ИСТИНА

Методы гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, позволяющие достичь низкого значения предела обнаружения, являются необходимым инструментом генетических исследований различных заболеваний. С этой целью нами впервые был разработан гомогенный гибридизационный метод определения нуклеиновых кислот, основанный на аллостерической активации пероксидаза-подобного ДНКзима (ППДНКзим). Мы показали, что каталитическая активность зонда, состоящего из ППДНКзима, нековалентного комплекса гемина с аптамером к гемину EAD2 (5’-ctg-gga-ggg-agg-gag-gga-3’), который был ассоциирован с олигонуклетидами, комплементарными ДНК ВИЧ, в присутствии олигонуклеотида ДНК ВИЧ (5’-aga-aga-tat-ttg-gaa-taa-cat-gac-ctg-gat-gca-3’) увеличивалась. Данное усиление каталитической активности было исследовано для зондов с тремя различными ассоциированными последовательностями. Для измерения активности ППДНКзима был использован хемилюминесцентный метод. Обнаружено, что активности зондов в отсутствие ДНК ВИЧ различны и зависят от значения энергии внутримолекулярного взаимодействия EAD2 и ассоциированных с ним олигонуклеотидов. Отмечено, что с увеличением значения энергии внутримолекулярного взаимодействия активность зондов снижалась. С использованием данной индикаторной реакции были получены калибровочные кривые определения ДНК ВИЧ в оптимизированных условиях. Предел обнаружения и линейный диапазон для зонда 1 составили 1 нМ и 1-10 нМ, соответственно. Для зондов 2/ 3 предел обнаружения и линейный диапазон составили 0,5/0,3 нМ и 0,5-30 нМ/0,3-15 нМ, соответственно. Разработанный анализа обладал высокой чувствительностью (95 000- 200 000 у.е./нМ). Следует также отметить высокую точность представленного анализа, коэффициент вариации в точках линейного диапазона меняется от 0,3 до 4.0 %. Проведено сравнение кросс-реактивности ДНК-аналита, ДНК-аналита с одним и двумя измененными основаниями, а также некомплементарной последовательности. Показано, что замена одного основания в последовательности ДНК-аналита не повлияла на эффективность взаимодействия с зондом. В то же время, кросс-реактивность зондов с заменой двух оснований и некомплементарной последовательностью составила 5 и 4%, соответственно. Данный результат показывает высокую специфичность разработанного анализа ДНК. Принцип данного метода также был использован для анализа микроРНК (uug-gug-ugg-aga-aau-aga-aga). Использовав зонд со следующей последовательностью-(tct-tct-att-tct-cca-cac-caa-ctg-gga-ggg-agg-gag-gga), мы разработали анализ, предел обнаружения, линейный диапазон и чувствительность которого составили 0,6 нМ, 0,6-30 нМ и 442 000 у.е./нМ, соответственно. Таким образом, нами был разработан гомогенный хемилюминесцентный анализ нуклеиновых кислот, основанный на аллостерической активации ППДНКзим-содержащего зонда. Данный метод простой, быстрый, изотермический, чувствительный, экономичный, а также характеризуется высокой специфичностью. Мы благодарим Российский Научный Фонд за финансовую поддержку (17-14-01042).