ИСТИНА

Противоопухолевые антибиотики занимают важное место среди препаратов, используемых в химиотерапии онкологических заболеваний. Очень важно определение клеточных мишеней и понимание механизма действия этих препаратов. Ранее было показано, что эти препараты, нарушая структуру двойной спирали, оказывают влияние на процессы репликации и транскрипции. Открытие новых аспектов механизма действия этих соединений значительно расширит потенциал их терапевтического применения. В проекте впервые будет детально исследовано влияние перспективных противоопухолевых препаратов, обладающих способностью связываться с ДНК, на функционирование одного из важнейших ДНК-оперирующих ферментов - метилтрансферазы (МТазы) Dnmt3a in vitro. Будут исследованы препараты, интеркалирующие в двойную спираль (доксорубицин и кураксин) и располагающиеся в малой бороздке (производное оливомицина А LCTA-1599). Влияние этих соединений на действие МТаз не изучалось. Вместе с тем, МТаза Dnmt3a может быть чувствительна к такого типа нарушениям структуры ДНК. Это подтверждают полученные в нашей лаборатории данные об ингибировании Dnmt3a малобороздочными ДНК-лигандами - димерными бисбензимидазолами, а также ухудшение метилирования этим ферментом ДНК субстратов, поврежденных интеркалирующим канцерогеном бензо[а]пиреном. Будет проведено связывание и метилирование специально сконструированных ДНК-субстратов МТазой Dnmt3a в присутствии исследуемых противоопухолевых препаратов. Мы ожидаем, что метилирование ДНК-субстратов МТазой Dnmt3a будет ингибироваться как интеркалирующими препаратами доксорубицином и кураксином, так и малобороздочным лигандом LCTA-1599. Информация о влиянии рассматриваемых нами препаратов на метилирование, катализируемое МТазой Dnmt3a, расширит понимание механизма их действия, откроет пути к персонализированной таргетированной терапии рака, комбинированному использованию эпигенетической и традиционной терапии рака, поможет искать новые пути преодоления устойчивости к традиционным лекарствам.

Antitumor antibiotics occupy an important place among the drugs used in the treatment of oncological diseases. It is very important to determine the cellular targets and to understand the mechanism of action of these drugs. It was shown earlier that these drugs influence the processes of DNA replication and transcription by disturbing the structure of the double helix. The discovery of new aspects of the mechanism of action of these compounds will greatly expand their potential for therapeutic application. The project will, for the first time, thoroughly investigate the effect of promising DNA binding antitumor agents on the functioning of one of the most important DNA-operating enzymes – DNA methyltransferase (MTase) Dnmt3a in vitro. DNA intercalating agents (doxorubicin and curaxin CBL0137) and minor groove binders (olivomycin A derivative LCTA-1599) will be investigated. The impact of these compounds on the functioning of MTases has not been studied before. However, Dnmt3a may be sensitive to these types of structural perturbations of DNA. This is confirmed by the data that were obtained in our laboratory. These data indicate inhibition of Dnmt3a by minor groove binders, dimeric bisbenzimidazoles, as well as the reduction of Dnmt3a-catalyzed methylation rate of DNA damaged by intercalating carcinogen benzo[a]pyrene. The binding and methylation of specially designed DNA substrates by Dnmt3a in the presence of the antitumor drugs will be conducted. We expect that the methylation of DNA substrates by Dnmt3a will be inhibited both by intercalating agents curaxin CBL0137 and doxorubicin and by the minor groove binder LCTA-1599. Information on the impact of these drugs on Dnmt3a-catalyzed DNA methylation will broaden understanding of their mechanism of action, open the way for personalized targeted cancer therapy through the combined use of epigenetic and traditional cancer therapy and help to find new ways to overcome resistance to traditional drugs.

