ИСТИНА

Неорганические пирофосфатазы (РРазы) – это ферменты, которые катализируют гидролиз пирофосфата с образованием фосфат-ионов. Пирофосфат образуется в клетках в реакциях биосинтеза важнейших клеточных метаболитов, например, нуклеиновых кислот, аминоацил-тРНК, нуклеозиддифосфатсахаров и т.п., его гидролиз необходим для всех ключевых биологических процессов. В некоторых эукариотах РРазы, работающие в различных клеточных компартментах, являются различными белками и кодируются различными ядерными генами. Так, например, у человека и пекарских дрожжей S. cerevisiae ранее было показано, что продукт гена рра1 – цитоплазматическая РРаза, а продукт гена рра2 – митохондриальная РРаза (митРРаза). Также было показано, что митРРаза играет ключевую роль в работе митохондрий и аэробном метаболизме: делеция гена рра2 приводит к серьезным дисфункциям митохондрий и невозможности аэробного метаболизма и гибели клеток [1, 2], а некоторые природные мутации в этом гене вызывают летальные патологии у человека [2]. Это показывает, что митРРаза играет ключевую роль в работе митохондрий. Какую именно роль и как именно митРРаза вовлечена в аэробное дыхание и/или метаболизм, пока не выяснено. Отдельным вопросом является роль патогенных мутаций в работе митРРазы. Каким образом природные мутации в гене рра2 нарушают структуру и функцию митРРазы, пока не выяснено, поскольку практически все аминокислотные остатки, замена которых патогенна для человека, расположены вне активного центра и не имеют очевидной связи с функциональными центрами фермента. Следует подчеркнуть, что пространственная структура митРРазы пока не решена ни для одного организма. Настоящая работа направлена на выяснение молекулярных основ этих явлений. Биоинформатический анализ позволил найти организмы, в которых имеются гены двух вариантов РРазы, сходных с цитоплазматической и митохондриальной формами РРаз человека и пекарских дрожжей. Выравнивание последовательностей этих белков позволило выявить особенности, характерные для этих двух видов РРаз. Гомологичным моделированием были получены пространственные структуры митРРаз человека Гомологичным моделированием были получены пространственные структуры митохондриальных РРаз черовека ферментов Объектами работы являются митРРазы человека и дрожжей Ogataea parapolymorpha (Ор-РРА2). и их патогенных мутантных вариантов. Исследована регуляция каталитической активности Ор-РРА2 под действием митохондриальных метаболитов; обнаружено активирующее влияние АТР и NADH, а также ингибирующее влияние некоторых метаболитов на Ор-РРА2. Молекулярный докинг эффекторов в пространственную структуру Ор-РРА2 позволил предположить возможную взаимосвязь между регуляцией активности и олигомерным равновесием Ор-РРА2. Показано, что диссоциация димера Ор-РРА2 на мономеры сопровождается значительным снижением каталитической активности. Сравнительный анализ результатов симуляции молекулярной динамики мономерной и димерной форм Ор-РРА2 позволяет высказать предположение, что более низкая активность мономера может быть связана с неоптимальной конфигурацией активирующих ионов магния при образовании каталитически компетентного фермент-субстратного комплекса. Для выяснения возможных причин снижения функциональности патогенных мутантных вариантов митРРазы была проведена симуляция молекулярной динамики на структурах митРРазы человека и ее патогенных мутантных вариантов S61F, M94V, M106I, E172K, Q294P. Для мутантного варианта M94V результаты такого анализа позволяют предсказать значительное снижение сродства к активаторным ионам магния. Были охарактеризованы мутантные варианты Ор-РРА2 с заменами, гомологичными патогенным мутантным вариантам митРРазы человека. Вариант с заменой M52V, гомологичной M94V человека, в подтверждение теоретического анализа, характеризуется значительным снижением сродства к активаторным ионам магния и, как следствие, низкой каталитической активностью в физиологических условиях.