|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Поиск функции гипотетической метилтрансферазы мыши Kiaa1456дипломная работа (Специалист)
- Научный руководитель: Головина А.Я.
- Автор: Лаптев И.Г.
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет
- Год защиты: 2015
- Аннотация: Существует более 100 видов посттраскрипционных модификаций РНК. Некоторые из них играют регуляторную роль, в том числе, и в матричных РНК. Понимание механизмов модификации РНК в клетках высших эукариот может приблизить нас к пониманию регуляции экспрессии их генов. Однако изученных модификаций немного, также малоизвестны и белки, осуществляющие их. Среди таких белков можно выделить гипотетическую метилтрансферазу Kiaa1456 из M. musculus. Целями данной работы являются подтверждение существования гипотетической метилтрансферазы Kiaa1456 в клетках мыши, а также создание всех необходимых генно-инженерных конструкций, позволяющих определить его функцию. Ранее в нашей лаборатории создана линия мышиных клеток NIH3T3, в которой инактивирован ген kiaa1456. Методом двумерного электрофореза было выяснено, что белковый состав дикого типа и нокаута сильно различается. Было создано 3 конструкции для экспрессии гена Kiaa1456 в прокариотической системе, из них была выбрана наилучшая, с помощью которой было выделено достаточное количество белка для получения поликлональных антител. Специфичность антител была проверена методами вестерн-блоттинга на экстрактах из мышиных клеточных линий дикого типа и Δkiaa1456, а методом иммуногистохимии была определена локализация белка. Установлено, что белок делокализован в клетке Также были получены несколько векторов с регулируемой экспрессией белка для создания лентивирусов. С помощью них было создано два типа лентивирусов, содержащих ген фьюжн-белка Kiaa1456 c GFP, а также ген белка Kiaa1456 без довесков, экспрессия которых является регулируемой. Ими были инфицированы клетки нокаутной линии. Из инфицированных клеток были получены необходимые моноклоны, для создания клеточных линий с регулируемой экспрессией белка. Также, с помощью линии, содержащей фьюжн-белок, удалось подтвердить делокализацию Kiaa1456. Таким образом, в ходе данной работы было установлено, что белок Kiaa1456 действительно присутствует в клетках мыши, была установлена его локализация двумя независимыми способами, были получены антитела, специфичные к белку, были оптимизированы условия выделения рекомбинантного белка. Кроме того, проведен первый анализ фенотипа нокаутной линии и установлено, что, по всей видимости, белок влияет на механизм образования цитоскелета. Эти данные позволяют с уверенностью заключить, что в работе созданы все возможные инструменты для определении функции Kiaa1456.
- Добавил в систему: Головина Анна Янковна