|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикамНИР
Effect of mutations in bacterial beta-lactamases on structure plasticity, mechanisms of action, substrate specificity and development of resistance to beta-lactam antibiotics
- Руководитель НИР: Егоров А.М.
- Ответственные исполнители: Григоренко В.Г., Рубцова М.Ю.
- Участники НИР: Андреева И.П., Бурмакин В.В., Иштубаев И.В., Преснова Г.В., Уляшова М.М., Упоров И.В., Филатова Е.В., Филиппова А.А.
- Подразделение: Кафедра химической энзимологии
- Срок исполнения: 2 марта 2015 г. - 31 декабря 2019 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 15-14-00014
- Номер ЦИТИС: 115101240012
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.27.17 Энзимология
- 31.27.22 Антимикробные агенты
- 34.15.27 Генетическая инженерия
-
Ключевые слова:
бета-лактамазы
beta-lactamases -
Описание:
Основная цель данного междисциплинарного проекта заключается в поиске способов преодоления антибиотикорезистентности бактерий к бета-лактамным антибиотикам на основании исследования структурных особенностей ферментов бета-лактамаз и установления влияния точечных мутаций и их комбинаций на изменение структуры, стабильности, субстратной специфичности и каталитической активности. Актуальность проекта обусловлена необходимостью разработки новых подходов к преодолению устойчивости бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний, которая является одной из актуальных для здравоохранения Российской Федерации. Появление случаев множественной устойчивости возбудителей одновременно к нескольким типам антибиотиков существенно ограничивает выбор адекватной лекарственной терапии. Появление мутантных форм бета-лактамаз, характеризующихся устойчивостью к ингибиторам, дополнительно усложняет выбор лекарственных средств. В связи с этим необходимо разработать новые подходы к преодолению резистентности, одним из которых является поиск способов направленного ингибирования каталитической активности бета-лактамаз. В качестве модели в данном проекте будут исследованы бета-лактамазы ТЕМ-типа, относящиеся к наиболее распространенному молекулярному классу А. Эволюция этих белков является самой продолжительной по времени, причем бета-лактамазы ТЕМ типа являются наиболее часто мутируемыми из всех описанных типов. У бета-лактамаз ТЕМ типа наблюдается появление мутантов с расширенным спектром действия, и только у них выявлены мутантные формы, устойчивые к ингибиторам. В проекте предполагается провести подробный анализ всех описанных в литературе мутаций бета-лактамаз ТЕМ-типа методами биоинформатики, выбрать наиболее значимые комбинации мутаций, включающие «ключевые» и «латентные» мутации, и изучить взаимное влияние мутаций на активность и стабильность ферментов с использованием их рекомбинантных форм. Для этих целей гены бета-лактамаз будут клонированы, оптимизирована система экспрессии в клетках E. coli, разработаны методы выделения и очистки рекомбинантных ферментов, исследовано взаимное влияние мутаций на эффективность экспресии генов и фолдинга белковой глобулы. В процессе выполнения проекта будет создан Биобанк рекомбинантных мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1. Структура наиболее интересных мутантов рекомбинантных бета-лактамаз будет изучена методом рентгеноструктурного анализа. Будет разработан алгоритм кинетического исследования активности ферментов с целью определения спектра субстратной специфичности, стабильности и устойчивости к ингибиторам. Научная новизна проекта будет заключаться в создании модели молекулы фермента на основании комплексного подхода к изучению взаимного влияния точечных мутаций, расположенных на разных расстояниях от активного центра, и поиску поверхностных областей молекулы, влияющих на каталитическую активность и стабильность молекулы и расширение субстратной специфичности. Модель будет использована для нахождения «горячих точек» на поверхности с целью аллостерической регуляции свойств ферментов.
