Синтез и изучение соотношения "структура-противоопухолевая активность" новых органических производных имидазолонов, оксазолонов, роданинов и тиазолидиновНИР

Synthesis and "structure-antitumor activity" study of new organic derivatives of imidazolones, oxazolones, rhodanines and thiazolidines

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 22 марта 2018 г.-19 марта 2019 г. Синтез и изучение соотношения "структура-противоопухолевая активность" новых органических производных имидазолонов, оксазолонов, роданинов и тиазолидинов
Результаты этапа: Данный проект направлен на разработку и изучение соотношения «структура-активность» перспективных классов непептидных низкомолекулярных противоопухолевых препаратов на основе различных классов N,O-содержащих пятичленных гетероциклических соединений. Синтезируемые соединения представляют собой селективные ингибиторы белок-белкового взаимодействия р53-MDM2. Клеточный белок р53, так называемый «страж генома», играет важную роль в регуляции жизненного цикла клетки, а MDM2 является его эндогенным ингибитором. Если блокировать взаимодействие р53-MDM2 введением в клетку молекулы, способной встроиться в область взаимодействия этих двух белков, то высвободившийся р53 запустит процесс апоптоза клетки. На настоящий момент в мире нет препаратов, действующих по подобному механизму действия, однако в литературе описаны единичные примеры. Для синтеза целевых молекул диспироиндолинонов в работе был выбран метод, основанный на реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения азометинилидов к различным 5-арилидензамещенным N,O-содержащим гетероциклам (гидантоинам, тиогидантоинам, роданинам, оксазолонам) в качестве диполярофилов. В рамках данного этапа работы были получены следующие основные результаты: 1. Были разработаны методы синтеза диспироиндолинонов различных структурных типов: производных тиогидантоинов (N-незамещенных и N-арилзамещенных), производных гидантоинов (N-незамещенных), производных роданинов (N-аллилзамещенных), производных N-незамещенных тиазолидинов, производных 1,3-оксазолонов. 2. Для диспиропроизводных различных структурных типов была показана цитотоксичность и селективность на различных опухолевых клеточных линиях. Так, для диспиропроизводных на основе тиогидантоинов - по отношению к клеткам колоректального рака НСТ116, для производных гидантоинов - по отношению к клеткам рака легкого А549, для производных 1,3-оксазолонов - по отношению к клеткам рака простаты LNCap, для производных роданинов - по отношению к клеткам рака почек. 3. При установлении зависимости «структура-активность» выявлено, что при замене атома водорода в 5-м положении изатина на бром наблюдается значительное улучшение активности и селективности. Также к улучшению общей цитотоксичности и селективности приводит наличие атома галогена в пара-положении бензольного кольца в Ar2 заместителе.
2 20 марта 2019 г.-19 марта 2020 г. Синтез и изучение соотношения "структура-противоопухолевая активность" новых органических производных имидазолонов, оксазолонов, роданинов и тиазолидинов
Результаты этапа: (см. приложенный файл - РФФИ_отчет_финал.pdf) 1. Синтез и биологическое тестирование диспиропроизводных 2-тиогидантоинов. Общая схема проведенного синтеза диспиропроизводных на основе 2-тиогидантоинов включала в себя первоначальный синтез 2-тиогидантоинов, который может быть осуществлен двумя путями: (а) одностадийным, исходя из ароматических изотиоцианатов в кислой среде (метод А), (б) двухстадийным методом, исходя из ароматических аминов в спиртовом растворе щелочи или в уксусной кислоте в присутствии ацетата калия (методы В и С): С использованием этих двух подходов были получены 5-арилидензамещенные 2 тиогидантоины 10–38 с выходами 29–98%: Конфигурация двойной связи в случае соединения 34 была подтверждена данными рентгеноструктурного анализа (Рис. 1). Рис. 1. Молекулярная структура 2-тиогидантоина 34. Далее 5-арилидензамещенные 2 тиогидатоины 10–34 вводили в реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения с азометинилидом, генерируемым in situ из изатина и саркозина (N метилглицина). По оптимизированной методике были синтезированы диспироиндолиноны 35–96: Состав и строение полученных соединений были подтверждены данными ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения, а также РСА. Реакция получения диспироиндолинонов 