ИСТИНА

Фундаментальной научной задачей данного проекта является исследование биологической роли никующих эндонуклеаз (НЭ). Они узнают в двухцепочечной ДНК короткую последовательность нуклеотидов и расщепляют ДНК только в одной цепи. Согласно базе данных эндонуклеаз рестрикции REBASE практически все известные природные НЭ выделены из бактерий рода Bacillus. Этот факт позволяет высказать предположение, что функция НЭ в бациллах состоит не только в формировании гетеродимерных ЭР – компонентов систем рестрикции-модификации, а также в участии в клеточных процессах, связанных с внесением в ДНК одноцепочечных разрывов, таких как рекомбинация и репарация. Установление роли этих ферментов в процессах жизнедеятельности клетки внесет вклад в решение проблемы адаптации бактерий рода Bacillus к изменяющимся факторам внешней среды, позволит варьировать их выживаемость в тех или иных условиях и расширить границы практического применения. Большинство бактерий рода Bacillus в полной мере не охарактеризованы. К ним относится и бактерия Bacillus species D6, обнаруженная в Сахаре, выбранная нами в качестве объекта исследования. В результате экспериментов, проводимых с участием руководителя проекта, из данной бактерии удалось выделить и охарактеризовать НЭ BspD6I. НЭ BspD6I узнает в двутяжевой ДНК последовательность 5'-GAGTC-3'/5'-GACTC-3', которая часто встречается в промоторах фаговых генов, например, бактериофага T7. НЭ BspD6I катализирует гидролиз только «верхней» цепи ДНК после четвертого нуклеотида от участка узнавания в сторону 3'-конца. Учитывая уникальные свойства НЭ, в данном проекте на примере НЭ BspD6I мы предлагаем использовать их как инструмент для изучения механизма действия идеологически родственных им белков MutL с эндонуклеазной функцией – важнейших и малоизученных белков системы репарации «мисматчей» (MMR), а также предлагаем подходы для расширения границ практического использования НЭ. Для решения поставленных задач планируется выполнять исследования в нескольких направлениях. Будет проведена количественная оценка уровня экспрессии НЭ в клетках Bacillus species D6 методом блот-гибридизации в варианте Вестерн. Геном Bacillus species не аннотирован, поэтому будет выполнено его секвенирование. Сравнение последовательности геномов бактерий Bacillus halodurans C-125 и Geobacillus stearothermophilus с установленным нами геномом Bacillus species D6 позволит выявить консервативные и видоспецифические элементы геномов. Полученные результаты позволят установить эволюционную взаимосвязь между бактериями, в которых обнаружены изошизомерные НЭ и их распространенность в природе. Проверка наличия или отсутствия в геноме Bacillus species D6 последовательностей, кодирующих белки системы MMR или вовлеченных в гомологичную рекомбинацию, косвенно прояснит вопрос о функциях НЭ BspD6I в клетке, альтернативных участию этого фермента в процессе рестрикции-модификации. Мы планируем экспериментально выяснить роль НЭ BspD6I в жизненном цикле Bacillus sp. D6. Для этого впервые будет выполнен фенотипический анализ клеток дикого типа Bacillus sp. D6 и мутантного штамма с делецией гена НЭ BspD6I. Для контрольных экспериментов будет получен комплементный штамм, в котором удаленный ген будет «возвращен» в клетку с помощью соответствующей плазмиды. Планируется изучить морфологию колоний, образуемых клетками дикого типа и мутантными штаммами, проанализировать особенности роста этих клеток в различных условиях. Изучение биологической роли НЭ BspD6I может привести к открытию новых аспектов механизмов репарации и к пониманию принципов функционирования социально значимых бактерий из рода Bacillus. Мы впервые предлагаем использовать НЭ BspD6I как инструмент для фундаментальных исследований, а именно для изучения механизма функционирования белка MutL из бактерии Neisseria gonorrhoeae (NgoL), являющейся патогеном человека. Будут сконструированы химерные конструкции, сочетающие в себе домены белков НЭ BspD6I и NgoL и структурированный или подвижный линкер, исследована их способность гидролизовать ДНК и определено место внесения разрыва. Целенаправленное изучение свойств белка NgoL позволит расширить фундаментальное представление о механизме работы немногочисленной группы ферментов, гидролизующих ДНК только в одной цепи, а также в перспективе может быть полезно при создании ингибиторов действия бактерии Neisseria gonorrhoeae. Предложенные оригинальные химерные конструкции могут послужить основой для дизайна ферментов с новой специфичностью узнавания и гидролиза определенных последовательностей ДНК, которые требуются для диагностических целей и редактирования генома. Способность НЭ функционировать в качестве самостоятельных ферментов обусловило их востребованность в молекулярной биологии и биотехнологии. В проекте предлагаются пути расширения границ практического применения этих уникальных ферментов. В частности, предполагается проверить на практике оригинальный прием временного блокирования активности НЭ BspD6I, который может существенно повысить эффективность реакции изотермической амплификации. Суть подхода заключается в использовании в реакции негидролизуемого аналога субстрата НЭ BspD6I («ловушки»), образующего непродуктивный комплекс с ферментом. Кратковременное «включение» этого фермента при повышении температуры за счет диссоциации «ловушки» должно существенно снизить количество побочных продуктов, образующихся за счет возможного увеличения числа участков узнавания НЭ при удлинении ДНК. Все задачи, связанные с определением биологической роли НЭ BspD6I в клетке и разработкой новых подходов использования никующих эндонуклеаз в биотехнологии, сформулированы впервые на основании анализа данных литературы и предварительных результатов, полученных руководителем проекта.