-
Abstract:
Increase in the number of infectious diseases (respiratory, gastrointestinal, urogenital, etc.) caused by pathogenic bacteria, is an acute problem for the whole world, both developed and developing countries. It is necessary to note the significance of the spread of nosocomial infections, often caused by resistant pathogens to antibiotics, which affects primarily people with weakened immune systems: children, the elderly, pregnant women, patients after surgery. The term "antibiotic resistance" describes the phenomenon of resistance of bacteria causing the infectious diseases to antibiotics. Investigation of mechanisms of resistance to antibiotics is an important issue of modern microbiology. Currently, beta-lactams are the most commonly used antibiotics. The presence of "chemical core" - the beta-lactam ring is the peculiarity of their chemical structure, and presence of such cyclic amide explains its high reactivity. Depending on the structure, these antibiotics are divided into four groups: penicillins, cephalosporins, carbapenems, and monobactams. The mechanism of action of beta-lactams consists in the inhibition of penicillin bindidng proteins resulting in the disruption of cell wall synthesis. By now, several mechanisms of bacterial resistance were identified. The most common is the synthesis of the bacterial enzymes - hydrolases which hydrolyze beta-lactam ring of the antibiotic. These enzymes are called beta-lactamases. Certain mutations in them, even single replacing one amino acid in a protein sequence, can alter the structure of the enzyme, and it is characterised by expanded substrate specificity towards antibiotics. The emergence of new mutant forms of beta-lactamases is due to increased consumption of antibiotics, as the antibiotic production accounts for 200 thousand tons annually. The variability of beta-lactamases is a consequence of general biological mechanism of adaptation of microorganisms to antibiotics. Due to the localization of beta-lactamase encoding genes on mobile genetic elements they spread fast enough, and this escalates additionally the problem of antibiotic resistance to beta-lactam antibotics. One of the possible approaches to overcoming resistance is to use a beta-lactamase inhibitor. Inhibitors, which may be used in combination with antibiotics, are known for the beta-lactamases of molecular class A only (they are: clavulanic acid, sulbactam, tazobactam). However, some of beta-lactamases are known to be resistant to these inhibitors. Therefore, the study of the mechanisms of antibiotic resistance formation due to the production of beta-lactamases is fully consistent with the priority and the objective of the project. The project is proposed to investigate the role of individual mutations and their combinations on the structural features and mechanism of action of beta-lactamases, causing resistance to beta-lactam antibiotics. The mutations changing the substrate specificity may lead to a decrease in enzyme stability, may influence the folding of protein. Therefore, additional (compensatory) mutation(s), located away from the active site, are necessary to compensate the negative impact. Studying the effect of different combinations of mutations on the structure and stability of enzymes is of fundamental and practical importance. Acquiring new knowledge on fundamental problem of structure –function relations by the example of an extremely diverse family of enzymes beta-lactamase will identify ways to regulate their enzymatic activity and create new approaches to overcome this type of resistance. Finding the "hot spots", which regulate the activity of beta-lactamases, will develop novel inhibitors of their activity and new approaches for their identification.
-
Планируемые результаты:
