ИСТИНА

На современном этапе развития микробиологии до сих пор не определены пределы устойчивости бактерий к воздействию физико-химических и биотических факторов. Изучение пределов выживаемости и механизмов устойчивости бактерий к стрессу играет важную роль в реконструкции условий ранних этапов развития биосферы, определении критериев астробиологического поиска живых организмов во внеземном пространстве, ремедиации загрязненных и деградированных экосистем и преодолении множественной терапевтической устойчивости патогенных прокариот. Проведенные ранее исследования не позволяют пока целиком сформировать представления о диапазонах, механизмах и взаимосвязях стресс-толерантности почвенных бактерий к разным воздействиям, что подтверждается открытием все более экстремотолерантных видов и осложняется порой противоречивыми результатами, полученными разными исследователями. В данном исследовании предполагается провести оценку диапазонов устойчивости бактерий, выделенных из различных экстремальных местообитаний со всего Земного шара, к широкому спектру абиотических стрессовых воздействий и присутствию антибиотиков в среде, а также выявить возможные корреляционные связи между величинами устойчивости к разным факторам и между устойчивостью и таксономическим положением или биотопом выделения культур. Новизна проекта заключается в исследовании широкого спектра факторных воздействий на крупную коллекцию бактерий, выделенных из экстремальных местообитаний, что позволяет выявить возможные сопряженные механизмы устойчивости и оценить их приуроченность к различным экотопам. Предполагаемым результатом исследования будут характеристики устойчивости чистых культур к различным индивидуальным стрессовым воздействиям и выявление взаимосвязи между ними, что позволит предположить обуславливающие их внутриклеточные механизмы. Эти результаты могут быть использованы для оценки устойчивости и способности к восстановлению нарушенных экосистем, для уточнения критериев астробиологического поиска, для дальнейшего выяснения физиологических механизмов устойчивости бактерий (в том числе патогенных) к стрессу и ее преодоления. Также полученные данные могут быть полезны для решения прикладных биотехнологических задач.

Resistance of bacteria to the effect of physicochemical and biotic factors is still not determined. Investigation of survival limits and mechanisms of stress resistance of bacteria plays a head role in reconstruction of environmental conditions at the early stages of biosphere evolution, in determination of astrobiological research criteria, in remediation of polluted and degraded ecosystems and in solution of multiple therapeutic resistance of pathogenic bacteria. Previous research doesn’t allow us to form a conception of limits, mechanisms and correlations between stress-tolerance of soil bacteria to different influences, that can be confirmed by discovery of more and more extremo-tolerant species and that is complicated by occasionally contradictory results obtained by different investigators. Estimation of resistance limits of bacteria, isolated from extreme habitats from all over the world, to wide spectrum of abiotic stress factors and presence of antibiotics are planned in this research. Detection of potential close correlations between different types of stress and between resistance and taxonomy and initial biotope is also would be explored. Novelty of this project is observation of wide spectrum factor impacts on large collection of bacteria isolated from extreme habitats, that allow us to identify possible conjugated resistance mechanisms and to estimate their accordance to different ecotopes. As a result of this study limits of ascenic culture’s resistance to different individual stress types will be obtained and close correlations between them would be found probably. It can allow us to assume physiological mechanisms determining this resistance. All this results could be used for estimation of sustainability and recovery ability of disturbed ecosystems, for astrobiological research criteria enhancement and for further resistance mechanisms identification and its overcoming. Obtained data could be useful for solution of applied biotechnological purposes.

В результате работы будут выяснены пределы устойчивости чистых культур бактерий к воздействию температуры, рН среды, антибиотиков и различным концентрациям разных солей. Будут получены новые данные об устойчивости микроорганизмов экстремальных местообитаний к стрессовым воздействиям и о взаимосвязях между устойчивостью к различным факторам среды. Результаты исследования будут полезны для понимания процессов адаптации, эволюции и функционирования микробных экосистем и биосферы в целом, а также для оценки возможности существования биологических форм жизни за пределами Земли. Полученные данные позволят уточнить критерии астробиологического поиска жизни во внеземном пространстве, предположить особенности структуры микробных комплексов на ранних стадиях становления земной биосферы и в условиях деградации и загрязнения существующих экосистем. Обнаружение антибиотикорезистентных штаммов позволит уточнить роль антибиотиков в естественных микробных сообществах и предположить наличие продуцентов антибиотических веществ у исследуемых культур. Прикладной аспект полученных результатов заключается в возможном обнаружении штаммов, устойчивых при повышенных температурах, в условиях высокой кислотности, щелочности, солености, что часто необходимо для решения производственных задач; устойчивые к антибиотикам штаммы и могут быть использованы для изучения механизмов устойчивости к антибиотикам и поиска продуцентов новых антимикробных веществ.

