ИСТИНА

Разработка комплекса высокочувствительных спектроскопических, хроматографических и электрохимических методов определения содержания органических и неорганических веществ в объектах окружающей среды, медицины и материаловедения

Разработаны новые способы сорбционного концентрирования и определения веществ, в том числе с использованием наночастиц. Предложен сорбционный способ синтеза новых композитных наноматериалов на основе пенополиуретана (ППУ) и наночастиц (НЧ) золота и серебра, стабилизированных цитратом натрия и 6,6-ионеном. При выборе условий синтеза варьировали количество наночастиц и их природу, объем раствора и время сорбции. Показано, что количественная (95 – 100 %) сорбция наночастиц достигается через 20 мин контакта фаз из растворов, содержащих не более 35 – 40 мкг/мл НЧ. Емкость ППУ по отношению к НЧ составляет 8 – 9 мг/г сорбента. С помощью электронно-микроскопических исследований установлено, что наночастицы размером 15 – 25 нм равномерно распределены по поверхности сорбента. Изучены спектральные характеристики ППУ, модифицированного наночастицами золота. Обнаружено, что наночастицы в фазе ППУ сохраняют способность к поверхностному плазмонному резонансу и агрегации под воздействием тиосоединений (цистеамина, цистеина, ацетилцистеина и меркапопропионовой кислоты), но, в отличие от водных растворов, не агрегируют в присутствии соединений катионной природы и анионов. Высказано предположение, что изменение селективности агрегации наночастиц в матрице ППУ по сравнению с растворами может быть связано с их более тесным расположением на поверхности сорбента («предорганизованностью» к агрегации), отсутствием избыточного количества стабилизатора, а также особенностями сорбционного поведения ППУ, не способного сорбировать заряженные соединения. Так, с использованием полученных таким образом сорбентов разработаны методы извлечения ряда биологически активных соединений для последующего определения их содержания. С применением спектроскопии диффузного отражения разработаны методики определения цистеамина, цистеина, ацетилцистеина и меркапопропионовой кислоты с пределами обнаружения 0.002, 0.01, 0.03 и 0.05 мкг/мл соответственно. Методики применены для определения цистеина в лекарственных препаратах («Перфалган» и «NAC complex») и пивных дрожжах и ацетилцистеина в лекарственном препарате «АЦЦ Лонг». С целью поиска нового спектрофотометрического реагента для определения катехоламинов предложен способ синтеза нанопалочек золота (НП Au), оценены их геометрические параметры и спектрофотометрические характеристики. Установлено, что синтезированные НП имеют длину 38 нм, диаметр 14 нм и характеризуются интенсивными полосами поверхностного плазмонного резонанса при 520 и 650 – 700 нм, которые отвечают поперечным и продольным плазмонным колебаниям соответственно. Систематически изучено взаимодействие различных катехоламинов (адреналина, норадреналина, допамина и добутамина) с нитратом серебра в присутствии синтезированных нанопалочек. Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что в результате такого взаимодействия для всех изученных катехоламинов наблюдается увеличение размеров нанопалочек золота и изменение их формы – средний диаметр увеличивается на 3 нм, а длина – на 2 нм, соотношение длины и диаметра уменьшается с 2,8 до 2,4. Высказано предположение, что наблюдаемые изменения являются результатом отложения на поверхности НП слоя серебра, восстановленного под воздействием катехоламинов. Описанные эффекты сопровождаются изменением окраски раствора нанопалочек от бледно-розовой до ярко-зеленой. В спектрах поглощения: наблюдаются изменения, проявляющиеся в гипсохромном сдвиге длинноволнового максимума и увеличении ее интенсивности. Выбраны оптимальные условия проведения реакции: рН и состав раствора, концентрации AgNO3, нанопалочек и катехоламинов, время взаимодействия (рН 9, глициновый буферный раствор, сAgNO3 = 80 мкМ, сНПAu = 8,5 мкг/мл , 3 мин