Будут созданы штаммы E.coli – продуценты мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ-типа, имеющих единичные и комбинации функциональных и «сопутствующих» мутаций. Будет проведено выделение и очистка полученных рекомбинантных мутантных форм бета-лактамаз. Будет проведено физико-химическое изучение каталитической активности полученных рекомбинантных бета-лактамаз. Будет проведено изучение термоинактивации рекомбинантных мутантных форм при повышенной температуре. Будет проведен анализ влияния единичных мутаций и их комбинаций на активность, стабильность и уровень экспрессии ферментов. Будет проведено исследование структурно-динамических характеристик комплексов бета-лактамаз семейства ТЕМ с лигандами. Будет проведено структурно-динамическое исследование конформации омега петли в бета-лактамазах ТЕМ типа Будет исследовано влияние условий наращивания устойчивых микроорганизмов в присутствии и отсутствии антибиотиков на экспрессию генов бета-лактамаз. Будет проведена одновременная идентификация генов бета-лактамаз в образцах ДНК и мРНК, выделенных из мультирезистентных штаммов, методом гибридизационного анализа на микрочипах. Будет проанализирована корреляция данных идентификации генов бета-лактамаз, полученных молекулярно-генетическими и микробиологическими методами. Будет проведено обобщение результатов, полученных в результате выполнения проекта. Будут подготовлены публикации, описывающие основные результаты исследований
-
Основные результаты:
- Проведён сбор и анализ нуклеотидных и белковых последовательностей бета-лактамаз класса А ТЕМ типа в международных банках данных с целью идентификации и анализа всех возможных мутаций, включающих «ключевые» и «сопутствующие/компенсационные». - Выполнено компьютерное моделирование структур бета-лактамаз ТЕМ типа, содержащих ключевые мутации. – Клонированы и экспрессированы в клетках E.coli гены ТЕМ-лактамаз дикого типа и содержащих единичные ключевые мутации, а также комбинации мутаций. - Разработан метод определения уровня экспресии генов бета-лактамаз на основе обратной транскрипции мРНК и гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами. - Разработан метод выделения и очистки рекомбинантных мутантных форм бета-лактамаз. - Впервые для всех сочетаний сопутствующей мутации Q39K с ключевыми M69V, E104K, R164S был выявлен кумулятивный эффект, заключающийся в дестабилизирующем влиянии замены Q39K на стабильность фермента. Впервые показано стабилизирующее влияние замены R164S на способность фермента к реактивации – Получены кристаллы и проведен рентгено-структурный анализ рекомбинантной бета-лактамазы ТЕМ-171. - У двойных мутантов, включающих замену Q39K и одну из трех ключевых мутаций, наблюдали во всех случаях уменьшение Км, т.е. улучшение связывания субстрата, по сравнению с единичной ключевой заменой.
- Добавил в систему: Григоренко Виталий Георгиевич
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 2 марта 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам |
| Результаты этапа: Проведен сбор нуклеотидных и белковых последовательностей бета-лактамаз ТЕМ типа в международных банках данных. Бета-лактамазы ТЕМ-типа относятся к наиболее распространенному в настоящее время молекулярному классу А. Семейство бета-лактамаз ТЕМ-типа включает в настоящее время 205 субтипов (вариантов) ферментов. Белок содержит 288 аминокислот. Общее число аминокислот, в которых наблюдались замены – 92, из них 5 находятся в сигнальной последовательности. Эволюция этих ферментов является самой продолжительной по времени, при этом они относятся к наиболее часто мутируемым из всех описанных типов бета-лактамаз. У белков данного типа имеется несколько так называемых ключевых мутаций, приводящих к расширению спектра субстратной специфичности. Только у этого типа бета-лактамаз выявлено 5 положений, мутации в которых приводят к появлению мутантных форм, устойчивых к ингибиторам. Выполнено компьютерное моделирование бета-лактамазы ТЕМ-1. На модели фермента проведен анализ расположения мутирующих аминокислотных остатков, соответствующим изменению профиля субстратной специфичности, устойчивости к действию ингибиторов, а также остатков, для которых пока не установлено значение мутаций. Проведен анализ расположения этих остатков на модели белка, а также возможного влияния замещающих аминокислот на изменение внутрибелковых связей и стабильность белковой глобулы. Выявлены положения, мутации в которых могут повлиять на стабильность белковой глобулы. Проведено клонирование и экспрессия в клетках E.coli генов бета-лактамаз ТЕМ-1 и ее мутантов, содержащих единичные ключевые мутации и их комбинации в положениях 39, 84, 104, 164. Разработаны методы выделения и очистки рекомбинантных мутантных форм бета-лактамаз, получены гомогенные препараты рекомбинантных