ИСТИНА

Создание экспериментальной модели для 3D-роста мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и создание гибридных 3D-конструкций из клеток и биоматериалов имеет ключевое значение для тканевой инженерии и проблемы реконструкции органов и тканей. В настоящее время рост, жизнедеятельность и дифференцировку МСК до сих пор исследуют в стандартных условиях in vitro – при культивировании клеток на плоской поверхности культуральных пластиковых планшетов, флаконов и чашек Петри. При этом добавление ростовых факторов и фармакологических агентов, регулирующих рост и дифференцировку МСК проводится обычно также путем простого добавления этих веществ в культуральную среду. Однако рост и дифференцировка МСК в условиях in vivo идет в объеме 3D-структуры со сложной микроархитектурой и под постоянным управлением ростовых факторов, выделяющихся в необходимых концентрациях [1]. В связи с этим возникает потребность в создании новых конструкций для наиболее полного экспериментального моделирования трехмерного роста МСК. Использование биополимерных пористых матриксов служит хорошим примером подобных конструкций, служащих для создания модели 3D-роста МСК. Однако, большой проблемой этой методики является прорастание клеток в объем такого матрикса и обеспечение равномерного 3D-роста. Это связано с неравномерным проникновением питательных веществ и кислорода по объему матрикса и морфологическими препятствиями для проникновения клеток в те или иные участки матрикса. Кроме того, довольно затруднительно обеспечить в объеме пористого матрикса равномерное распределение ростовых факторов и фармакологических агентов и, тем более, обеспечить, например, градиент концентрации для таких веществ, что является хорошим инструментом для исследования роста и дифференцировки МСК [2]. Поэтому альтернативный способ создания экспериментальной модели 3D-роста МСК является использование биополимерных микросфер в качестве субстрата для прикрепления и роста клеток. Использование микросфер из биоразлагаемых и биосовместимых полимеров позволяет решить многие описанные выше проблемы культивирования МСК на биополимерных матриксах. Возможности предварительного культивирования МСК на микросферах и "сборки" матрикса уже из микросфер с прикрепленными на них клетками позволяет значительно снизить риск неравномерного роста клеток в объеме матрикса; возможность в широких пределах регулировать проницаемость порами такой конструкции обеспечивает необходимую диффузию питательных веществ и кислорода в объеме матрикса. Можно также использовать биополимерные микросферы как спейсеры, регулирующие трехмерный объемный рост культуры МСК, наличие таких спейсеров, например, моделирует рост хрящевой ткани. Кроме того, различные технологии инкапсулирования позволяют нагружать микросферы как белковыми макромолекулами (например, ростовыми факторами), так и низкомолекулярными фармакологическими веществами, что обеспечивает последующее их пролонгированное высвобождение из микросфер. Пролонгированное высвобождение биологически активных веществ с заданной кинетикой может быть гораздо более точной экспериментальной моделью воздействия этих веществ в процессе роста и дифференцировки МКС, чем болюсное добавление этих агентов. Кроме того, можно создавать микросферы с различным содержанием биоактивных веществ и с различной кинетикой их высвобождения, что позволит при их комбинации довольно точно и направленно регулировать их воздействие на клетки в объеме матрикса и при необходимости создавать градиент концентрации этих веществ. Более того, т.к. микросферы будут изготовлены из биоразлагаемого и биосовместимого полимера с заданными характеристиками, то можно будет использовать полученную конструкцию из микросфер в экспериментах in vivo для исследования роста и дифференцировки Таким образом, создание экспериментальной модели 3D-роста МСК с использованием биополимерных микросфер позволит не только провести комплексное исследование трехмерного роста и дифференцировки МСК in vitro, но и подтвердить эффективность разработанного подхода в экспериментах in vivo при имплантации полученной гибридной структуры для замещения дефекта костной или хрящевой ткани. Это позволит в перспективе создавать медицинские изделия принципиально нового уровня для регенеративной терапии в челюстно-лицевой хирургии. Список литературы: 1. Murray I.R., West C.C., Hardy W.R., James A.W., Park T.S., Nguyen A., Tawonsawatruk T., Lazzari L., Soo C., Peault B. Natural history of mesenchymal stem cells, from vessel walls to culture vessels. Cell Mol. Life Sci., 2014, 71(8), 1353-1374. 2. Sands R.W., Mooney D.J. Polymers to direct cell fate by controlling the microenvironment. Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18(5), 448-453. Solorio L.D., Vieregge E.L., Dhami C.D., Alsberg E. High-density cell systems incorporating polymer microspheres as microenvironmental regulators in engineered cartilage tissues. Tissue Eng. Part B Rev., 2013, 19(3), 209-220.

