ИСТИНА

Основным методом изучения влияния антикоагулянтов на каскад коагуляции является тест генерации тромбина - методика, позволяющая оценить динамику изменения концентрации тромбина в плазме крови человека, образующегося после запуска каскада коагуляции и инактивируемого отрицательными обратными связями каскада коагуляции. Концентрация тромбина оценивается по флуоресценции расщепленного флуорогенного субстрата тромбина на основе калибровочной кривой, полученной для коммерческого стандартного образца тромбина. Кривая генерации тромбина имеет несколько характерных параметров - лаговое время (время до генерации тромбина, когда активируются факторы коагуляции), время пика (время достижения максимальной концентрации тромбина), максимальная концентрация тромбина, скорость генерации тромбина, эндогенный потенциал плазмы крови (площадь кривой генерации тромбина, пропорциональная количеству образовавшегося тромбина и времени до его полной инактивации отрицательными обратными связями каскада коагуляции). В качестве вспомагательных тестов планируется использовать: - коагуляционные тесты (медицинские тесты определения времени, необходимого для срабатывания каскада коагуляции после его запуска разными реагентами): тесты тромбинового времени, протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени; - турбидиметрический метод определения активности тромбина по его способности гидролизовать фибриноген, метод позволяет изучать ингибиторы тромбина, определять константу и тип ингибирования; - гидролиз хромогенного и флуорогенного субстратов факторов каскада коагуляции крови - для изучения ингибиторов факторов свертывания, отличных от тромбина, а также контрольных опытов. Предлагается исследовать вышеперечисленными методами ингибиторы тромбина, фактора Ха, фактора IXа и др., включая ингибиторы активного центра ферментов (пептидомиметики) и ингибиторы белок-белковых взаимодействий, дестабилизирующих белковых комплексы факторов свертывания (пептиды, белки, ДНК и РНК- аптамеры). Кроме того, будут исследованы плазмы крови человека, дефицитные по факторам свертывания, которые являются моделью ингибирования отдельного фактора в каскаде коагуляции.

Будут изучены ингибиторы Ха и IXа факторов; проведено сравнение их эффективности с эффективностью ингибиторов тромбина; будет изучено влияние комбинаций ингибиторов разных факторов коагуляции работу каскада коагуляции; проведены контрольные опыты и поиск корреляции между эффективностью антикоагулянта и его способностью ингибировать несколько реакций в каскаде коагуляции

В ходе работы будут охарактеризованы прямые антикоагулянты: ингибиторы тромбина, фактора Ха, фактора IXа и др., включая ингибиторы активного центра ферментов (пептидомиметики) и ингибиторы белок-белковых взаимодействий, дестабилизирующих белковых комплексы факторов свертывания (пептиды, белки, ДНК и РНК- аптамеры). Работа позволит сравнить разные типы антикоагулянтов в идентичных условиях и сравнить их эффективность. Особенное внимание будет уделено влиянию антикоагулянтов на интегральный ответ каскада коагуляции: возможное избирательное ингибирование положительных и/или отрицательных обратных связей каскада. Эти данные позволят объяснить разную эффективность антикоагулянтов с близкими константами ингибирования, а также объяснить разную величину терапевтического окна антикоагулянтов. Будут охарактеризованы плазмы крови человека, дефицитные по факторам свертывания. Сравнение результатов для дефицитной плазмы и плазмы с антикоагулянтом позволит выявить ингибирование антикоагулянтом обратных связей каскада, что приводит к усилению или ослаблению эффекта ингибирования каскада коагуляции. Будут изучены комбинации разных типов антикоагулянтов, потенциально дающие синергетический эффект, что потенциально позволяет снизить дозировку антикоагулянтов.