ферментов бета-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171, отличающихся заменой валина на изолейцин в положении 84 (Val84Ile). Поведено изучение каталитических свойств и термостабильности рекомбинантных бета-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171. Методами ферментативной кинетики определены значения КM и kкат для рекомбинантных форм бета-лактамаз по субстрату CENTA. Они практически не отличались, что позволило сделать вывод о схожести строения каталитического центра и одинаковой каталитической эффективности обоих рекомбинантных ферментов в реакции гидролиза субстрата CENTA. Это свидетельствует о том, что замена валина в 84 положении на изолейцин не оказывает существенного влияния на конформацию активного центра фермента и пути передачи протона. Было изучено ингибирование рекомбинантных бета-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171 тазобактамом. Для обоих ферментов установлен конкурентный тип ингибирования бета-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 тазобактамом в отношении субстрата CENTA. Данный факт отражает структурное сходство тазобактама с бета-лактамными антибиотиками (пенициллины и цефалоспорины), являющимися субстратами бета-лактамаз. Изучение термостабильности бета-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171 при 60 0С показало, что замена валина в 84 положении на изолейцин приводит к уменьшению стабильности фермента ТЕМ-171 в 1,5 раза. Разработан метод определения уровня мРНК бета-лактамаз на основе обратной транскрипции и гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами. Оптимизированы условия выделения мРНК из культур клеток E.coli. Оптимизированы условия удаления примеси дезоксирибонуклеиновых кислот. Оптимизированы условия проведения обратной транскрипции в присутствии ревертаз различного происхождения. Проведен молекулярный дизайн олигонуклотидных зондов для идентификации генов бета-лактамаз ТЕМ типа. Оптимизированы условия идентификации генов бета-лактамаз с использованием различных участков специфического гена. | ||
| 2 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам |
| Результаты этапа: Основная цель проекта заключается в исследовании влияния точечных мутаций и их комбинаций на изменение структуры, субстратной специфичности и физико-химических свойств бактериальных ферментов бета-лактамаз ТЕМ типа.Для экспериментального исследования в 2016 году было выбрано изучение влияния сопутствующих замен Q39K и М182Т на каталитические свойства и стабильность бета-лактамаз ТЕМ типа. В результате выполнения работы созданы девять штаммов E.coli - продуцентов мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1, содержащих единичные аминокислотные замены (сопутствующие Q39K, M182T, ключевые M69V, E104K, R164S) и их комбинации (Q39K+ E104K, Q39K+ M69V, Q39K+ R164S, Q39K+R164S+E104K). Для всех полученных рекомбинантных мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1 проведено определение значений KM хромогенного субстрата CENTA, являющегося синтетическим хромогенным субстратом бета-лактамаз. У двойных мутантов, включающих замену Q39K и одну из трех ключевых мутаций, наблюдали во всех случаях уменьшение Км, т.е. улучшение связывания субстрата, по сравнению с единичной ключевой заменой. Впервые было проведено исследование термоинактивации полученных мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1 при повышенной температуре. Единичная замена M182T уменьшала скорость термоинактивации, т.е. приводила к стабилизации фермента. Для всех сочетаний сопутствующей мутации Q39K с ключевыми M69V, E104K, R164S был выявлен кумулятивный эффект, заключающийся в дестабилизирующем влиянии замены Q39K на стабильность фермента. Это свойство данной замены было показано впервые. Впервые показано стабилизирующее влияние замены R164S на способность фермента к термореактивации. Проведено компьютерное моделирование комплексов бета-лактамаз ТЕМ типа с различными лигандами. Объяснено уменьшение КМ при взаимодействии бета-лактамазы с субстратом СЕНТА. Проведено генотипирование образцов ДНК, выделенных из возбудителей выделенных из внутрибольничных и внебольничных штаммов энтеробактерий на наличие генов бета-лактамаз методом гибридизационного анализа на микрочипах с ферментативной детекцией. Показаны преимущества данного метода для экспресс-идентификации генов, обуславливающих устойчивость возбудителей к бета-лактамным антибиотикам. Выявлены сходства и различия в генах бета-лактамаз, выявляемых у возбудителей внутри- и внебольничных инфекций. Полученные результаты будут использованы для поиска новых способов предоления антибиотикорезистентности и разработки новых эффективных способов определения устойчивых к антибиотикам бактерий. | ||
