ИСТИНА

Одним из перспективных направлений современной биоаналитической химии является разработка безреагентных (не требующих добавления реагентов извне за исключением аналита) оптических сенсорных элементов на основе пероксидазы из корней хрена для определения широкого круга биологически активных веществ. Этот коммерчески доступный фермент катализирует реакции окисления различных органических соединений (субстратов-восстановителей) пероксидом водорода (основным субстратом-окислителем) и используется в качестве иммуно- и ДНК-метки в соответствующих методах. На настоящий момент времени предложено большое количество сенсорных систем на основе пероксидазы и ее субстратов-восстановителей, иммобилизованных в различные твердые матрицы (пленки, гели и другие). Однако ключевым недостатком/ограничением таких сенсоров по-прежнему является необходимость добавления пероксида водорода извне (ex-situ) вследствие низкой стабильности при хранении основного субстрата фермента. Предложенные в литературе различные способы стабилизации этого соединения не привели к существенных результатам [1] В рамках этой работы предложен новый подход к созданию безреагентных сенсорных систем на основе пероксидазы, а именно in-situ генерация пероксида водорода из наночастиц пероксида цинка путем регулирования рН сенсорной системы. Эффективность предложенного подхода была продемонстрирована путем оценки каталитической активности пероксидазы, которую определяли по накоплению поглощающих и флуоресцирующего продуктов реакции окисления классических субстратов-восстановителей фермента, таких как 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) и о-фенилендиамин (ФДА). Запуск реакции генерации пероксида водорода из наночастиц пероксида цинка проводили в 0.1 М фосфатном буферном растворе, рН 5.5. В ходе выполнения исследования варьировали условия проведения реакции пероксидазного окисления ТМБ и ФДА, а именно концентрации фермента, субстратов-восстановителей, содержание наночастиц. Появление характерных максимумов поглощения при λmax = 455 нм свидетельствовало об образовании конечного продукта окисления ТМБ (хинондиимин темно-оранжевого цвета), а при λmax = 375 и 655 нм - промежуточного продукта (мерихиноидного комплекса голубого цвета); а также продукта окисления ФДА (2,3-диаминофеназина), который является и хромогенным (λmax= 430 нм), и флуорогенным (λex = 570 нм) субстратом-восстановителем пероксидазы. Образование перечисленных продуктов является подтверждением пероксидазного окисления указанных субстратов в присутствии наночастиц пероксида цинка. Зависимость величины оптической плотности и интенсивности флуоресценции продуктов окисления ТМБ и ФДА в присутствии in-situ сгенерированного пероксида водорода от концентрации как субстрата, так и фермента линейна, а время выхода аналитического сигнала на плато составляет 5-7 мин, что на 40 % быстрее, чем в случае добавления пероксида водорода извне. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 20-13-00330). Литература: 1. Woerner T. et al. Stabilization of H2O2 under alkaline conditions // United States Patent. US, 2009. Vol. USOO756356.