ИСТИНА

На основе искусственной эволюции SELEX отбора аптамеров, специфичных к рекомбинантному RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 была опробирована и подтверждена эффективная система для идентификации последовательности аптамера на основе нанопорного секвенирования. Целью проведенного отбора было увеличение стабильности аптамера к к SARS-Cov2 по сравнению с описанными в литературе. Для этого было решено преструктурировать рандомизированный участок библиотеки и отбирать аптамеры из меньшего пула возможных, но частично пре-структуризированных последовательностей. Исходная ДНК-библиотека состояла из 31-звенного частично рандомизированного участка и двух фланкируюших уникальных последовательностей для последующей амплификации (20 нуклеотидов каждый). Рандомизированный участок библиотеки представлял собой последовательность, где соотношение нуклеотидных остатков (N) было различным N= 45:05:45:05 A/C/G/T; N1 = 05:45:05:45 A/C/G/T; N2 = 25:25:25:25 A/C/G/T, . Предполагается, что аптамер, синтезированный по такой схеме, будет с большей вероятностью образовывать в растворе стабильную структурную платформу с различными петлями, обеспечивающими селективность взаимодействия. Далее проводили параллельно два независимых эксперимента SELEX: для отбора аптамеров из исходной ДНК-библиотеки, а также для отбора аптамеров с последовательностями, комплементарными исходной ДНК-библиотеке (отсутствует пре-формирование структуры) как контроль. После второго цикла SELEX и далее в эксперимент добавили дополнительный шаг, заключающийся в связывании преформированной ДНК-библиотеки только с Ni-NTA в течение 10 мин при комнатной температуре. Этот шаг позволил исключить из общего пула последовательностей фракцию последовательностей, взаимодействующих с Ni-NTA. Супернатант использовали для дальнейшего взаимодействия с RBD-Ni-NTA, промывали, полученную взвесь прогревали для разрушения комплекса ДНК-RBD и использовали в дальнейшем в качестве матрицы для ПЦР. Для отбора аптамеров с последовательностями, входящими в состав исходной ДНК-библиотеки, использовали небиотинилированный праймер для синтеза «верхней» цепи и биотинилированный праймер для синтеза «нижней» цепи. Для отбора аптамеров, закодированных в цепи, комплементарной исходной ДНК-библиотеке, использовали биотинилированный праймер для синтеза «верхней» цепи и небиотинилированный праймер для синтеза «нижней» цепи, получали одноцепочечную ДНК и обессоливали. Полученный раствор ДНК использовали для дальнейшей селекции в следующем цикле SELEX. Для увеличения «давления» отбора в ходе SELEX количество RBD при связывании с ДНК-библиотекой постепенно уменьшали в каждом цикле (с 500 пкмоль в первом цикле до 100 пкмоль в двенадцатом). После 12 раундов селекции отобранные последовательности были объединены статистически в полинкулеотидные цепи средней длинной 500-1000 н.о., такие последовательности таких молекул были определены прямым сквенированием третьего поколения (нанопорное секвенирование). Был разработан алгоритм для анализа полученнцых последовательностей, на основе которого была определена уникальная последовательность аптамера. Этот аптамер был химически синтезирован, очищен. Было оценено взаимодействие с белком двумя различными методами (Кд ~10нМ). Эффективное взаимодействие подтвердило успешную селекцию и успешное использование нанопорного секвенирования нового поколения для идентификации последовательности аптамеров в исскуственном отборе.