ИСТИНА

Малые белки теплового шока человека (sHsp) – представители распространенного семейства белков, участвующих в поддержании гомеостаза в нормальных и стрессовых условиях. Они вовлечены в регуляцию разнообразных процессов в клетке, например, апоптоза, пролиферации, сворачивания и деградации белков, препятствуют агрегации денатурированных белков. Мутации этих белков зачастую коррелируют с развитием онкологических и нейродегенеративных заболеваний человека. Использование “химер”, состоящих из исследуемого и флуоресцентного белка (FP) позволяет анализировать внутриклеточную локализацию и функционирование белков в живой клетке. Однако такой популярный подход возможен только в случае, если FP не влияет на свойства исследуемого белка. Целью данной работы была разработка метода получения и изучение некоторых свойств “химер”, состоящих из малых белков теплового шока человека HSPB1, HSPB5, HSPB6 и HSPB8 и цианового или желтого флуоресцентных белков. Рекомбинантные химерные белки экспрессировали в клетках E.coli штамма BL21. В ходе работы подобраны составы сред, температура и время культивирования, обеспечивающие высокие уровни экспрессии “химер”. Разработан метод выделения, состоящий из фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, позволяющий получать гомогенные препараты химерных белков с выходом, достигающим 40-60 мг из 1 л среды культивирования. Получены очищенные препараты 8 химерных белков. Методом гель-фильтрации исследовано олигомерное состояние полученных белков. Установлено, что “химеры” FP-HSPB1 и FP-HSPB5 образуют олигомеры меньшего размера, чем немодифицированные HSPB1 и HSPB5. В то же время размеры олигомерных комплексов, формируемых “химерами” FP-HSPB6 и FP-HSPB8 не отличаются от размеров олигомерных комплексов, образуемых белками дикого типа. Таким образом, включение флуоресцентного белка в состав “химер” может оказывать существенное влияние на свойства sHsp. В этой связи требуются дополнительные исследования для установления приемлемости указанных “химер” для изучения sHsp в живой клетке.