| 3 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам |
| Результаты этапа: В результате работы были созданы четырнадцать штаммов E.coli - продуцентов мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1: продуценты мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1, содержащих единичные аминокислотные замены по положениям 165 (три варианта замен), 167 (два варианта замен), 174 (два варианта замен), 276 (одна замена), 265 (единичная замена и четыре комбинации), комбинацию мутаций R164S и M182T. Для всех полученных рекомбинантных мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1 проведено определение значений KM и Vmax гидролиза хромогенного субстрата CENTA, являющегося синтетическим хромогенным субстратом бета-лактамаз. Значения KM и Vmax для некоторых вариантов ТЕМ бета-лактамаз получены впервые. Проведено компьютерное моделирование комплексов бета-лактамаз ТЕМ типа с различными лигандами (субстратами цефалотин и CENTA и ингибиторами сульбактам, тазобактам, клавулановая кислота) методом молекулярной динамики на удлиненных траекториях (десятки наносекунд). В качестве модельных бета-лактамаз использованы две бета-лактамазы: TEM-1 и ТЕМ-32 (замены М69I, М182Т), относящегося к фенотипу ингибитор-устойчивых бета-лактамаз. С помощью программного комплекса AMBER рассчитывалась свободная энергия образования комплексов. Полученные данные показали, что половина изученных комплексов распадается спустя 1-2 нс после начала траектории. Сравнение свободных энергий комплексов, которые оставались стабильными на протяжении всей траектории (10 нс) позволило расположить исследованные соединения ряд по убыванию стабильности комплексов с бета-лактамазой TEM-1: клавулановая кислота, тазобактам, CENTA. Свободные энергии комплексов TEM-32 с CENTA и цефалотином близки, и они выше, чем свободная энергия комплекса TEM-1/CENTA, что свидетельствует о более высокой аффинности исследованных соединений к TEM-1 по сравнению с ферментом TEM-32. Проведён структурный и энергетический анализ двух конформаций омега-петли у бета-лактамаз семейства ТЕМ. Изменение геометрии петли происходит за счёт мутации R164S, которая вызывает перестройку системы водородных и ионных связей, образованную боковыми цепями аминокислотных остатков, образующих омега-петлю. Анализ флуктуаций тяжелых атомов аминокислотных остатков показал, что в бета-лактамазе ТЕМ-1 движение омега-петли происходит в направлении от первоначального положения к «открытому» состоянию. Введение мутации R164S приводит как к увеличению, так и понижению подвижности различных аминокислотных остатков. Омега- петля отклоняется от первоначального положения и свободно смещается от «открытого» до «закрытого» состояния. Последующее введение мутации в положении 39 приводит к дополнительному увеличению подвижности различных элементов белковой глобулы в целом, а омега-петля закрепляется в закрытом положении. Для установления механизмов влияния удаленных остатков на структурные элементы, в частности, на омега-петлю, были построены сети внутрибелковых взаимодействий аминокислотных остатков (RIN) на основании данных траекторий молекулярной динамики для шести структур бета-лактамаз TEM-1; ТЕМ-1 с ключевыми заменами G238S и E240K (аналог природной бета-лактамазы ТЕМ-71); ТЕМ-1 с тремя заменами G238S, E240K, M182T; TEM-1 с четырьмя заменами G238S, E240K, M182T, Q39K (аналог природной бета-лактамазы TEM-72); ТЕМ-1 с заменой R164S; ТЕМ-1 с двумя заменами R164S и Q39K. Показано, что в результате точечных мутаций в ферменте происходит исчезновение отдельных контактов и появление новых, что может существенно менять подвижность фрагментов белковой глобулы, участвующих в катализе, и влиять на каталитические свойства ферментов. Проведено исследование влияния условий наращивания клеток E. сoli – продуцентов рекомбинантных бета-лактамаз на экспрессию генов бета-лактамазы ТЕМ- 1 и ее