35–96 протекает диастереоселективно с образованием продуктов (5’S*,5R*,4’R*)-конфигурации (Рис. 2). Рис. 2. Молекулярная структура диспиросоединения 63. Цитотоксичность полученной серии диспироиндолинонов 35–96 была определена с использованием стандартного метода МТТ . Для подтверждения их механизма действия как ингибиторов белок-белкового взаимодействия р53-MDM2 были выбраны клеточные линии аденокарциномы рака предстательной железы LNCap и PC3, а также колоректального рака HCTwt и HCT-/-, две из которых (LNCap и HCTwt) способны к экспрессии p53, а две другие (PC3 и HCT-/-) – нет. IC50 наиболее активных из полученных соединений составляют 1,12–18,03 мкМ; наилучшие результаты (LNCap/HCTwt) получены для соединений 41, 51, 55, 67, 88 (IC50 1,12–4,65/3,5-50 мкМ). На основании полученных данных можно сделать следующие выводы о взаимосвязи «структура-активность»: (1) при замене атома водорода в 5-м положении изатина на бром наблюдается значительное улучшение цитотоксичности и селективности; (2) к повышению цитотоксичности и селективности также приводит наличие атома галогена в пара-положении бензольного кольца в Ar2 заместителе. Было проведено исследование накопления полученных тиогидантоиновых производных в различных компартментах клетки при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии. Полученные соединения не обладают собственной флуоресценцией, поэтому для их визуализации был выбран метод конъюгации флуоресцентного красителя diSulfoCy5-азида с пропаргил-содержащим производным клик-реакцией внутри клетки. Для этого клеточную линию HEK обрабатывали N пропаргильным производным 98: А В Рис. 3. Визуализация распределения соединения 98 в клетке. А – визуализация ядра с использованием реагента DAPI; B – продукт клик-реакция соединения 98 с флуоресцентным азидом diSulfoCy5. В результате было показано, что соединение 98 визуализируется внутри клетки в цитоплазме; флуоресценция меченых соединений показана на микрофотографиях (Рис. 3), полученных методом конфокальной микроскопии (дополнительно ядра клеток были покрашены реагентом DAPI). Было проведено также исследование влияния положения тройной связи в исследуемом соединении на его накопление соединения в клетке. Для этого, исходя из соответствующих пропаргилзамещенных изатина, бензальдегида и анилина, были получены три диспиропроизводных 69, 71, 73, которые содержали пропаргильный фрагмент в разных частях молекулы: Было обнаружено, что, независимо от положения пропаргильного фрагмента, все полученные конъюгаты локализуются в цитоплазме. Для подтверждения механизма ингибирования белка р53 данным классом соединений на примере диспирооксиндола 63 был проведен анализ методом western blot. Было показано, что соединение 63 вызывает увеличение концентрации белка р53 в клеточной культуре HCTwt, что свидетельствует об ингибировании p53-MDM2-взаимодействия, активации белка р53, и, вследствие этого, также увеличение экспресии проапоптотических белков PUMA и CASPASE-3. Рис. 4. Данные вестерн-блот, показывающие влияние соединения 63 на экспрессию белка р53 на клеточных линиях HCTwt, HCT(-/-) и LNCap. Соединение было исследовано на способность эксрессировать белки р53, PUMA, а также каспазы CASPASE-3 И CASPASE-8, участвующие в р53-зависимом процессе апоптоза. На основании полученных данных по цитотоксичности и проникновению соединения в клетку было проведено дополнительное тестирование на клеточный апоптоз одного из соединений с наилучшей активностью (соединение 49) (Рис.16). Рис. 5. – Данные апоптоза для соединения 49 По оси абсцисс находится краситель Annexin V, который связывается с экспонированными фосфолипидами мембраны, которые являются признаком раннего апоптоза. По оси ординат интенсивность окрашивания клеток 7-аминоактиномицином D (7-AAD), который является флуоресцирующим интеркалятором ДНК, но способен проникать в клетку только при заметном повреждении мембраны, что является признаком клеточной гибели. По количеству клеток, окрашенных аннексином можно судить о содержании апоптотических клеток в популяции. В линии HCT-/- наблюдается обширная популяция окрашивания обоими красителями, что в отсутствие популяции раннего апоптоза свидетельствует о возможном клеточном некрозе. Как видно из данных Таблицы 7 повторного эксперимента, в которой указано процентное содержание клеток в апоптозе, видна селективность действия соединений на клеточных линиях HTCwt и HTC-/-, что является подтверждением предположения о р53-зависимом механизме апоптоза, однако селективности на клеточных линиях LNcap и PС3 не наблюдается. Таблица 1. Значения по апоптотической активности для соединения 49. Таким образом, среди двух наиболее активных по данным биологического тестирования в МТТ-тесте соединений 49 и 63 в ходе дальнейших углубленных биологических исследований было выбрано соединение 63, которое в настоящий момент проходит доклинические испытания in vivo. 2.