с момента начала реакции). Зависимость величины сдвига длинноволнового максимума в спектре ППР от концентрации катехоламинов предложено использовать в качестве аналитического сигнала при спектрофотометрическом определении катехоламинов. Пределы обнаружения составили 13, 16, 18 и 27 нг/мл для допамина, норадреналина, адреналина и добутамина соответственно. Проведена оценка селективности разработанных методик. Проведено определение адреналина и допамина в медицинских препаратов «Адреналин гидрохлорид» и «Допмин» соответственно. Осуществлен синтез магнитных полимерных сорбентов на основе сверхсшитого полистирола (ССПС) с разным содержанием наночастиц Fe3O4 в матрице полимера. Методом низкотемпературной адсорбции азота определены удельная поверхность и параметры пористой структуры магнитных сорбентов. Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что наночастицы Fe3O4 располагаются на поверхности сферических частиц ССПС в виде кластеров. Показано, что магнитные сорбенты на основе ССПС проявляют суперпарамагнитные свойства. Проведено сравнение сорбционного поведения тетрациклинов на ССПС, магнитном сорбенте ССПС/Fe3O4 и наночастицах Fe3O4 в зависимости от времени контакта фаз, рН раствора, объема анализируемого раствора и концентрации сорбатов. Показано, что на магнитном сорбенте ССПС/Fe3O4 и частицах Fe3O4 тетрациклины сорбируются в цвиттер-ионной форме. Показано, что магнитный сорбент ССПС/Fe3O4(5%) можно использовать для группового концентрирования тетрациклинов методом магнитной твердофазной экстракции. Степени выделения тетрациклинов из 100 мл водных растворов с использованием 20 мг магнитного ССПС и смеси ацетонитрила и метанола (1:1) в качестве элюента составили 94 – 100 %. Реализовано сочетание сорбционного концентрирования тетрациклинов на магнитном сверхсшитом полистироле с их определением в элюате методом ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием (хроматограф «Цвет-Яуза-04»). При концентрировании из 100 мл пределы обнаружения составляют 4 – 7 нг/мл. Правильность методики подтверждена методом “введено-найдено” на модельной смеси, приготовленной на основе речной воды (р. Москва). Разработана ВЭЖХ-ДМД-МС методика определения моно- и диалкилфталатов в водах. Для одновременного масс-спектрометрического детектирования положительно заряженных молекулярных ионов диалкилфталатов и отрицательно заряженных ионов моноалкилфталатов использован режим двойной ионизации – DUIS (ESI+APCI). Пределы обнаружения аналитов составили от 0,3 до 1 мг/л. Изучена десорбция моно- и диалкилфталатов с углеродного сорбента Hypercarb ацетонитрилом при комнатной температуре и субкритической водой (без добавок и с добавками в 5 и 10% ацетонитрила) в диапазоне температур 150-200 °C. Построены off-line кривые десорбции фталатов; получены данные о степенях десорбции и степенях гидролиза аналитов. На основании этих данных выбраны условия, позволяющие десорбировать наибольшее число аналитов при минимальной суммарной степени их гидролиза: температура десорбции 150 °C, объем десорбирующего раствора 5 мл, добавка ацетонитрила к субкритической воде 5% (по объему). В этих условиях возможно концентрирование фталевой кислоты, четырех моноалкилфталатов (метил-, этил-, бутил- и циклогексил-), диметил- и диэтилфталата. Предложен способ on-line концентрирования и ВЭЖХ-УФ определения фталевой кислоты, монометилфталата, моноэтилфталата и монобутилфталата. Способ включает извлечение аналитов на колонке с пористым графитированным углеродным сорбентом Hypercarb, десорбцию субкритической водой при температуре 150 °C, охлаждение концентрата и его подачу в ВЭЖХ колонку, где происходит фокусирование пиков аналитов. Модель сольватационных параметров Абрахама была использована для получения корреляционных зависимостей, связывающих параметры удерживания ряда модельных соединений на поверхности пористого графитированного углеродного сорбента Hypercarb в среде субкритической воды с их