Development of an experimental model of 3D-growth of mesenchymal stem cells on the basis of a hybrid structure of biopolymer microspheres and stem cells

микросфер на основе биоразлагаемых и биосовместимых полимеров в качестве субстрата для прикрепления и роста клеток требует разработки и использования целого ряда новых методов и подходов: получение полимерных биоматериалов со свойствами биодеградации и биосовместимости, разработка методов получения микросфер с различной морфологией и микроструктурой, предназначенных для роста на них клеток, разработка новых методов культивирования МСК на биополимерных микросферах, разработка новых методов изготовления 3D-матриксов на биополимерных основе микросфер, разработка новых методов загрузки биополимерных микросфер низкомолекулярными фармакологическими веществами для их последующего пролонгированного высвобождения с заданной кинетикой, разработка новых методов инкапсулирования в биополимерные микросферы и 3D-матриксы на их основе белковых факторов роста для их последующего пролонгированного высвобождения с заданной кинетикой, создание математической модели 3D-роста МСК.

1. Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Boskhomdzhiev A.P., Zharkova I.I., Bagrov D.V., Myshkina V.L., Mahina T.K., Charitonova E.P., Samsonova O.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Efremov Yu.M., Voinova V.V., Bonartseva G.A., Shaitan K.V. The Terpolymer Produced by Azotobacter Chroococcum 7B: Effect of Surface Properties on Cell Attachment. PLoS ONE, 2013, 8(2): e57200. 2. Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Zharkova I.I., Boskhomdzhiev A.P., Bagrov D.V., Myshkina V.L., Makhina T.K., Kharitonova E.P., Samsonova O.V., Voinova V.V., Zernov A.L., Efremov Yu.M., Bonartseva G.A., Shaitan K.V. Cell attachment on poly(3-hydroxybutyrate)-poly(ethylene glycol) copolymer produced by Azotobacter chroococcum 7B. BMC Biochemistry, 2013, 14:12. 3. Myshkina V.L., Nikolaeva D.A., Makhina T.K., Bonartsev A.P., Bonartseva G.A. Effect of growth conditions on the molecular weight of poly-3-hydroxybutyrate produced by Azotobacter chroococcum 7B. Applied biochemistry and microbiology, 2008, Vol. 44, No. 5, p. 482-486;

Была разработана гибридная конструкция из биополимерных микросфер и мезенхимальных стволовых клеток (МСК), с использованием которой была создана новая экспериментальная модель 3D-роста МСК. С этой целью в ходе Проекта были разработаны ряд методик: биотехнологическая методика контролируемого биосинтеза поли-3-оксиалканоатов (ПОА), в частности, сополимера поли-3-оксибутирата с 3-оксивалератом с заданными характеристиками, послуживших материалом для изготовления пористых микросфер, методика получения биополимерных микросфер с заданной микроструктурой и физико-химическими свойствами для роста на них МСК; методика загрузки биополимерных микросфер низкомолекулярными фармакологическими веществами (дексаметазоном и симвастатином); методика иммобилизации белкового фактора роста фибробластов человека-2 на биополимерных микросферах для их последующего пролонгированного высвобождения; методика получения 3D-конструкции из микросфер с необходимыми характеристиками для роста на них МСК; методика культивирования МСК на биополимерных микросферах различного диаметра и 3D-конструкции на их основе in vitro; экспериментальная модель дефекта костной ткани на лабораторных крысах in vivo; методика получения гибридной 3D-конструкции из биополимерных микросфер и МСК. Были получены биополимерные микросферы различного среднего диаметра. Исследование морфологии и физико-химических свойств полученных биополимерных микросфер и 3D-конструкции на их основе показало, что полученные микросферы обладают высокой пористостью со сквозной системой пор и относительно низкой жесткостью. На культурах клеток фибробластов 3Т3 и МСК показана высокая биосовместимость in vitro полученных биополимерных микросфер и 3D-конструкции на их основе. В модельных условиях in vitro и in vivo на лабораторных крысах показана относительно низкая скорость биодеградации биополимерных микросфер и 3D-конструкции на их основе, что позволяет использовать их для долговременного культивирования клеток. Продемонстрировано пролонгированное высвобождение низкомолекулярных фармакологических веществ и белкового фактора роста из полученных биополимерных микросфер и 3D-конструкции на их основе in vitro. Показано, что МСК хорошо прикрепляются к поверхности пористых микросфер большого диаметра (около 800 мкм) и растут на них практически как на плоскости, образуя монослой, тогда как культивирование МСК с микросферами малого диаметра (около 60 мкм) привело на 7-ые сут. к формированию объемных гибридных структур из микросфер и клеток, где клетки выступают как соединительный компонент этой структуры. Показано, что в таких гибридных конструкциях в течение еще 2-х недель осуществляется 3D-рост клеток, который не подавляется контактным торможением клеток (как при росте на плоскости) или из-за спонтанной дифференцировки МСК (как при росте в пористом матриксе). Показана также высокая биосовместимость полученных биополимерных микросфер и гибридной конструкции на ее основе in vivo при подкожной имплантации и на модели дефекта костной ткани у крыс. Это делает разработанную нами методику новой показательной экспериментальной моделью 3D-роста МСК.