Одним из наиболее эффективных подходов для лечения раковых заболеваний является химиотерапия с использованием соединений, интеркалирующих в ДНК. Таким соединением является антрациклиновый антибиотик доксорубицин. В основном, ДНК-интеркаляторы нацелены на ингибирование ДНК-полимераз и топоизомераз, что приводит к апоптозу раковых клеток. В случае интеркалирующего соединения кураксина, обладающего противоопухолевой активностью, наблюдается сложная цепь событий, приводящая к нарушению гистонового кора нуклеосом и активации р53. В нашей лаборатории в совместных работах с Нью-Йоркским университетом были охарактеризованы последствия ковалентного присоединения к CpG-участкам ДНК канцерогена бензо[а] пирена и показана разная локализация изомеров канцерогена по отношению к двойной спирали: интеркалирующая для цис-изомеров и малобороздочная для транс-изомеров. В обоих случаях наблюдалось ингибирование МТазы Dnmt3a (Minero et al,2015). Учитывая этот опыт, мы ожидаем, что метилирование ДНК МТазой Dnmt3a будет ингибироваться как антрациклиновым антибиотиком доксорубицином, так и кураксином. В любом случае, информация, полученная в опытах in vitro, может представлять интерес как новый механизм активности интеркалирующих противоопухолевых агентов, которые повреждают ДНК. Таким образом, Dnmt3a можно рассматривать как одну из мишеней действия доксорубицина и кураксина. Можно предположить, что уровень экспрессии Dnmt3a в раковых клетках будет оказывать влияние на эффективность лечения доксорубицином. Тогда по этому параметру можно будет оценивать цитотоксичность лекарства и корректировать его дозы. В случае малобороздочного ДНК-лиганда оливомицина А в своих прогнозах о его ингибирующем действии мы опираемся на данные нашей лаборатории по эффективному ингибированию МТазы Dnmt3a малобороздочными ДНК-лигандами –димерными бисбензимидазолами разной структуры (Cherepanova et al, 2010 и Ivanov et al, 2015).

В нашей лаборатории ведется планомерное исследование ингибирования С5-МТаз с целью выявления новых противораковых препаратов, а также исследование влияния уже известных противораковых лекарств на функционирование ДНК-метилтрансфераз (Кирсанова и др, 2009). Нами было открыто, что эффективного ингибирования метилирования можно достигать, используя малоборозночночные ДНК-лиганды. Например, в качестве таких ингибиторов были исследованы целые серии димерных бисбензимидазолов DB(n) и DBP(n), которые состоят из двух остатков аналога красителя Хёхст 33258, соединенных линкерами различной длины. В микромолярных количествах они ингибировали метилирование синтетического односайтового ДНК-субстрата МТазами Dnmt3a и SssI. Обнаружено, что они не токсичны для клеток, мало влияют на глобальное метилирование ДНК в клетках, но могут снижать метилирование отдельных участков (Дарий и др., 2013; Ivanov et al, 2015). Из реальных противораковых препаратов в нашей лаборатории были детально исследованы пиримидинон-2 (Р, зебуларин) и 6-тиогуанин (SG). Они проявляют свое ингибирующее действие только будучи встроенными в ДНК-субстрат в определенную позицию по отношению к цитозину-мишени. Пиримидинон-2 относится к механизмзависимым ингибиторам. Ингибирующую активность Р-ДНК изучали как по оценке эффективности образования конъюгатов Р-ДНК с МТазами, так и по влиянию добавления ингибиторных Р-ДНК на метилирование ДНК-субстратов этими ферментами (Subach et al, 2004). Детально исследовано влияние SG на функционирование МТазы Dnmt3a. SG включали в один или в два CpG-участка узнавания Dnmt3a вместо остатка гуанина, что приводило к ухудшению скорости метилирования, при этом SG не влиял на формирование фермент-субстратных комплексов. Интересно, что другие модификации остатка гуанина рядом с цитозином-мишенью, например, 8-оксогуанин, O6-метилгуанин и аддукты гуанина с бензо[a]пирендиолэпоксидами также влияли на функционирование Dnmt3a.