ИСТИНА

Люциферазные системы широко применяются для анализа экспрессии генетических конструкций. Принцип работы люцифераз основан на хемилюминесценции, возникающей при ферментативном окислении люциферинов. Они обеспечивают высокое соотношение сигнал/шум, позволяют анализировать быструю динамику появления продукта и более эффективны in vivo по сравнению с флуоресцентными репортерами. Использование двух люцифераз с разными спектрами (например, классическая двулюциферазная система на основе ферментов светлячка и Renilla) позволяет отслеживать параллельно идущие процессы. Однако люцифераза Renilla использует непроникающий и довольно токсичный субстрат целентеразин, что ограничивает её использование в прижизненных измерениях. Цель данной работы — создание двулюциферазной системы для прижизненного отслеживания динамики экспрессии репортеров в культурах клеток и in vivo. Выбраны люциферазы P. plagiophthalamus (обладающая люминесценцией в зеленом диапазоне) и L. curciata (с пиком люминесценции в красной области), использующие одинаковый проникающий субстрат. На их базе разработаны конструкция для мониторинга стрессового ответа, сенсор стресса эндоплазматического ретикулума на основе цитоплазматически сплайсируемой мРНК XBP1, а также конструкция на основе регуляторных элементов гена ATF4, реагирующая на широкий круг клеточных стрессов. Пилотные эксперименты in vivo подтвердили возможность прижизненной раздельной детекции двух люцифераз в мышах. Разработанная система позволяет одновременно анализировать стрессовый ответ и экспрессию репортерных мРНК с разными механизмами инициации трансляции в реальном времени, а также прогнозировать распределение терапевтических мРНК (например, доставленных липидными наночастицами) в живом организме. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, грант 23-14-00218.