мутантных форм. Установлено, что уровень РНК-транскриптов бета-лактамаз ТЕМ типа, определяемый по выходу ПЦР-продукта специфического гена бета-лактамаз ТEM типа, не зависел от концентрации антибиотика к культуре клеток. Изучено влияние структуры праймеров и типа ревертазы на эффективность реакции обратной транскрипции и выбраны специфические праймеры, обеспечивающие максимальный выход реакции синтеза кДНК. Проведен анализ ДНК и РНК, выделенных из клинических нтаммов энтеробактерий с разной степенью устойчивости к бета-лактамеым антибиотикам. Показано, что количество экспрессируемых генов в мультирезистентных штаммах было меньше количества обнаруженных в ДНК генов. | ||
| 4 | 16 апреля 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам |
| Результаты этапа: 1. Проанализированы литературные данные по механизмам резистентности бактерий к антибиотикам; распространенности резистентных бактерий; участию бактериальных ферментов в реализации резистентности, структуре и свойствам бета-лактамаз. Проведена систематизация бактериальных ферментов, участвующих в формировании резистентности. 2. Проведён биоинформатический анализ разрешённых на настоящее время пространственных структур сериновых бета-лактамаз разных с целью изучения укладки и пространственного расположения омега-петли. Показано, что укладка омега-петли близка у разных сериновых ферментов, что объясняется консервативностью структуры, малой подвижностью и незначительными вариациями расстояния между N- и C-концами петли. Конформация петли определяется взаимодействием остатков петли друг с другом и с растворителем, и в меньшей степени с остальной частью белковой глобулы. 3. Используя метод молекулярной динамики проведён сравнительный анализ динамических свойств омега-петли и энергии её взаимодействия с белковой глобулой и растворителем. Схожесть укладки омега-петли у сериновых бета-лактамаз, её расположение вблизи активного центра, высокая гомология последовательностей петли позволяет рассматривать этот элемент структуры белка как новую мишень для аллостерического воздействия на ферментативную активность с целью его ингибирования. 4. Созданы штаммы E.coli – продуценты рекомбинатных бета-лактамаз ТЕМ типа, содержащие единичные замены R65L и М182А, а также двойной мутант R65L+М182Т. Мутант R65L характеризовался низкой периплазматической концентрацией целевого белка. У мутанта с двойной заменой R65L+M182T уровень синтеза про-белка и концентрация зрелого белка в периплазме соответствует ферменту дикого типа ТЕМ-1. Это свидетельствует о компенсации дестабилизирующего влияния замены R65L в сочетании с мутацией M182T. 5. Изучены каталитические свойства рекомбинантных бета-лактамаз, содержащих единичные мутации R65L, M182A, М182Т и комбинацию мутаций R65L+М182Т, в отношении антибиотиков пенициллина, цефалотина, цефтазидима и хромогенного субстрата CENTA. Мутации остатков 65 и 182 не приводят к расширению профиля субстратной специфичности по сравнению с нативным ферментом ТЕМ-1: сохраняется ферментативная активность в отношении пенициллина и цефалоспоринов I поколения (цефалотин, CENTA), отсутствует активность в отношении цефтазидима (цефалоспорин III поколения). Отличие наблюдается только в пониженной каталитической эффективности гидролиза хромогенного субстрата CENTA, являющегося произфодным цефалотина, в основном, вследствие снижения значения kкат. Пониженная каталитическая активность может быть связана с увеличенной подвижностью омега-петли. 6. Изучена термодинамическая стабильность и термоинактивация полученных рекомбинантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа. Замена R65L приводит к резкому уменьшению стабильности фермента; замена M182T приводит к повышению термостабильности и способности к ренатурации; замена M182A на начальном участке кривой инактивации сравнимо с термостабильным мутантом M182T, однако при более длительной инкубации становится сравнимой по стабильности с ферментом дикого типа ТЕМ-1; фермент с двойной заменой R65L+М182Т проявляет наибольшую способность к ренатурации и по этому параметру является наиболее термоустойчивой по сравнению с другими мутантными формами. 