The fundamental scientific goal of this project is studying the biological role of nicking endonucleases (NE). They recognize short sequences in double-stranded DNA and cleave only one strand. According to restriction endonuclease database REBASE almost all known natural NEs are purified from the genus Bacillus. This fact allows to suggest that formation the heterodimeric restriction endonucleases (REs) – the components of restriction-modification system, is not the only role of NEs. They can also participate in the processes involving introduction of single-strand breaks such as recombination and DNA repair. Determining the role of these enzymes in functioning of the cell will clarify a matter of adaptation of Bacillus bacteria to changing environmental factors, allow to control their survival in different conditions and extend the field of their practical application. The major part of bacteria from Bacillus genus is not characterized to the full extent. The object of the study is Bacillus species D6 strain from Sahara Desert. In previous studies NE BspD6I was purified from this strain and its properties were characterized. NE BspD6I recognizes 5'-GAGTC-3'/5'-GACTC-3' sequence that is often present in promotors of the phage genes, such as T7 bacteriophage. NE BspD6I hydrolyzes the “top” DNA strand after 4th nucleotide from the recognition site in 3'-direction. Taking into account these unique properties of NE, we suggest to use NE BspD6I as an instrument for studying the functionally related MutL proteins with endonuclease activity that are important and poorly studied components of mismatch repair system (MMR). We also propose the approaches for wider practical usage of NE. To solve the indicated problems we plan to develop several directions. We will quantitatively assess the NE expression level in Bacillus species D6 by means of Western blot method. The genome of Bacillus species D6 will be sequenced and annotated. The comparison of accessible genomes of Bacillus halodurans C-125 and Geobacillus stearothermophilus with the one of Bacillus species D6 will allow to determine their conservative and unique properties. The obtained results will give the opportunity to establish the evolutionary interrelation for bacteria which possess isoschizomeric NE. The presence or absence of sequences coding MMR proteins or involved in homologous recombination in Bacillus species D6 genome can clarify the issue about NE BspD6I cellular functions that differ from participation in the restriction-modification process. We plan to experimentally determine the role of NE BspD6I in life cycle of Bacillus sp. D6. For this purpose the phenotypic analysis of wild type cells and cells with knockout of the NE BspD6I gene will be performed. For control experiments the complementary strain containing the deleted NE BspD6I gene will be constructed. We plan to study the cell morphology of wild type and mutant strains, analyze the growing peculiarities of the cells in different conditions. Investigating the biological role of NE BspD6I can lead to discovering the new mechanisms of DNA repair and can help to better understand the functioning of socially important bacteria from Bacillus genus. For the first time we suggest to use NE BspD6I as an instrument for fundamental investigations namely for studying the functioning of MutL protein from Neisseria gonorrhoeae (NgoL) that is a human pathogen. We will produce the chimeric proteins combining domains of NE BspD6I, NgoL and firm or flexible linker between them, investigate their ability to hydrolyze DNA and determine the position of hydrolysis. Studying of NgoL functions will allow to broaden the fundamental knowledge about properties of rare enzymes hydrolyzing only one DNA strand. This information can be also helpful for future design of medicine inhibiting the functioning of Neisseria gonorrhoeae. The described original chimeric constructs can also serve as a basis for design of the enzymes with new specificity and hydrolysis of unique DNA sequences that is necessary in diagnostic applications and genome editing. The ability of NEs to function as independent enzymes caused their essential role in molecular biology and biotechnology. We suggest the ways for wider practical use of these enzymes. Particularly we plan to test the original method for temporal blocking of NE BspD6I activity that can substantially increase the efficacy of isothermal DNA amplification reaction. The approach is based on usage of non-hydrolyzable substrate analogue of NE BspD6I (the “trap”) that can form nonproductive complex with the enzyme. The transient “switching on” the enzymatic activity at higher temperatures due to the dissociation of the “trap” should essentially minimize the quantity of by-products which are formed after additional action of NE during DNA amplification. All the tasks related to determination of the NE BspD6I biological role in the cell and developing new approaches for NE application in biotechnology are presented here for the first time on the ground of literature analysis and preliminary data obtained by the leader of the project.