Синтез и биологическое тестирование диспироиндолинонов на основе незамещеннных тиогидантоинов и гидантоинов Для оценки влияния природы экзо- и эндо-циклического гетероатомов в диполярофиле, а также заместителя при атоме N(3) тиогидантоинового цикла диспиропроизводных имидазол-4-онов на их биологическую активность нами была синтезирована серия незамещенных производных 113–115, 118–122. Структуры целевых соединений были выбраны с учетом установленной при исследовании диспиротиогидантоинов более высокой цитотоксичности галоген-замещенных производных. Первоначально были получены диспиропроизводные N-незамещенных 2 тиогидантоинов 113–115, исходя из тиогидантоина. Соединение 115 было озарактеризовано данными рентгеноструктурного анализа, показавшими его (5’R*,5S*,4’S*) конфигурацию (Рис. 6), аналогично полученным ранее N-замещенным производным. Рис. 6. Молекулярная структура соединения 124. Диспиро- гидантоины 118–120 и 5-замещенные тиазолидины 121–122 получали взаимодействием соответствующих метилиденовых производных с саркозином и 5-бром-изатином в реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения: Для полученных производных была проведена оценка их цитотоксичности на модельных клеточных линиях: эпителия почки человеческого эмбриона HEK293T, карциномы молочной железы MCF7, эпителия карциномы легких A549, эпителия здорового легкого эмбриона человека VA13. Таблица 2. Данные по биологической активности N-незамещенных диспиропроизводных 113-122 На основании полученных данных можно сделать вывод об отсутствии цитотоксического эффекта для тиазолидиновых производных 121 и 122; наименьшие значения IC50 (6,6±1,6 и 7,5±2,0 мкМ) имеют гидантоиновые производные 118 и 119, селективно действующие на клетки A549. Тиогидантоиновые производные 113–115 имеют промежуточную величину цитотоксичности IC50 на раковых линиях A549 и MCF7 (55,1±4,5; 39,6±2,3 и 88,6±9,4 мкM), однако, нетоксичны для нераковых клеточных линий VA13 и HEK293T. 3. Синтез и биологическое тестирование диспироиндолинонов на основе 5 арилиденоксазолонов. В ходе работы был также осуществлен синтез новых диспироиндолинонов, объединяющих в своей структуре индолиноновый и оксазолоновый фрагменты, реакцией 1,3-диполярного циклоприсоединения азометинилидов к 2-арил-5-арилметилидензамещенным 1,3-оксазол-5(4H)-онам, и проведено тестирование цитотоксичности полученных соединений. Исходные 2-арил-5-арилметилиден-1,3-оксазол-5(4H)-оны 123–127 получали конденсацией производных гиппуровых кислот (N-ацилглицинов) с альдегидами. В свою очередь, гиппуровые кислоты синтезировали взаимодействием галогенангидридов замещенных бензойных кислот с глицином в щелочной среде: Целевые диспироиндолиноны 128–132 получали реакцией 1,3-диполярного присоединения азометинилидов, генерируемых in situ из изатина и саркозина: Следует отметить, что продукты 1,3-диполярного присоединения не удалось выделить при проведении реакций с оксазолонами, содержащими R1 = F, Cl и/или R2 = Cl, Br в ароматических заместителях оксазолонового фрагмента. Основными продуктами в этих случаях являются соединения, молекулярные массы которых соответствуют аддуктам раскрытия оксазолинового цикла исходных оксазолонов и их диспиропроизводных присутствующими в реакционной смеси нуклеофилами – этанолом, водой и саркозином – с образованием бензамидных производных: Молекулярная структура соединения 131 приведена на Рис. 7А. В кристалле молекулы сокристаллизуются с молекулами этанола в соотношении 1:1. Молекулы этанола посредством водородных связей N-H…O и О-Н…N (где О – атом кислорода этанола) образуют в кристалле бесконечные цепочки, чередуясь с молекулами вдоль кристаллографической оси b (см. Рис.7В). A B Рис 7. (А) Молекулярная структура соединения 131. (В) Фрагмент упаковки молекул в кристалле соединения 131, демонстрирующий образование цепочек