ИСТИНА

В результате «ошибок» ДНК-полимеразы в ходе процесса репликации возникают повреждения ДНК, за исправление которых отвечает система репарации некомплементарных пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR). Внесение одноцепочечного разрыва в дочернюю цепь ДНК, содержащую некомплементарную пару, осуществляет белок MutL – один из ключевых ферментов системы, механизм действия которого практически не изучен [1]. Объектом данного исследования является белок MutL из бактерии Neisseria gonorrhoeae (ngMutL), которая является патогеном человека. В настоящее время перспективные подходы к исследованию механизмов функционирования белков и их комплексов с молекулярными партнерами (другими белками или нуклеиновыми кислотами) основаны на методах флуоресцентного резонансного переноса энергии и флуоресцентной микроскопии одиночных молекул. Привлекательной мишенью для введения флуорофоров в молекулу белка являются остатки Cys. С другой стороны, они важны для поддержания структуры белков и присутствуют в их активных центрах. ngMutL содержит 5 остатков Cys. C604 и C635 являются высококонсервативными для белков MutL с эндонуклеазной функцией, локализованы в С-концевом домене, необходимом для катализа гидролиза ДНК. Нами впервые выделена мутантная форма ngMutL - ngMutLcf, в которой все 5 остатков Cys заменены на другие аминокислоты. Методом кругового дихроизма показано, что такие замены не влияют на вторичную структуру белка. ngMutLcf потенциально может быть основой для создания мутантных вариантов этого белка с единственным остатком цистеина в заданном положении полипептидной цепи, необходимых для дальнейших исследований с использованием указанных выше подходов. Целью работы являлась детальная сравнительная характеристика основных функций белка дикого типа (ngMutLwt) и его бесцистеинового варианта (ngMutLcf). Установлено, что сродство ngMutLcf к АТФ сопоставимо с ngMutLwt, но скорость гидролиза АТФ мутантной формой белка на 20% ниже. ngMutLcf вносит одноцепочечный разрыв в плазмидную ДНК за 60 мин при 37ºС с той же эффективностью, что и белок дикого типа. Вместе с тем, замена аминокислотных остатков Cys приводит к отложенной по времени (от 5 до 10 мин) активации эндонуклеазной активности белка. Показано, что в присутствии Zn2+ ингибируется гидролиз плазмидной ДНК белками ngMutLwt и ngMutLcf. Однако, этот эффект менее выражен в случае бесцистеиновой формы белка, что может быть связано с тем, что остатки Ser, на которые заменены два консервативных остатка Cys С-концевого домена MutL, ответственного за эндонуклеазную функцию, менее эффективно координируют ионы Zn2+. Впервые обнаружено, что остатки Cys белка MutL необходимы для его взаимодействия с фактором процессивности – β-субъединицей ДНК-полимеразы III при гидролизе линейного субстрата. Таким образом, ngMutLcf сохраняет АТФазную и эндонуклеазную активности, однако обнаруженные особенности в функционировании этого белка могут влиять на реализацию последующих этапов MMR in vivo.