|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Применение метода анализа полиморфизма конформации одноцепочечного ПЦР фрагмента для диагностики наследственных заболеваний. дипломная работа (Специалист)
- Научный руководитель: Стамбольский Д.В.
- Автор: Порошина Анна Анатольевна
- Тип: Специалист
- Год защиты: 2005
- Аннотация: 1. SSCP анализ является методом выбора для скрининга ДНК фрагментов в молекулярной диагностике и изучении наследственной патологии большого количества мультифакторных заболеваний, поскольку он основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности конформеров однонитевых ДНК, различающихся вследствие изменений нуклеотидной последовательности по конформации молекул, а эта конформация обычно отличается даже если изменено только одно основание. При этом изменение конформации фрагмента достаточно для того, чтобы даже при сохранении заряда и размера молекулы изменялась его электрофоретическая подвижность. 2. Оптимальная длина однонитевого фрагмента ~150-300 нуклеотидов. В этом диапазоне размеров при SSCP анализе отчетливо видно 70-90 % замен отдельных оснований. Возможно, при больших длинах цепочки сложнее зарегистрировать конформационные изменения вследствие замен отдельных оснований, и более короткие цепочки в первую очередь принимают меньшее количество конформаций. При длине фрагмента ПЦР более 500 п.о. применяют предварительную рестрикцию. 3. Целесообразно использовать несколько условий проведения SSCP, таких, как две температуры или более низкую температуру в присутствии денатуранта. Некоторые мутации обнаруживаются только в очень узких температурных рамках, следовательно одна температура не достаточна для обнаружения всех различных мутаций. Целесообразно использовать комбинацию двух температур для гель-электрофореза: 4C и 20C. Дальнейшее увеличение числа условий электрофореза не дало бы существенного преимущества, принимая во внимание большой обьём работы при небольшом увеличении эффективности. 4. Наиболее предпочтительные характеристики геля для успешного дифференциального разделения конформеров однонитевой ДНК в диапазоне 150-300 пар оснований, являются 12 % акриламида и коэффициент перекрестного сшивания (%C) между 1 и 3 , т.е. Т=12, С=1-3. Для уменьшения числа поперечных связей широко используется соотношение бисакриламид:акриламид 1:49. Четкие изменения подвижности (например, 10 %) видны коротком геле (10 см x 7.3 см x 0.075 см), но для определения 0.5 % разности в подвижности необходим длинный электрофорез на геле размером 30 см x 40 см x 0.04 см. 5. При оптимизации SSCP анализа следует использовать различные добавки к акриламидным гелям. Для уменьшения числа поперечных связей целесообразно добавлять 50-100 мл/л глицерина. Включение PEG к акриламидным гелям даёт возможность разделять однонитевые конформеры значительно быстрее (1-3 ч), чем обычными SSCP методами, и расширяет применимость SSCP анализа от 150 до 500 пар оснований ДНК в зависимости от различного процентного содержания GC (предпочтительно % содержание GC50%). Это происходит благодаря изменению архитектуры геля (увеличение вязкости геля способствует разделению длинных конформеров, поэтому добавление PEG расширяет диапазон ПЦР ампликонов) и его электропроводности (следовательно, повышается скорость электрофореза). 6. Предпочтение среди методов детекции фрагментов однонитевой ДНК после SSCP анализа отдаётся методу окраски ДНК в геле с помощью флуоресцентных красителей, поскольку радиоавтография связана с опасностью и неудобством использования радиоизотопов, кроме того по длительности занимает сутки; бромистый этидий взаимодействует с двухцепочечной ДНК с более высокой афинностью, чем с одноцепочечной, и поэтому не подходит для обнаружения одноцепочечных изменений; окрашивание серебром занимает 3-5 часов, а флуоресцентный метод - всего 30 минут.
- Добавил в систему: Стамбольский Дмитрий Викторович