ИСТИНА

Конъюгаты протеолитических ферментов с нано-алмазами - НА-химотрипсин и НА-папаин - были впервые синтезированы карбодиимидным методом. По данным аминокислотного анализа включение белка составляет 7-12% по массе. ζ–потенциал частиц положительный, в то время, как потенциал клеток – отрицательный. Протеолитическая активность конъюгатов – 35-40% по сравнению с чистыми ферментами. Химотрипсин – фермент класса гидролаз, относящийся к клану PA-S1 сериновых протеаз, в активном центре которых находится серин. Фермент расщепляет пептидные связи в белках и пептидах, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот. Папаин – растительный фермент класса гидролаз, относящийся к клану CA-C1 цистеиновых протеаз, содержит в активном центре цистеин и обладает широкой специфичностью. Он расщепляет белки, пептиды, амиды и сложные эфиры основных и гидрофобных аминокислот. Действие исследуемых ферментов на клетки проявляется в изменении формы клеток – плоские, прикрепленные к подложке и плотно контактирующие друг с другом клетки становятся сферическими и при длительном воздействии ферментов отделяются от подложки. Предоставленные для исследования НА представляют собой частицы диаметром около 5 нм, в гидрозоле существующие в виде агрегатов размером порядка 30-50 нм. Конъюгаты НА-протеаза формируют крупные агрегаты, размеры которых могут приближаться к одному микрону. НА способны к флуоресценции, как в свободном состоянии, так и в связи с протеолитическими ферментами. Спектр испускания содержит два максимума в области 490-495 нм и 575-580 нм. В синей части спектра флуоресценция не обнаружена. Конъюгаты НА-протеаза оказывают на клетки такое же действие, как и свободные ферменты. Атаке подвергаются белки, экспонированные во внешнюю среду, в том числе – белки адгезии к подложке и белки межклеточных контактов. НА не токсичны, не подавляют пролиферацию клеток. Проникновение НА в клетки изучали с применением электронного микроскопа. Показано, что при этом задействован клатрин-зависимый путь эндоцитоза. Процесс требует более трех часов, но менее одних суток, а спустя сутки после внесения НА выявляются во вторичных лизосомах. Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант № НК-12-14-00709/14 на приборах, закупленных по программе развития МГУ им. М. В. Ломоносова ПНР5.13.