В ходе реализации проекта обнаружено, что для широкого таксономического разнообразия бактерий, выделенных из экстремальных местообитаний, характерны полиэкстремотолерантные свойства. Исследование устойчивости к температуре культивирования выявило мезофильные значения оптимальной температуры для роста всех штаммов, как выделенных при 10°С, так и выделенных при 25°С. В то же время, пределы сохранения метаболической активности в отношении температуры культивирования у всех штаммов шире мезофильных: подавляющее большинство исследованных культур репродуцируют при 10°С, а значительная доля штаммов сохраняет метаболическую активность при 4 и даже 2°С. Таким образом, можно сделать вывод о термотолерантных свойствах исследованных чистых культур. Аналогичные результаты были получены при культивировании изолятов в градиенте значений рН среды: все штаммы проявляют нейтрофильные оптимальные значения рН, в то же время характеризуются более широкими диапазонами сохранения метаболической активности in vitro, преимущественно смещенными в щелочную область. Среди изолятов были обнаружены экстремально ацидо- и алкалотолерантные штаммы, способные развиваться при рН 2-3 и 11-12 соответственно. Анализ устойчивости в присутствии солей выявляет умеренные галотолератные свойства всех исследованных культур в отношении хлоридов натрия или калия, высокую устойчивость в отношении сульфата магния, а также умеренную толерантность к присутствию перхлората магния и низкую устойчивость к гидрокарбонату натрия. Антибиотикоутойчивость обнаружена у более чем половины исследованных культур, причем, нередко, изоляты устойчивы более чем к одному антибиотику. Наибольшее число штаммов устойчивы к хлорамфениколу и цефалексину. Таким образом, можно сделать вывод, что культивируемые бактерии, выделенные из широкого спектра различных экстремальных местообитаний Земного шара, характеризуются полиэкстремотолератностью и способны развиваться в широких диапазонах физико-химических факторов.

Проведено исследование устойчивости чистых культур, выделенных из экстремально-ксерофитных почв и осадочных пород, к температуре культивирования, различным условиям рН среды и присутствию в составе среды градиента концентраций хлоридов натрия или калия, сульфата магния, гидрокарбоната натрия или перхлората магния, а также к присутствию в среде одного клинического антибиотика (хлорамфеникол, доксициклин, тетрациклин, ампициллин, канамицин, цефалексин или рифампицин) с целью определения пределов сохранения метаболической активности микроорганизмами при воздействии указанных факторов. Объектами исследования выступала коллекция аэробных гетеротрофных бактерий, выделенных из грунтов пустынь Мохаве (США), Намиб (Намибия), Тар (Индия), Гибсона (Австралия), Сахара (Египет), Серозема пустыни Негев, (Израиль), горной коричневой почвы подножья Атласских гор (Марокко), Солончака береговой линии озера Баскунчак (Россия), бурой полупустынной почвы Сарпинской низменности (Россия), а также мерзлых пород архипелагов Новая и Северная Земля (Россия), Канадской арктики, Колымской низменности и Антарктиды. Исследовалась способность к репродукции in vitro на питательных средах с вышеуказанными стресс-факторами (каждый фактор рассматривался отдельно) 781 штамма аэробных гетеротрофных бактерий филумов Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria и Bacteroidetes. Исследованные бактериальные культуры проявили высокую устойчивость к воздействию низких температур культивирования (вплоть до 2С), в то время как способность к репродукции при высоких температурах (50С) встречалась относительно редко несмотря на то, что значительная часть бактериальных культур была выделена из экосистем, где in situ температура поверхностных слоев почвы может превышать это значение. Оптимальной температурой культивирования для всех исследованных штаммов являлись температура, характерная для мезофильных организмов. Полученные диапазоны метаболической активности в градиенте рН свидетельствуют о нейтрофильных оптимальных значениях рН и способности исследованных штаммов развиваться в широких пределах значений рН среды (pH 5-11). Обнаружены экстремально ацидотолерантные (способные развиваться при рН 2-3) и экстремально алкалотолерантные (способные развиваться при рН 12) штаммы бактерий. Исследованные культуры характеризуются умеренными галотолерантными свойствами – подавляющее большинство изолятов способно к репродукции на средах, содержащих 5-10% хлоридов натрия или калия. В то же время, выявлено влияние ионного состава растворенных солей на устойчивость к ним: средние показатели устойчивости к хлориду калия выше, чем к хлориду натрия, что, по-видимому, связано с цито-физиологическими эффектами ионов натрия и калия. Оценка диапазонов устойчивости штаммов коллекции к присутствию в среде сульфата магния выявила низкую ингибирующую способность данной соли, в то время как гидрокарбонат натрия, напротив, оказывает на исследованные штаммы сильное ингибирующее воздействие. Присутствие в среде перхлората магния оказывает умеренное ингибирующее действие, во всех сообществах обнаружены штаммы, способные репродуцировать на средах, содержащих 5% данной соли. Устойчивость к клиническим антибиотикам разных классов по механизму биологического действия выявлена во всех исследованных культивируемых сообществах, в то же время корреляций между свойствами сообществ и проявлением антибиотикорезистентности выявлено не было. Наиболее резистентные штаммы бактерий являются представителями родов Arthrobacter, Microbacterium, Bacillus, Planomicrobium, Kocuria, Leucobacter, Pontibacter. Множественная антибиотикоустойчивость (способность репродуцировать на нескольких питательных средах с добавлением различных клинических антибиотиков) выявлена у представителей родов Agrococcus, Arthrobacter, Bacillus, Cellulomonas, Georgenia, Massilia, Microbacterium, Planomicrobium, Pontibacter, Pseudarthrobacter, Rufibacter, Stenotrophomonas, Streptomyces.