ИСТИНА

Особенное внимание к рибосом-инактивирующим белкам II класса (РИБII) связано с высокой цитотоксической активностью данных белков по отношению к эукариотическим клеткам и возможностью их использования для элиминации определенных клеточных популяций, например опухолевых. По своему строению РИБII представляют димерные А-В токсины, где А-субъединица является каталитической, а В-субъединица - связывающей. В-субъединица токсинов связывается с поверхностью любой клетки. Замена В-субъединицы на другую молекулу, способную избирательно реагировать с определенными типами клеток, в ряде случаев позволяет получить высокоэффективный цитотоксический препарат направленного действия – иммунотоксин (ИТ). Однако эффективность таких конъюгатов снижена по сравнению с нативными токсинами. Это объясняется тем, что В-субъединица участвует не только в процессе связывания токсина с клеточным рецептором, но и играет роль во внутриклеточном транспорте токсина и, возможно, в процессе выхода токсина в цитозоль клетки. В иммунотоксинах В-цепь заменяется векторной молекулой, которая, как правило, не способна направлять ИТ по наиболее эффективному внутриклеточному пути и обеспечить максимально эффективную транслокацию. Низкая активность ИТ ограничивает их применение в качестве клинических препаратов.. Поэтому для создания высокоэффективных ИТ актуальной задачей является изучение механизмов действия и особенностей внутриклеточного транспорта нативных токсинов. Например, ощутимый прогресс в усилении терапевтического потенциала ИТ наблюдался с открытием сигнальных мотивов в белке- пептидных последовательностей, определяющих локализацию белка в тот или иной компартмент клетки. Рекомбинантные ИТ с последовательностью REDKL, направляющая белки в ЭР, отличалась большей цитотоксичностью по сравнению с ИТ без данной последовательности [Brinkman et al., 1994]. Сами токсины представляют собой удобный объект для изучения внутриклеточного транспорта белков. Белки из семейства РИБII задействованы в самых разных процессах транспорта: связывание с клеточными рецепторами, рецептор-опосредованном эндоцитозе, прохождение через эндосомальные компартменты, транспорте белков внутри аппарата Гольджи, в ретроградном переносе из аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум и, наконец, в процессе трансмембранного переноса. В ходе своего внутриклеточного транспорта токсины связываются со многими клеточными структурами, обеспечивающие механизм внутриклеточного движения белков и поэтому могут служить зондами для доставки белков и пептидов в определенный клеточный компартмент [Stenmark et al., 1991]. Например, возможна доставка малых пептидов к молекулам МНС I класса для антигенной презентации на поверхности. Изучаемый в работе вискумин из омелы белой, является одним из наименее изученных среди известных токсинов семейства РИБII. Однако, дальнейшее изучение данного белка представляется перспективным благодаря ряду свойств вискумина. Например, было показано, что ИТ на основе каталитической субъединицы вискумина более активны, чем ИТ на основе А-субъединицы рицина [Tonevitsky et al.,1996]. Кроме того, экстракты омелы белой обладают иммуномодуляторной, апоптотической и антимутагенной активностью, благодаря чему широко используются в течение ряда лет в качестве противоопухолевых препаратов в странах Европы [Bussing et al., 1997a]. Целью данной работы было исследование отдельных этапов внутриклеточного транспорта вискумина с помощью модельных систем - гибридом. Кроме того, целью работы изучение влияния векторной и цитотоксической части на эффективность действия иммунотоксинов, направленных к меланомо-ассоциированному антигену - HMW-MAA, .Для достижения цели были поставлены конкретные задачи: 1. Получение гибридом, продуцирующих монАт против нативной и денатурированной формы А-субъединицы вискумина. Изучение специфичности, аффинности полученных монАт. 2. Изучение устойчивости данных гибридом к цитотоксическому действию вискумина и рицина. 3. Получение иммунотоксинов, на основе антител 225.28 и 763.74 и каталитических субъединиц рицина и вискумина. Изучение свойств полученных ИТ