молекулярными константами, характеризующими способность аналитов к различным типам межмолекулярного взаимодействия. Аналогичные данные получены также для смесей «метанол-вода» и «ацетонитрил-вода» при комнатной температуре. Проведено сопоставление этих параметров, показано, что для системы с ацетонитрилом при комнатной температуре наибольший вклад в удерживание аналитов вносит параметр E, характеризующий поляризуемость вещества; а для системы с субкритической водой вклад этого параметра в удерживание существенно снижается, и проявляется сильная корреляция удерживания аналита с его молекулярным объемом. В системе с субкритической водой по сравнению с системой «ацетонитрил-вода» проявляется существенно больший вклад в удерживание параметра А, который характеризует способность аналита к участию в водородных связях в качестве донора водорода. Полученные зависимости могут быть использованы для предсказания условий (температуры и объема субкритической воды), необходимых для количественной десорбции того или иного аналита. Показана возможность определения синтетических пищевых красителей Понсо 4R, Тартразин, Желтый «солнечный» закат, Хинолиновый желтый и Зеленый прочный FCF, основанного на их сорбционном извлечении из растворов на кремнеземе, химически модифицированном гексадецильными группами (С16), и последующем их определении на поверхности сорбента методом спектроскопии диффузного отражения. На примере анализа напитков, а также парфюмерном средстве и капсулах лекарственного препарата установлено, что гидрофобизированный кремнезем является перспективным сорбентом для выделения и концентрирования пищевых красителей, который позволяет одновременно извлекать красители из сложных матриц и проводить определение непосредственно на его поверхности с использованием спектроскопии диффузного отражения. Разработаны хроматографические методы определения некоторых веществ. Предложена схема проведения послеколоночной реакции комплексообразования тетрациклинов с ионами магния, и флавоноидов с ионами алюминия в различных микроэмульсионных средах с последующим флуориметрическим детектированием. Способ опробован и метрологически оценен на примере определения тетрациклина, окситетрациклина и доксициклина в коровьем молоке на уровне ПДК без концентрирования. Разработаны новые подходы к синтезу анионообменников для ионной хроматографии с ковалентно закрепленными гиперразветвленными функциональными ионообменными слоями различного строения. Показано, что выбор первичного амина и диглицидилового эфира, а также числа слоев обеспечивает возможность варьирования структуры слоя и управления селективностью и эффективностью получаемых анионообменников. В результате получены анионообменники, позволяющие проводить разделение 7 стандартных анионов, оксигалогенидов и органических кислот. Разделение 14 анионов (фторида, гликолята, ацетата, формиата, хлорида, бромата, нитрита, бромида, нитрата, хлората, сульфата, фосфата) менее чем за 30 минут, а 7 стандартных анионов, а также ацетата и формиата менее чем за 9 минут. Разработаны подходы к получению анионообменников на основе силикагеля с различным вариантом закрепления полимерного анионообменного слоя. В качестве полимера использован полиэтиленимин, а закрепление осуществляется: (1) ковалентно с помощью диглицидиловых эфиров в качестве спейсеров, (2) адсорбционно с последующей сшивкой слоя полимера диглицидиловым эфиром, (3) электростатически с предварительной кватернизацией полиэтиленимина галогеналканами. Показано, что наилучшей стабильностью характеризуются сорбенты с ковалентным закреплением слоя и с адсорбционным вариантом закрепления с последующей сшивкой. Полученные анионообменники позволяют проводить разделение 12-13 анионов менее чем за 30 минут с эффективностью до 60 тыс. тт/м. Предложены и синтезированы новые сорбенты на основе аминированного силикагеля с различными ковалентно привитыми функциональными группами для гидрофильной