В течение первого года выполнения проекта планируется: - оценить уровень экспрессии НЭ и малой субъединицы BspD6I в клетках Bacillus species D6 методом блот-гибридизации в варианте Вестерн; - выделить геномную ДНК из клеток Bacillus species D6; - проанализировать данные секвенирования геномной ДНК Bacillus species D6, проверить полученную последовательность на наличие в ней генов метилтрансфераз, белков MutS и MutL; - сконструировать плазмиды, кодирующие «химерные» нуклеазы на основе доменов НЭ BspD6I и NgoL; - получить штамм Bacillus species D6, нокаутный по гену НЭ BspD6I. Для этого планируется получить в ходе ПЦР необходимый фрагмент ДНК, состоящий из 5'-концевого участка гена bspD6IN, канамициновой кассеты, 3'-концевого участка гена bspD6IN, подтвердить его структуру секвенированием и провести гомологичную рекомбинацию гена bspD6IN с полученным фрагментом ДНК; - сконструировать комплементный штамм (ΔbspD6IN + bspD6IN) на основе штамма ΔbspD6IN в результате трансформации клетки плазмидой, содержащей ген НЭ BspD6I под контролем ее природного промотора; - подготовить публикацию по полученным результатам.

Абросимова Л.А. является специалистом в области изучения взаимодействия ферментов рестрикции-модификации с ДНК. В ходе исследований она применяет широкий спектр методов молекулярной биологии, генетической инженерии, биоорганической химии и биоинформатики. В своей работе она также использует физические методы, такие как акустическая детекция на пьезоэлектрическом сенсоре и метод «остановленной струи» для изучения быстрой кинетики реакций, и развивает химический подход, заключающийся в необратимой «химической» фиксации того или иного биокомплекса и анализе его свойств. Демонстрацией умения Абросимовой Е.А. успешно сочетать различные методы исследования явилась структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII (Рязанова и др. Мол. Биол. 2010, 44, 911) и ее комплексов с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования и регуляторный участок, а также создание терморегулируемой эндонуклеазы рестрикции SsoII (Abrosimova et al. The FEBS Journal, 2013, 280 (Suppl. 1), 597; Abrosimova et al. IUBMB Life. 2013, 65, 1012). Последние 5 лет объектом исследования является гетеродимерная эндонуклеаза рестрикции BspD6I. Большая субъединица самостоятельно расщепляет одну цепь ДНК, т.е. является никующей эндонуклеазой (НЭ BspD6I) (Abrosimova et al. Biochim Biophys Acta. 2016, 1864, 1072). Установлено, что катализ гидролиза двух цепей ДНК эндонуклеазой рестрикции BspD6I происходит, когда обе ее субъединицы находятся в составе одного фермент-субстратного комплекса, вместе с тем малая субъединица может расщеплять ДНК уже после того, как НЭ «разрезала» свою цепь. Продемонстрировано, что ДНК-дуплексы, содержащие ненуклеозидные вставки с остатком азобензола или триэтиленгликоля в расщепляемом ферментом межнуклеотидном узле, являются негидролизуемыми аналогами субстрата большой субъединицы ЭР BspD6I (Абросимова Л.А. Дисс. канд. хим. наук. Москва. МГУ имени М.В. Ломоносова. 2017 г.,169 с.).