7. Расшифрована кристаллическая структура бета-лактамазы ТЕМ-171. Бета-лактамаза TEM-171 представляет клинически значимый мутант, отличающийся заменой V84I от фермента TEM-1. Гидроксильная группа каталитического остатка серина 70 образует тетраэдрическую структуру с тремя молекулами воды. 8. Впервые для бета-лактамаз ТЕМ типа расшифрованы две структуры комплекса ТЕМ-171/тазобактам (I и II), отличающиеся разными временами насыщения кристаллов растворами тазобактама. В комплексах I и II интермедиат тазобактама ковалентно связан с каталитическим остатком S70 в транс-енаминной конфигурации. Структура белка в комплексе I практически идентична нативной структуре, а конформация интермедиат тазобактама похожа на структуру ранее полученную для β-лактамазы GES-2. В комплексе II, полученном после более длительной инкубации нативных кристаллов в растворе ингибитора, интермедиат тазобактама образует больше связей с активным центром фермента, и его конформация стабилизируется дополнительным стекинг взаимодействием с Y105, что подтверждается данными по тушению флуоресценции. Полученные результаты создают дополнительную структурную основу для рационального дизайна новых ингибиторов бета-лактамаз молекулярного класса А. 9. Проведена оптимизация методик выделения рРНК из клинических штаммов и методики получения кДНК методом обратной транскрипции. Показана необходимость включения дополнительных контролей чистоты препаратов выделенной РНК и реагентов, используемых для амплификации генов, на наличие примесной ДНК бета-лактамаз. Экспериментальные исследования разработанной методики применены для трех клинических штаммов бактерий K. рneumonia, которые культивировали в присутствии бета-лактамных антибиотиков, а также без антибиотика. Проведен сравнительный анализ профилей ДНК и РНК-транскриптов бета-лактамаз у выбранных клинических штаммов K. Рneumonia. Анализ РНК-транскриптов показал различный уровень экспрессии бета-лактамаз разных типов в зависимости от локализации гена и наличия антибиотика в среде. | ||
| 5 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам |
| Результаты этапа: 1. Проведен анализ научной литературы и баз данных последовательностей бета-лактамаз о структуре и свойствах сериновых бета-лактамаз TEM-типа, относящихся к молекулярному классу А. Локализация остатков, мутации которых приводят к изменению активности и специфичности бета-лактамаз, в петлях белковой глобулы обуславливает интерес к ним как к потенциальным объектам для воздействия на фермент. Одной из функционально важных петель является омега–петля, образованная остатками Arg164-Asp179 и расположенная на стыке 2-х доменов в нижней части входа в активный центр фермента. Конформация омега–петли определяет субстратную специфичность ферментов этого класса. Данная петля встречается у бета-лактамаз различных молекулярных классов, ее пространственная укладка похожа у разных ферментов, она обращена во внешнюю среду и является иммуногенной. В рамках настоящего Проекта омега–петля рассматривается как новая аллостерическая мишень для направленного воздействия на бета-лактамазы с целью ингибирования активности. 2. Проведена систематизация рабочей коллекции мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа, включающей 36 штаммов E.coli, продуцирующих 30 вариантов рекомбинантных бета-лактамаз ТЕМ типа (молекулярный класс А), 3 варианта бета-лактамаз СТХ-М типа (молекулярный класс А), 2 варианта карбапенемаз – VIM-4 и NDM-1 (молекулярный класс В).Коллекция штаммов-продуцентов включена в Депозитарий живых систем Проекта Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова "Ноев Ковчег". 3. С целью оптимизации условий кристаллизации были наработаны препаративные количества бета-лактамаз ТЕМ типа: (ТЕМ-1; ТЕМ-12, содержащей замену R164S; ТЕМ-18, содержащей замены Q39K+ E104K; бета-лактамаза, содержащая замены R65L+M182T; и бета-лактамаза с заменой M182E). 4. Оптимизированы условия кристаллизации орторомбической кристаллической формы бета-лактамаз ТЕМ типа. Полученные кристаллы бета-лактамаз принадлежали к пространственной группе P212121 с параметрами элементарной ячейки a=42.27 b=63.46 c=89.77, α=β=γ=90°, что совпадает с литературными данными. 