ИСТИНА

Формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2, ФДГ) применяется в качестве биокатализатора регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных и лекарственных соединений. Одним из таких ферментов является ФДГ из дрожжей Candida boidinii (CboФДГ). Этот фермент используется в промышленном процессе получения L-tert-лейцина, который вплоть до настоящего времени является самым крупномасштабным процессом хирального синтеза с помощью очищенных ферментов [1]. Профессором М.-Р. Кулой и соавт. [2] был разработан метод двухстадийной очистки CboФДГ в двухфазных системах на основе вода–полиэтиленгликоль–соль. На первом этапе фермент экстрагируется в верхнюю органическую фазу. После установления равновесия между фазами верхняя отделяется и создается новая система за счет добавления дополнительных количеств соли и воды. Фермент на второй стадии переходит в водную фазу и отделяется от органической. В нашей лаборатории была клонирована ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseФДГ). Были получены различные мутанты этого фермента и показано, что PseФДГ превосходит CboФДГ как по каталитической активности, так и по стабильности [3]. Также была показана возможность проведения очистки PseФДГ в двухфазных системах. Целью данной работы является многопараметрическая оптимизация состава двухфазных систем для достижения максимальной степени очистки и высокого выхода рекомбинантной PseФДГ. Особенностью нашего процесса является введение стадии термообработки суспензии разрушенных клеток перед созданием первой системы. Показано, что стадия термообработки увеличивает чистоту препарата и положительно влияет на эффективность распределения компонентов бесклеточного экстракта в двухфазных системах. Также проведены оптимизации состава (концентрации компонентов и рН среды) первой и второй систем. В результате после использования такой системы был получен препарат ФДГ 80% чистоты (очистка более чем в два раза) с выходом 80%. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 16-34-01320 мол_а).