На основании предположения о том, что функция никующих эндонуклеаз (НЭ) в бациллах заключается не только в формировании гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции (ЭР), но и в участии в клеточных процессах, связанных с внесением в ДНК одноцепочечных разрывов, была проведена оценка уровня экспрессии НЭ и малой субъединицы BspD6I в клетках Bacillus species D6 методом блот-гибридизации в варианте Вестерн. Показано избыточное количество НЭ по сравнению с малой субъединицей в клетках Bacillus species D6, что можно рассматривать как аргумент в пользу предположения о существовании дополнительной роли НЭ в клетке. В ходе проекта выделена геномная ДНК из клеток Bacillus species D6 с целью дальнейшего секвенирования полученного образца ДНК. Фирмой «Евроген» успешно проанализирована нуклеотидная последовательность полученной ДНК по технологии секвенирования следующего поколения (next-generation sequencing) на ячейке Illumina MiSeq (Illumina, США). Качество полученных прочтений оказалось высоким, полученные характеристики генома подтвердили его принадлежность к роду Bacillus. Для определения ближайшего гомолога в программе BLASTN выполнено выравнивание последовательности 16S рРНК изучаемой бактерии с последовательностями базы данных. В ходе такого выравнивания найден наиболее близкий организм, им оказался Aeribacillus pallidus. Установлена генетическая организация участка генома, кодирующего НЭ BspD6I и малую субъединицу BspD6I (ss.BspD6I). После генов НЭ BspD6I и ss.BspD6I на комплементарной цепи расположен ген метилтрансферазы BspD6I, которая оказалась на 100% идентична метилтрансферазам BstNBI и BstSEI из Geobacillus stearothermophilus. Таким образом, гены НЭ BspD6I, ss.BspD6I и метилтрансферазы BspD6I расположены в непосредственной близости в геноме Bacillus species D6 и составляют систему рестрикции-модификации данной бактерии. Для поиска белков системы «мисматч»-репарации были взяты последовательности MutS и MutL из штамма B. subtilis 168. Полученные данные свидетельствуют о том, что в геноме Bacillus species D6 могут быть закодированы гомологи белков MutS и MutL. Результат поиска белка MutH выдал недостоверные находки (с E-value 1,1 и 4,8 и низким процентом идентичности последовательностей), что говорит о вероятном отсутствии гомолога данного белка в геноме Bacillus species D6. В предполагаемой последовательности белка MutL Bacillus species D6 были найдены эндонуклеазные мотивы. Для поиска в геноме Bacillus species D6 белков гомологичной рекомбинации последовательности таких белков брали из наиболее изученных геномов Bacillus subtilis и Escherichia coli (штамм K12). Известно, что в E. coli комплекс RecBCD является основным участником в процессе репарации двуцепочечных разрывов. В B. subtilis такой комплекс отсутствует, а его функцию выполняет комплекс белков AddAB. Поиск белков AddA и AddB выдал находки с нулевым E-value, в то время как при поиске белков RecB, RecC, RecD были найдены последовательности с довольно высоким E-value (0,40). В целом в геноме Bacillus species D6 было найдено больше последовательностей, гомологичных белкам из B. subtilis по сравнению с белками из E. coli. Также другие параметры выравниваний (проценты сходства и идентичности) были выше для белков из B. subtilis. На основании предварительных результатов можно предположить, что система гомологичной рекомбинации Bacillus sp. D6 больше схожа с системой из B. subtilis, чем с системой из E. coli. На основе анализа полногеномных последовательностей в программе NPG-explorer было построено филогенетическое дерево с ближайшими гомологами Bacillus sp. D6. Наиболее близким видом к изучаемой бактерии Bacillus sp. D6 оказался Aeribacillus pallidus (штаммы KCTC3564 и PI8), что подтверждают и данные, полученные при анализе последовательностей 16S рРНК. В ходе работы сконструированы плазмиды, кодирующие «химерные» белки на основе ферментов НЭ BspD6I и NgoL. NgoL – это белок MutL из системы репарации ММR бактерии Neisseria