чередующихся посредством водородных связей молекул. Водородные связи обозначены штриховыми линиями. Все полученные диспироиндолиноны были протестированы in vitro на наличие противоопухолевой активности на клеточных культурах рака предстательной железы человека LNCap и PC3, колоректального рака HCТ116(+/+) и HCТ116(-/-), рака груди MCF7, карциномы легких человека A549, а также условно нормальной клеточной линии эмбриональных почек человека HEK и фибробластов легких (нераковых) VA13. Большая часть полученных соединений (128–132) не показала активности по отношению к исследуемым клеточным линиям. В то же время, наиболее эффективное соединение 130 показало высокую активность (IC50 = 1,08±0,96 мкМ) по отношению к p53-экспрессирующим клеткам LNCap и более низкую активность (IC50 = 3,21±1,45 мкМ) по отношению к неэкспрессирующим белок р53 клеткам PC3, однако, не показало никакой активности по отношению к клеткам HCТ, как экспрессирующим (HCТ+/+), так и не экспрессирующим (HCТ-/-) р53. При сравнении данных по цитотоксичности диспирооксазолонов с предыдущими результатами для диспиротиоксоимидазолинонов можно сделать вывод, что изменение природы гетероцикла в исходном 1,3-диполярофиле приводит к получению класса соединений, лишь в отдельных случаях проявляющих выборочную активность к исследуемым клеточным культурам. 3.Синтез и биологическое тестирование диспироиндолинонов на основе 5 аллилроданинов. 5-Арилидензамещенные 3-аллилроданины 133–134 были получены по известной методике конденсацией 3-аллилроданина с альдегидами в присутствии ацетата калия и далее введены в реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения с изатином и саркозином с получением диспиропроизводных 136–144. Для соединений была 136-144 была проведена оценка их биологической активности на 60 типах различных опухолевых клеточных линиях (NCI 60 cell lines. Наибольшую активность продемонстрировали соединения 143 и 144, данные по цитотоксичности которых на наиболее селективных клеточных линиях приведены ниже (см. Табл. 15). Таблица 3. Значения IC50 (мкМ), полученные в МТТ-тесте для спироиндолинонов 172-173. Было показано, что данные соединения обладают значительной цитотоксичностью и селективностью на клеточных линиях рака почек различной морфологии. 4. Синтез и биологическое тестирование диспироиндолинонов на основе 5-арилидензамещенных гидантоинов В связи с обнаруженной активностью N-незамещенных гидантоиновых диспиропроизводных (см. раздел 2), была синтезирована серия диспироиндолинонов на основе 5-арилиден-гидантоинов и проведено исследование их цитотоксичности в сравнении с тиогидантоиновыми аналогами. С целью оптимизации структуры было проведено исследование их взаимодействия с гидрофобным карманом белка MDM2 при помощи статического трехмерного молекулярного докинга в программном обеспечении «ICM-Pro». За основу моделирования были взяты структуры известных ингибиторов белок-белкового взаимодействия p53-MDM2 и известные для них рентгеноструктурные данные. Для проверки правильности модели вычисления сопоставляли рассчитанные данные с известными рентгеноструктурными данными комплекса с белком. Как видно на Рис. 8A, вычисленные модели хорошо согласуются с реальными структурами. Из данных докинга следует, что диспироиндолиноны, полученные из гидантоинов, должны лучше связываться с белком MDM2 по сравнению с аналогичными тиогидантоиновыми производными. Это позволяет предположить возможное улучшение биологической активности при замене атома серы на атом кислорода в молекуле диспироиндолинона. Рис. 8. Данные молекулярного докинга по связыванию ингибиторов с белком MDM2. А. Фрагмент белка MDM2 совместно с модельным соединением 1 (данные РСА) и ингибитором Nutlin- 3а, расположенным в сайте связывания p53. B. Наложение модельного соединения 1 и тиогидантоинового производного 2 в гидрофобном кармане белка р53. С Наложение модельного соединения 1 и гидантоинового аналога 3 в гидрофобном кармане белка р53. Для синтеза гидантоинов использовались соответствующие тиогидантоины, полученные по методике, описанной выше. Схема синтеза, а также данные по выходам получаемых 5-арилиденгидантоинов, приведены в Табл. 4. Таблица 4. Полученные 5-арилиденгидантоины Замена атома серы на кислород происходит в результате двух последовательных реакций: первоначального S-алкилирования 5-арилиден-2-тиогидантоина метилйодидом по SN2 механизму, и последующего гидролиза путем кипячения в смеси этанол-соляная кислота. Образование целевых продуктов подтверждется наличием в спектрах ЯМР 1H характеристичных для производных 5-арилиденгидантоинов сигнала NH-группы при 11.0 – 11.3 м.