ИСТИНА

Целью проекта является получение ответа на вопрос между какими белками, локализованными в полисахаридном матриксе клеточной стенки в процессе роста дрожжей в норме и при формировании ответа их клеток на стресс, происходит прямое взаимодействие, приводящее к формированию кластеров молекул с различной функциональной активностью, выявление среди них кластеров, содержащих в своем составе прочно закрепленные конститутивные белки (GPI-белки, ASL-белки, глюкантрансфераза Bgl2p) и нерезидентные (транзитные) белки КС, а также белки, ассоциированные с липидами. Результаты, полученные при выполнении данного проекта, позволят описать новый тип молекулярной организации полимеров в ансамбле клеточной стенки дрожжей – белковые микрокомпартменты. Проект предполагает разработку и применение методического подхода, позволяющего не только получить фундаментальные научные результаты, но и предоставляющего исследователям возможность и в дальнейшем, применяя его, изучать роль белков в формировании и функционировании КС дрожжей. Научные результаты, полученные в процессе выполнения проекта, явятся первым масштабным исследованием белковых микрокомпартментов КС дрожжей.

The aim of the project is to obtain an answer to the question which proteins in direct interaction are localized in the polysaccharide matrix of the cell wall (CW) during the growth of yeast in in normal conditions and during the formation of the response of their cells to stress, that leads to the formation of molecule clusters with different functional activity, the detection of clusters, containing in their composition firmly anchored constitutive proteins (GPI-proteins, ASL-proteins, Bgl2p glucan transferase) and non-resident (transitional) CW proteins, as well as proteins associated with lipids. The results obtained during the implementation of this project will allow describing a new type of molecular organization of polymers in the ensemble of yeast the cell wall - protein microcompartments. The project involves the development and application of a methodical approach that allows not only to obtain fundamental scientific results, but also provides an opportunity for researchers to use it to study the role of proteins in the formation and functioning of the yeast CW. The scientific results obtained during the project implementation will be the first large-scale research of protein microcompartments of the yeast CW.

1. Будут получены очищенные от компонентов внутриклеточного содержимого и плазматической мембраны препараты КС из клеток дрожжей S.cerevisiae родительского штамма, выращенных до ранней стационарной стадии роста и стадий начала и середины логарифмического роста. 2. Будут получены экстракты из препаратов КС до и после обработки сшивающими агентами: - только нековалентно связанных с полисахаридами КС индивидуальных белков и белковых комплексов, полученные более мягкой (Трис) и более жёсткой (гуанидингидрохлорид) обработками, - связанных с полисахаридами КС индивидуальных белков и белковых комплексов (с максимальной представленностью микрокомпартментов нековалентно и ковалентно связанных белков КС), полученные обработкой глюканазой; - специфических индивидуальных белков и белковых комплексов, имеющих в своём составе хитин-связывающие белки, полученные обработкой хитиназой. 3. Из всех выше указанных экстрактов будут получены фракции белков, разделённых по физико-химическим свойствам (молекулярная масса, плавучая плотность), и идентифицированы индивидуальные белки (не входящие в комплексы) и белки, формирующие комплексы, с использованием LC-MS\MS-анализа. 4. Будут выявлены белки, содержащие липидные модификациями (в первую очередь пальмитоилирование по остаткам цистеина), ассоциированные с липидами; по данным конфокальной флуоресцентной микроскопии будут получены результаты по колокализация белков в виде микрофотографий, по которым можно оценить распределение белков и липидов в матриксе КС. Анализ полученных результатов позволит получить приоритетные результаты, характеризующие состав и динамику формирования белковых микрокомпартментов клеточной стенки дрожжей в нормальных условиях роста культуры. Данный этап необходим для успешного продолжения работы по проекту, в процессе его выполнения планируется получение и опубликование результатов по идентификации белков, входящих в комплексы формирующиеся в КС.