gonorrhoeae, который по сути также представляет собой никующую эндонуклеазу. Конструкции, кодирующие «химерные» белки, были получены на основе плазмиды pЕТ28b/Nick (кодирующей НЭ BspD6I). Все плазмиды с генами «химерных» белков содержат перед стоп-кодоном участок, кодирующий шестигистидиновый пептид. Первая конструкция кодирует белок, состоящий из N-концевого (узнающего) и линкерного доменов НЭ BspD6I и C-концевого домена (каталитического) NgoL. Вторая конструкция состоит из N-концевого домена НЭ BspD6I, а линкерный и С-концевой домен взяты из NgoL. Варьирование типа линкера обосновано различной природой этих доменов: линкер из НЭ BspD6I является «жестким» звеном, состоящим из трех альфа-спиралей; а линкер из NgoL – подвижной и лабильной структурой. В каждом случае методом ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Phusion нарабатывали всю плазмиду pЕТ28b с нужным фрагментом НЭ BspD6I, а с плазмиды pET15b (кодирующей NgoL) нарабатывали только интересующую часть белка. Праймеры были подобраны таким образом, что лигирование полученных фрагментов происходило с одной стороны по «тупым» концам, а с другой – по «липким» концам, образовавшимся под действием ЭР SalI. Такая схема клонирования должна обеспечивать правильную ориентацию вставки в конечном векторе. Третья конструкция содержит N-концевой (ДНК-связывающий) и линкерный домены NgoL, а С-концевой домен (каталитический) был взят из НЭ BspD6I. Четвертая конструкция состоит из N-концевого домена NgoL и линкерного и С-концевого доменов НЭ BspD6I. Стратегия получения «химерных» плазмид в этом случае была такая же, что и в случае первых двух конструкций. Учитывая, что N-концевой домен химерных белков №1 и №2 взят из НЭ BspD6I, можно ожидать, что белки будут узнавать в ДНК такую же последовательность, что и НЭ BspD6I (5'-GAGTC-3'/5'-GACTC-3'). Мы предположили, что химерные белки №1 и №2 могут быть токсичны для клеток в результате гидролиза клеточной ДНК при их экспрессии. Защиту клеточной ДНК может обеспечить присутствие ДНК-метилтрансферазы SccL1I, узнающей ту же последовательность, что и химерные белки №1 и №2. Поэтому для экспрессии этих химерных белков использовали ранее полученный штамм E. coli BL21 (DE3), содержащий также плазмиду pRARE с геном метилтрансферазы SccL1I. Схема выделения химерных белков была одинакова для конструкций №1 и №2. Вначале проводили трансформацию клеток полученной плазмидой методом теплового шока, селекцию клонов проводили с помощью антибиотиков канамицина (35 мкг/мл) и хлорамфеникола (10 мкг/мл) на агаризованной среде LB. Перед добавлением ИПТГ клетки выращивали в среде LB в присутствии канамицина и хлорамфеникола с постоянной аэрацией при 37 градусах C до оптической плотности A590=0,8 O.E. Индукцию экспрессии химерных белков в клетках осуществляли путем добавления ИПТГ в среду до конечной концентрации 0,8 мМ. Показано, что именно при такой концентрации ИПТГ экспрессия белков проходит наиболее эффективно. После индукции клетки инкубировали в течение 4 часов при 37 градусах C с интенсивным перемешиванием. Затем клетки осаждали центрифугированием (4000 об./мин, 25 мин), ресуспендировали в 100 мл буфера для лизиса (20 мМ K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5, 100 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 2 мМ ПМСФ). Все операции по очистке белков проводили при температуре +4 градуса C. Разрушение клеточной биомассы производили в течение 5 мин на ультразвуковом дезинтеграторе. Полученный лизат клеток центрифугировали в течение 30 мин при 4 градусах C при 25000 об./мин. Следующие стадии очистки белков проводили с использованием хроматографической системы среднего давления. Надосадочную жидкость после центрифугирования отбирали и наносили на колонку с 30 мл фосфоцеллюлозы P11, предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ K2HPO4/KH2PO4 pH 7.5, 100 мМ KCl, 0.1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ). Затем колонку промывали двумя объемами буфера А, после чего