный локус не терял с ней связи на всех стадиях этого процесса. Данные наблюдения свидетельствуют о высокой пластичности ламины в области прикрепления реплицирующегося хроматина, причем эта пластичность проявляется еще до начала собственно синтеза ДНК. Сходный характер распределения ламинов в клетках СНО, СНО_А03 и СПЭВ подтвердил, что присутствие в ядре искусственного хромосомного локуса не приводило к значительным изменениям в организации ламины. В клетках СПЭВ, СНО и СНО_А03 ламины были локализованы в периферической ламине и в инвагинациях, отходящих от периферической ламины внутрь ядра. Ламины А также были диффузно распределены в нуклеоплазме за исключением области ядрышек, причем находились в полимерном состоянии, так как предобработка клеток тритоном до фиксации не приводила к вымыванию ламинов. В составе ядерной оболочки ламины располагались негомогенно: яркость свечения GFP-ламинов или антител варьировала для разных участков ядерной оболочки, причем зоны повышенной концентрации ламинов коррелировали с расположением масс конденсированного периферического хроматина. Детальный ультраструктурный анализ сайтов репликации, выявляемых при помощи экспрессии в клетках GFP- PCNA с его последующей детекцией методом иммуноэлектронной микроскопии выявил локальное нарушение контактов между реплицирующимся хроматином и ядерной ламиной. В клетках, демонстрирующих периферическое расположение PCNA-позитивных сайтов репликации (что соответствует средней S-фазе), реплицирующиеся хромосомные локусы располагались на некотором расстоянии от ядерной ламины. Отсутствие подобного ярко выраженног открепления искусстевенного хромосомного локуса, по-видимому, объясняется его сложной репликативной организацией: в его составе присутствует несколько асинхронно реплицирующихся кластеров репликонов, отделяющихся от ядерной ламины попеременно, тогда как полной диссоциации всего локуса не происходит.