ИСТИНА

На данный момент известно несколько различных механизмов репарации ДНК. Особое место среди них занимает система репарации неканонических пар ДНК (мисматчей). Белок MutS является связующим звеном, в этой системе. Имеются предположения [1], что этот белок сканирует ДНК до тех пор, пока не обнаружит мисматч, затем он меняет свою конформацию и запускает ряд взаимодействий между компонентами системы репарации. Данная работа нацелена на выяснение механизма функционирования системы репарации. Задачей работы было получение стабильных ковалентных комплексов одноцистеиновых мутантных форм фермента MutS с ДНК-дуплексами, как содержащими, так и не содержащими некомплементарную GT-пару (мисматч). В качестве реакционноспособных ДНК-лигандов нами предложено использовать дуплексы, содержащие в своем составе единичную 2’-йодацетамидную группу. Такие соединения способны избирательно реагировать с остатком цистеина белка, сближенным с активной группировкой в составе ДНК-белкового комплекса [2]. Для выбора места модификации в цепи ДНК, а также тех аминокислотных остатков MutS, которые нужно подвергнуть замене на цистеин, мы проанализировали имеющуюся структуру комплекса MutS с ДНК, содержащей неканоническую пару оснований (PDB-код 1E3M). Всего было рассмотрено 33 аминокислоты. Все эти аминокислоты образуют контакты в десяти положениях дуплекса На основе белка MutS ранее была создана библиотека мутантных форм, в которых единичный аминокислотный остаток заменен на цистеин. Наиболее перспективными, кажутся замены N497C и N468C в связи с их близостью к сахарофосфатному остову ДНК. В ходе работы были синтезированы семь модифицированных олигонуклеотидов. Пять из них входят в состав гетеродуплексов, содержащих GT-пару, но отличающихся первичной структурой и положением модифицированного звена, с которым предположительно сближены аминокислотные остатки 497 или 468 MutS. Также для изучения белка на этапе сканирования были синтезированы два модифицированных олигонуклеотида, которые являются составными частями двух дуплексов без мисматчей. Рекомбинантная система для экспрессии этих белков была получена на основе штамма E. coli HMS174 (DE3), и плазмиды pTX412 со вставкой гена mutS или его мутантных форм. Оптимизированы условия экспрессии синтеза белка. Белки выделяли методом аффинной хроматографии на Ni- NTA-целлюлозе. Выделено и очищено до гомогенного состояния 4 белка: wt MutS (дикий тип), cf MutS (белок, не содержащий остатков цистеина), cf MutS(N497C) и cf MutS(N468C). Для получения ДНК-лигандов с 2'-йодацетамидной группой необходимо провести постсинтетическую обработку 2’-аминосодержащих интермедиатов ангидридом йодуксусной кислоты. Были подобраны оптимальные условия проведения данной реакции. Были подобраны оптимальные условия связывания белка с ДНК-дуплексом. В этих условиях получены ковалентные комплексы мутантных белков MutS N497C и N468C с дуплексами, содержащими 2’-йодацетамидную группу с выходом до 20%. 1. Gorman еt al, Mol. Cell, 2007, 28, 359 2. Борисова и др., Молекул. биология, 2003, 37, 534-543