хроматографии. Найдены условия разделения аминокислот, сахаров и витаминов на полученных сорбентах. Разделение семи аминокислот возможно за 9 минут при использовании в качестве элюента смеси CH3CN–2мМ фосфатный буферный раствор, pH 6,5 и УФ детектировании при 210 нм. Выбраны условия разделения водорастворимых витаминов: программа градиентного элюирования подвижной фазой, состоящей из смеси ацетонитрила и ацетатно-аммонийного буферного раствора (100 мМ, pH 5,8), УФ детектирование при 244 и 270 нм. Продемонстрирована возможность применения разработанных сорбентов для количественного определения сахаров в соках и чайных напитках. Показано, что синтезированные сорбенты превосходят по селективности хроматографического разделения аминокислот свои коммерческие аналоги (YMC Polyamine II и Luna HILIC), а также не уступают им в эффективности хроматографического разделения. Получены и исследованы новые сорбенты для ВЭЖХ: силикагель С16, модифицированный наночастицами золота, стабилизированными 6,10-ионеном, и силикагель С16, послойно модифицированный наночастицами золота, стабилизированными 6,10-ионеном и бычьим сывороточным альбумином. Методами элементного анализа, спектрофотометрии и диффузного отражения подтверждено образование модифицирующих слоев на поверхности силикагеля.Исследовано влияние рН и содержание ацетонитрила в подвижной фазе на разделение азотсодержащих соединений и фенолкарбоновых кислот. Разделены 6-компонентная смесь азотсодержащих соединений (карбиноксами, тербуталин, орфенадрин, кофеин, надолол, пиндолол) и 5-компонентная смесь фенолкарбоновых кислот (галловая, феруловая, кофеиновая, бензойная, салициловая) на колонке с силикагелем С16, послойно модифицированным наночастицами золота, стабилизированными 6,10-ионеном и бычьим сывороточным альбумином.за 15 минут в изократическом режиме. Показана возможность разделения смеси азотсодержащих соединений и фенолкарбоновых кислот в градиентном режиме. Исследовано разделение энантиомеров производных аминокислот на хиральном сорбенте с макроциклическим антибиотиком эремомицином методом ВЭЖХ. Установлены зависимости хроматографических параметров энантиомеров производных аминокислот от состава подвижной фазы (рН буферного раствора, его концентрация, объемная доля органического модификатора, его природа). Установлено влияние структуры самой аминокислоты и структуры радикала производного на энантиоразделение таких производных аминокислот, как БОК-, бензоил-, КБЗ-. Высокие селективность и эффективность, особенно при разделении КБЗ-производных аминокислот, показывают, что данный сорбент перспективен для их препаративного разделения. Простые элюенты, состоящие из растворов трех- и четырехосновных кислот (лимонной и пиромеллитовой кислот и кислот ряда комплексонов – нитрилтриуксусной (НТА), этилендиаминтетрауксусной (ЭДТА), циклогексан-1,2-диамин-N,N,N,N-тетрауксусной (ЦГДТА)) или их двухкомпонентных смесей применены для хроматофокусирования ионов металлов на комплексообразующем сорбенте Tetren-SiO2 (Силохром С-120 с привитыми группами тетраэтиленпентамина). Достигнуто разделение ионов Mn2+, Cr3+, Co2+ и Ni2+ при использовании простого двухкомпонентного элюента. Показана применимость простых подвижных фаз на основе 1-2 мМ растворов Н2С2О4 для создания квазилинейного градиента рН на анионообменном сорбенте Tetren-SiO2 при хроматофокусировании изоформплазминогена, имеющих близкие значения pI (5,82 и 5,66). Достигнуто разделение менее плотной активной изоформы – профибринолизина и неактивной, содержащей глутамин в концевой цепи. Разрешение хроматографических пиков изоформ составило 1,65. Разработаны схемы разделения в варианте «Зеленой хроматографии» физиологически активных компонентов лекарственных растений (и продуктов на их основе), как женьшень (американский и азиатский), лимонник, элеутерокок, и др. В развитие группового масс-спектрометрического анализа, изучены закономерности удерживания на силикагелевых и полимерных