ИСТИНА

Введение. Установление аминокислотной последовательности биологически активных пептидов нужно для определения структуры, понимания механизма действия и разработки возможных аналогов природных пептидов для различных областей биологии и медицины, и потому является очень актуальной задачей. Золотым стандартом для этого многие годы является деградация по Эдману, но бурное развитие масс-спектрометрии в последние годы позволило создать ему альтернативу. Однако стандартные масс-спектрометрические методы не могут различить изобарные аминокислоты лейцин и изолейцин. Цель исследования – создание нового метода для масс-спектрометрического различения лейцина и изолейцина с помощью вторичной фрагментации пептидов методом EThcD. Материалы и методы: Триптические пептиды человеческого альбумина и бактериального белка gp188, пептиды кожного секрета лягушки Rana ridibunda и три синтетических пептида вводили прямым вводом для анализа в масс-спектрометр Orbitrap Elite (Thermo Scientific) с источником ионизации электрораспылением (ESI). Результаты. На первом этапе были оптимизированы параметры напуска ионов и энергии фрагментации в режиме MS3 ETD-HCD с максимально возможной шириной изоляции ионов (600 Да) для триптических и синтетических пептидов. За основу мы взяли метод, разработанный нашей группой 1. Полученный ETD-HCD метод с «широкополосной» активацией позволил надежно установить структуру 83 из 93 остатков лейцина/изолейцина 2. Затем мы модифицировали прошивку прибора для включения MS2-режима EThcD (HCD-фрагментация всех ионов MS2-ETD-спектра пептидов без их изоляции), что значительно ускорило набор данных (1 спектр EThcD вместо 4-7 ETD-HCD). Кроме того улучшилось качество спектров и мы смогли улучшить идентификацию лейцинов/изолейцинов проблемных пептидов предыдущего этапа (с 12 из 22 остатков до 17 из 22 новым методом). После этого мы применили разработанный метод к неразделенной смеси пептидов кожного секрета лягушки Rana ridibunda. Были получены EThcD спектры 15 пептидов, надежно идентифицировано 60 из 66 остатков лейцина/изолейцина. Также мы отслеживали возможность радикальной миграции в случае соседних лейцинов/изолейцинов в аминокислотной последовательности. Показано, что новый метод при правильном подборе энергии активации HCD можно добиться отсутствия радикальной миграции и наличия в масс-спектрах только нужных w-ионов для всех исследованных классов пептидов. Предполагается дальнейшая стыковка метода с жидкостной хроматографией.