5. Методами молекулярной динамики исследованы изменения структуры, подвижности и внутрибелковых взаимодействий у бета-лактамаз ТЕМ типа с мутациями в положении 244 и сочетанием мутаций в положениях 104 и 39, для которых ранее экспериментально было показано, соответственно, существенное падение каталитической активности и термостабильности. Для этого были рассчитаны значения среднеквадратичных отклонений (RMSD) и флуктуаций (RMSF) аминокислотных остатков, а также количество образующихся водородных связей. Из полученных траекторий МД было выделено по 50 «промежуточных» усредненных конформаций исследуемых белков, на основе которых были построены и проанализированы сети внутрибелковых взаимодействий (RIN). Для ключевых участков белка были построены отдельные карты RIN и предложены пути передачи сигнала от мутированных остатков до остатков активного центра и омега-петли. 6. Исследовано динамическое поведение бета-лактамазы ТЕМ-1 в трех комплексах с синтетическим хромогенным субстратом CENTA, являющимся производным антибиотика цефалотина: перед каталитическим актом, в фермент-субстратном комплексе и с продуктом его гидролиза. В ходе динамики наблюдали процесс выхода продукта реакции из активного центра фермента: на первом этапе наблюдали формирование пи-стекинг взаимодействия продукта с остатоком Tyr105, которое потом разрывалось, способствуя выходу продукта, второе изменение контактов касалось образования и потом разрыва водородной связи продукта с остатком омега-петли Glu166. Появление новой водородной связи продукта гидролиза с данным остатком, по-видимому, способствует выходу его из активного центра. Это согласуется с ранее полученными данными рентгеноструктурного анализа о строении интермедиатов комплекса ингибитора тазобактама в активном центре бета-лактамазы ТЕМ-171 и об участии остатка Tyr105 в стэкинг-взаимодействии с молекулой тазобактама. 7. Осуществлён подбор специфических праймеров для проведения амплификации гена, кодирующего двух химерных конструкций, состоящей из омега-петли бета-лактамазы ТЕМ-1 и белка-носителя (БСЖК – белок, связывающий жирные кислоты), соединённых линкерной последовательностью (Gly4Ser)3. Проведено клонирование соответствующих генов в экспрессионный вектор системы рЕТ. Созданы рекомбинатные штаммы E.coli – продуценты химерных белков на основе БСЖК, содержащих омега-петлю. Разработана методика выделения и очистки, позволяющая получать 30 мг целевого рекомбинантного препарата БСЖК-омега-петля с 1 литра культуры клеток E.coli. 8. Проведён новых аллостерических ингибиторов бета-лактамаз методом виртуального скрининга in silico с использованием нескольких библиотек низкомолекулярных лигандов. В качестве мишени в структуре бета-лактамазы ТЕМ типа найден потенциальный аллостерический сайт, расположенный рядом с омега-петлей. Проведен рациональный химический дизайн производных феноксианилинов и тиомочевины для поиска новых ингибиторов аллостерического центра, выявленного на первом этапе Проекта. При изучении их нигибирующей способности были выявлены следующие закономерности: изменение заместителей в арильном фрагменте молекулы приводит к снижению ингибирующей активности лиганда; оптимальная длина углеводородородного фрагмента соответствует двум атомам углерода. Лучшую ингибирующую активность показали четыре производных тиомочевины, являющиеся хлор-производными. 9. Проведена оптимизация гибридизационного анализа на биочипах низкой плотности с колориметрической детекцией на основе пероксидазы хрена для количественного определения уровня экспрессии генов бета-лактамаз ТЕМ типа. Проведена оптимизация метода количественной обработки гибридизационных сигналов для увеличения динамического диапазона их значений. Изучены пять математических алгоритмов цифрового перевода оттенков синего цвета в шкалу оттенков серого цвета. Применение данного алгоритма позволило увеличить шкалу сигналов на примерно 30 % по сравнению с ранее использованным алгоритмом. Проведена оптимизация структуры специфического олигонуклеотидного зонда. Получена градуировочная зависимость интенсивности гибридизационных сигналов от концентрации мРНК бета-лактамаз ТЕМ типа в лабораторном штамме E. сoli. В качестве контроля экспрессии бета-лактамазы определяли активность фермента в периплазматических фракциях, выделенных из этих же клеток, в реакции гидролиза антибиотика ампициллина. Метод апробирован с использованием набора образцов мРНК, выделенных их трех клинических штаммов K. pneumoniae, устойчивых к разным бета-лактамным антибиотикам. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".