колонках на примере тритерпеновых сапонинов. Изучено масс-спектрометрическое поведение гинсенозидов женьшеня. Разработаны способы их извлечения из различных объектов со сложной матрицей. Для повышения чувствительности возможно использование режима селективного ионного мониторинга основных фрагментных сигналов для каждого типа гинсенозидов. Разработаны новые подходы к обнаружению, идентификации и определению метилфосфоновой кислоты и ее эфиров в почве, глине и воде с применением метода ВЭЖХ-МС/МС. Показана возможность использования В/М («вода в масле») микроэмульсий в микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) для определения гидрофильных веществ как ионогенного, так и нейтрального характера. Предполагается, что разделение нейтральных гидрофильных веществ основано на распределении их между органической фазой бутанола-1 и водными каплями. В случае смеси веществ ионогенного характера разделение аналитов, вероятно, основано как на различии в собственной подвижности ионов, так и распределении их между каплями микроэмульсии и органической фазой. Изучено влияние состава микроэмульсий, используемых в качестве фоновых электролитов вВ/М МЭЭКХ, на селективность и эффективность разделения неорганических анионов. Показано, что порядок миграции аналитов значительно различается для методов МЭЭКХ с использованием микроэмульсий типа «вода в масле» и «масло в воде». Установлено, что скорость миграции неорганических анионов в В/М МЭЭКХ на порядок меньше по сравнению с методами КЗЭ и М/В МЭЭКХ. Продемонстрирована возможность сочетания различных вариантов он-лайн концентрирования с В/М МЭЭКХ. Стэкинг c усилением поля позволяет снизить пределы обнаружения анионов в 10-15 раз, электростэкинг – до 103 раз. Предложен новый вариант концентрирования полярных веществ неионогенной природы – свипинг в методе В/М МЭЭКХ. Отмечено значительное ускорение реакций в микроэмульсионной среде на примере дериватизации различных веществ. Показана возможность проведения реакции антибиотиков с НДА в режиме он-лайн в среде М/В и В/М микроэмульсий, подобраны условия, позволяющие достичь количественного выхода продуктов реакции. Продемонстрирована возможность сочетания концентрирования определяемых компонентов (стэкинг с большим объемом пробы и переключением полярности или электростэкинг) с их последующей дериватизацией в капилляре. Рассчитаны метрологические характеристики предложенного способа определения ампициллина и амоксициллина. Сочетание рассмотренных подходов позволяет снизить пределы обнаружения антибиотиков на два порядка и достичь пределов обнаружения 0.6 мкг/л. Исследованы возможности циклодекстринов (бета-ЦД, гамма-ЦД), сульфо-циклодекстрина (С-бета-ЦД) и гидроксипропил-бета-циклодекстрина (ГП-бета-ЦД) как хиральных селекторов в КЭ. На основании зависимости электрофоретической подвижности тестовых соединений (сальбутамола, фенотерола, формотерола, пеметрекседа) от pH фонового электролита предложено использовать растворы с pH 2,07 и 9,60, в которых соединения мигрируют в виде катионов и анионов, соответственно. Показано, что из четырёх исследованных хиральных селекторов С-бета-ЦД обладает энантиораспознавательной способностью ко всем аналитам, кроме пеметрекседа; ГП-бета-ЦД позволяет разделять формотерол, фенотерол и сальбутамол, бета-ЦД – формотерол, фенотерол, гамма-ЦД – фенотерол, сальбутамол и пеметрексед. Впервые достигнуто энантиоразделение до базовой линии четырёх энантиомеров фенотерола в 100 мМ фосфатном буферном растворе, pH 2,07, концетрацияселектора (ГП-бета-ЦД, бета-ЦД) 20 мМ. Определены кажущиеся константы связывания диастереомеров фенотерола в комплекс (1:1) с С-бета-ЦД при небольших концентрациях селектора (5∙10–5 – 3∙10–4 М): (1,5±0,2)∙104 М-1; (2,0±0,4)∙104 М-1. Для энантиомеров фенотерола также определены константы устойчивости комплексов аналогичной стехиометрии с ГП-бета-ЦД (1–45 мМ): (360±90), (420±90), (450±80) и (400±100). Меньшее значение констант