Наиболее значимым результатом работы последних лет явилось обнаружение нами среди соединений, входящих в состав липид-ассоциированной фракции клеточной стенки, белков, ранее считавшихся внутриклеточными и мембранными, а недавно выявленными за пределами клетки в составе транспортных везикул, экспортирующих метаболически-активные соединения из клетки через клеточную стенку дрожжей Candida albicans во внешнюю среду (Vargas et al., 2015). На данном этапе обнаружено более 10 белков и работа по выявлению новых будет продолжена. Так, например, нами обнаружен белок теплового шока Hsp12 (Р22943). В наших экспериментах он был выявлен в клеточных стенках на ранних и поздних стадиях роста культуры. Ранее он считался белком плазматической мембраны. Показано, что он играет важную роль в ответе клетки на стресс. Также в липид-ассоциированной фракции клеточных стенок нами был обнаружен белок Avo1 и некоторые другие компоненты TORC2 комплекса (весьма важный для правильного осуществления процессов роста и деления клетки комплекс). Ранее считалось, что местом его локализации является только плазматическая мембрана, и в клеточной стенке белки этого комплекса не обнаруживались. В наших экспериментах не выявлено постоянного присутствия белков данного комплекса в клеточной стенке на какой-либо из стадий роста. Наличие компонентов TORC2 – комплекса во фракции липид-ассоциированных компонентов клеточной стенки дрожжей на разных стадиях роста культуры устанавливается. В период, предшествующий написанию гранта, нами были проведены предварительные эксперименты с использованием перечисленных методик, результатами которых явилось обнаружение актина Act1p и предварительные данные о его колокализации с глюкантрансферазой Bgl2p.

В процессе выполнения проекта было показано, что в КС дрожжей присутствуют GPI-модифицируемые белки, несвязанные ковалентно с высокомолекулярными полисахаридами, формирующими структурный каркас КС. Они могут быть экстрагированы из КС в воду при нагревании после удаления фракции липидов. О наличии этих белков, присутствующих в КС, но в форме молекул ковалентно связанных с высокомолекулярными полисахаридами остатком GPI-якоря, лишенным липидного компонента, известно давно. Следует отметить, что нековалентно связанные с высокомолекулярными полисахаридами GPI-модифицируемые белки выявлены не только в КС родительского штамма, но и в КС дрожжей, лишенных белка Bgl2. Данный факт свидетельствует о том, что путь встраивания обнаруженного пула белков не зависит от функционирования глюканозилтрансгликозилазы Bgl2, как это было показано ранее для ковалентно закреплённых на высокомолекулярных полисахаридах GPI-белков КС (Плотникова с соавт., 2006). В свою очередь, обнаруженное в данной работе отсутствие отличий в содержании функционально значимых GPI-белков в КС дрожжей, лишенных Bgl2, и дрожжей дикого типа хорошо согласуется с отсутствием значимых отличий в скорости роста при нормальных условиях культивирования клеток этих двух штаммов, что описано во многих работах. Ещё более интересным фактом явилось привутствие в этой фракции ASL-белков, которые по данным литературы не содержат в составе молекул липидированных частей. Вероятно, липид-ассоциированная фракция является промежуточной формой в процессинге этих белков, а Bgl2p скорее всего принимает участие в их процессинге как белок, являющийся основным участником белковых микрокомпартментов КС. Свидетельства об участии Bgl2p во встраивании в КС GPI-белков были получены ранее (Kalebina et al., 2002; Plotnikova et al., 2006). Интересно, что все компоненты выявленных микрокомпартментов не были ковалентно закреплены в КС. Это можно объяснить тем, что в основном нековалентно закреплённые белки вовлечены в динамические перестройки КС в процессе жизнедеятельности клетки. Помимо непосредственно обнаружения микрокомпартментов в КС впервые была показана их локализация в составе КС. Микрокомпартменты, основным участником которых является Bgl2p, были визуализированы в виде мозаично расположенных зон с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии с окрашиванием антителами. Аналогичным образом были визуализированы микрокомпартменты Gas1, как часть липид-ассоциированных микрокомпартментов. Различно охарактеризованные зоны, окрашиваемые антителами к Bgl2p, на поверхности КС были отнесены к различным фракциям Bgl2p из КС: равномерно и слабо окрашиваемые зоны между ярко окрашенными пятнышками соответствовали Трисовой фракции, а непосредственно пятнышки – гуанидингидрохлоридной фракции. Микрокомпартменты Bgl2p, визуализуемые в виде пятнышек, были обнаружены в КС дрожжей на средах культирования с принципиально различающимся составом. В стрессовых условиях при культивировании дрожжей в среде с концентрацией спирта 10% и выше микрокомпартменты Bgl2p в КС подвергались реорганизации. В результате Bgl2p выходил из КС в среду культивирования и располагался вокруг клеток.