д., а также синглета винильного протона Z-изомера при 7.6 – 7.9 м.д. При использовании альтернативного метода замены атома серы на кислород с использованием хлоруксусной кислоты в воде, по данным LCMS пиков целевых продуктов в смеси обнаружено не было. Полученные 5-арилиденгидантоины были затем введены в реакцию 1,3- диполярного циклоприсоединения с изатинами и сакозином, с получением серии диспиропроизводных 141-148 (Табл.12). Соединения 141-151 были охарактеризованы данными ЯМР 1Н спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. В спектре ЯМР 1Н конечных диспироиндолинонов наблюдаются сигналы индолиноновых протонов при 10.60–10.85 м.д., сигналы NH гидантоиновых фрагментов при 8.02– 8.64 м.д., сигналы ароматических протонов при 6.85–7.96 м.д., три характеристические триплета CH-протонов при 4.09– 4.61, 3.79–4.20 и 3.37–3.46 м.д., а также синглет группы N-CH3 при 2.08–2.19 м.д. В масс- спектре высокого разрешения присутствовует пик молекулярного иона. Молекулярная структура соединения 151 (Рис. 14) была установлена методом РСА, подтвердившим относительную конфигурацию стереоцентров (5’R*,5S*,4`S*). Рис 9. Молекулярная структура соединения 151. На следующем этапе была проведена оценка биологической активности полученных диспироиндолинонов 141-151 на выбранной модели раковых клеточных линий, которая содержала клетки эпителия почки человеческого эмбриона HEK293T, карциномы молочной железы MCF7, эпителия карциномы легких A549, эпителия здорового легкого эмбриона человека VA13. Как известно, активация р53 вызывает транскрипцию MDM2, который затем напрямую взаимодействует с трансактивационным доменом, способствуя его убиквитин-зависимой транскрипции и дальнейшей протеасомной деградации. В таких раковых клеточных линиях, как HEK, MCF7 и A549, также наблюдается гиперэкспрессия MDM2, которая в дальнейшем приводит к возникновению апоптоза. Цитотоксичность диспироиндолинонов была оценена в стандартном МТТ-тесте, дополнительно все соединения были протестированы на р53-активацию на транскрипционном репортере. Результаты приведены в Табл. 13. Таблица 5. Данные по биологической активности диспиропроизводных 141-151 на основе 5-арилиденгидантоинов по сравнению с Нутлином 3, известным ингибитором р53-MDM2 взаимодействия Как видно из данных Табл 5, наилучшая цитотоксичность в этой серии составляет 1.3– 14.3 μM. Соединения 150 и 151 продемонстрировали наилучший цитотоксический эффект на клеточных линиях A549 и MCF7 и не показали биологической активности по отношению к условно нормальным клеточным линиям HEK293T и VA13, что может служить косвенным подтверждением р53-зависимого механизма действия. Соединения 144 и 145 показали селективность по отношению к клеточным линиям эпителия карциномы легких A549 с величинами цитотоксичности IC50 = 6.6±1.6 и 7.5±2.0 μM соответственно, однако, эти также проявили эффект на нераковых клеточных линиях, что может свидетельствовать лишь об общем цитотоксическом эффекте. По сравнению с аналогичными тиогидантоиновыми производными, диспиропроизводные на основе гидантоинов показали лучшую цитотоксичность. Так, например для соединения 150 IC50 = 6.3±0.55 μM на клеточной линии HEK и IC50 = 6.58±0.55 μM на клеточной линии MCF7, в то время как его тио-аналог имеет значения IC50 = 28.61±8.68 μM и 34.9±6.4 μM на тех же линиях, соответственно [103]. Необходимо также отметить, что соединения 144, 145 и 150,151 имеют значения цитотоксичности IC50, превосходящие препарат сравнения Нутлин 3а. Тестирование на p53-активацию на транскрипционном с использованием в качестве контроля Нутлина 3 показало, что эффект р53-активации проявило только одно соединение 146, что, однако, не подтверждается данными по цитотоксичности. Слабый эффект р53-активации имеют соединения 142, 148 и 151. Полученный результат может быть объяснен двумя гипотезами: а) в исследуемых соединениях активация р53 является только одним из нескольких механизмов действия, влияющих на общую цитотоксичность; б) слабая р53-активация есть следствие других типов активности, вызывающих экспрессию р53.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".