для ГП-бета-ЦД согласуется с необходимостью использования большей концентрации селектора для получения разрешения. Спектрофотометрическим методом изомолярных серий установлен стехиометрический состав (1:2) комплекса фенотерола с С-бета-ЦД и вычислены значения кажущейся константы устойчивости ((2,3±0,3)∙108 М-2) для фенотерола соответственно. Методом флуоресценции определена кажущаяся константа устойчивости комплекса состава 1:2 = фенотерол:С-бета-ЦД (5,3±0,5)∙108 М-2). Константы, рассчитанные по данным, полученным методами спектроскопии, хорошо соотносятся между собой и с результатами, полученными методом капиллярного электрофореза. Предложена схема проведения послеколоночной реакции комплексообразования тетрациклинов с ионами магния, и флавоноидов с ионами Al3+ в различных микроэмульсионных средах с последующим флуориметрическим детектированием. Способ опробован и метрологически оценен на примере определения тетрациклина, окситетрациклина и доксициклина в коровьем молоке на уровне ПДК без концентрирования. На основании зависимостей интенсивности флуоресценции комплексов флавоноидов с ионами Al(III) от природы растворителя показано, что интенсивность флуоресценции комплексов, полученных в среде микроэмульсии в 5, 3 и 3 раза выше для кверцетина, изорамнетина и кемпферола соответственно по сравнению с комплексами, полученными при растворении флавоноидов в смеси ацетонитрил / 0,1M HCl (30/70) и AlCl3 в H2O. Показана перспективность экстракции микроэмульсиями для экспрессного и количественного извлечения биологически активных веществ из продуктов питания, лекарственных препаратов, растительного сырья и биологических жидкостей. Разработан способ количественного извлечения из плазмы крови человека и последующего хроматографического определения фелодипина в плазме крови в диапазоне 0,25 до 10 мкг/мл в режиме МЭЖХ с пределом обнаружения 120 нг/мл. Предложен новый способ определения бензойной и сорбиновой кислот в спредах методом МЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием. При использовании микроэмульсии в качестве экстрагента удалось сократить общее время пробоподготовки в 4 раза при степени извлечения консервантов не менее 95%. Пределы обнаружения бензойной и сорбиновой кислот составили 0,02 и 0,06 мг/кг, соответственно. Продемонстрирована перспективность использования МЭ для количественного извлечения кверцетина из растительного сырья. Степень извлечения кверцетина из шелухи лука составила 98%, а пределы обнаружения 100, 45 и 15 нг/мл для кверцетина, изорамнетина и кемпферола, соответственно. Определено содержание кверцетина в трех видах шелухи лука. На примере анализа майонеза продемонстрировано значительное упрощение процедуры экстракции сорбиновой и бензойной кислот из объектов с высоким содержанием жира при использовании В/М микроэмульсий в качестве экстрагентов. Время пробоподготовки удалось уменьшить с 2 часов до 2 минут при количественном извлечении веществ. Практическое применение электростэкинга в сочетании с В/М МЭЭКХ показано на примере определения йодид-иона в продуктах питания (куриных яйцах, морской капусте). Пределы обнаружения йодида составили 7 мкг/кг куриного яйца и 9 мкг/кг свежей морской капусты, соответственно. Разработана методика электрофоретического определения омепразола и эзомепразола в фармацевтических субстанциях. Разделение проводили в 100 мМ ТРИС-фосфатном буферном растворе (рН=2,54) с добавкой 20 мМ гидроксипропил-β-циклодекстрина. Время анализа составило 20 мин. Площади пиков в диапазоне от 5 до 100 мкг/мл линейно зависят от концентрации. Разработанная методика валидирована. Предложена методика определения карбиноксамина и фенилэфрина в препарате Ринопронт, а также кофеина и бензоата в препарате Кофеин бензоат с хорошей правильностью и прецизионностью (sr не превышает 0,02) на колонке с силикагелем С16, послойно модифицированным наночастицами золота, стабилизированными 6,10-ионеном и бычьим сывороточным альбумином.