проводили элюцию линейным градиентом KCl (0,1-0,8 M) на основе буфера А, со скоростью 0,5 мл/мин. Фракции анализировали электрофорезом в 12% SDS-ПААГ. Оказалось, что полученные пробы наряду с целевым химерным белком содержали значительное количество примесей других клеточных белков. Дополнительная С-концевая последовательность, содержащая блок из шести остатков гистидина, позволяет выделять химерные белки методом аффинной хроматографии. Поэтому на следующей стадии фракции, содержащие химерный белок, объединяли и наносили на колонку с 5 мл Ni2+-NTA-агарозой, уравновешенную буфером Б (50 мМ K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5, 500 мМ KCl, 10 мМ имидазол). Перед нанесением на колонку к фракциям добавляли имидазол до концентрации 10 мМ и повышали концентрацию KCl в препарате до 500 мМ. После нанесения препарата колонку промывали десятью объемами буфера Б. Элюцию белка проводили ступенчатым градиентом имидазола в диапазоне от 50 до 300 мМ в буфере Б со скоростью 1 мл/мин. Начало элюции химерного белка соответствовало концентрации имидазола 240 мМ. Фракции, содержащие целевой белок, концентрировали в центрифужных концентраторах Amicon Ultra-15 30000 NMWL (Millipore, США) и анализировали электрофорезом в 12% SDS-ПААГ. После такой двухступенчатой очистки удалось получить препарат химерного белка с высокой степенью гомогенности (≈ 95%). Концентрации химерных белков составляли 0,5–3 мг/мл. В случае химерных белков №3 и №4 на данный момент не удалось подобрать условия эффективной индукции в клетках E. coli BL21 (DE3), поэтому дальнейшая очистка этих белков не проводилась. Мы предполагаем, что эти химерные белки могут быть токсичны для клетки даже в присутствии метилтрансферазы SccL1I. Учитывая, что узнающий N-домен этих белков взят из NgoL, являющегося неспецифической эндонуклеазой (Duppatla V. et al. Biochem. J. 2009, 423, 265–277), гидролиз ДНК может происходить и в участках, отличных от сайта узнавания метилтрансферазы SccL1I. Для тестирования активности химерных белков №1 и №2 нами был получен 190-звенный ДНК-субстрат методом ПЦР на основе плазмиды pBEND2. На расстоянии 9 п.н. от начала дуплекса располагается участок узнавания НЭ BspD6I: такая длина фланкирующей последовательности обеспечивает эффективное связывание и гидролиз ДНК НЭ BspD6I (Abrosimova L.A. et al. Biochim. Biophys. Acta. 2016, 1864, 1072-1082). Известно, что белки MutL имеют незначительную ДНК-связывающую активность, которая существенно зависит от длины ДНК (Niedziela-Majka A. et al. Biochemistry. 2011, 50, 7868-7880), поэтому для эффективного функционирования доменов NgoL в составе химерных белков решено было получить протяженный 190-звенный субстрат. Подобные ДНК использовались ранее для проверки активности гомолога MutL из B. subtilis (Almawi A.W. et al. Nucleic Acids Res. 2019, 47, 4831–4842). После участка узнавания НЭ BspD6I по всей длине субстрата расположено еще 20 участков узнавания различных эндонуклеаз рестрикции. Наличие большого количества участков узнавания эндонуклеаз рестрикции поможет упростить определение позиции гидролиза химерными белками №1 и №2 в ходе анализа продуктов реакции методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Ожидается, что химерные белки будут вносить одноцепочечный разрыв в ДНК-дуплекс, но добиться диссоциации такого протяженного дуплекса на фрагменты может быть затруднительно. Добавление в пробу эндонуклеазы рестрикции после проведения реакции приведет к внесению двуцепочечного разрыва, укорочению ДНК-дуплекса, что будет способствовать его диссоциации. Наличие флуоресцентной метки TAMRA на 5'-концах цепей субстрата также упростит детекцию продуктов гидролиза. Проведены контрольные эксперименты по гидролизу данного субстрата исходными белками: НЭ BspD6I и NgoL. Для этого был подобран буфер, в котором эффективно функционируют оба белка: 10 мМ Трис-HCl (рН 7,8), 150 мМ KCl, 10 мМ MnCl2, 1 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл БСА. Как и ожидалось, НЭ BspD6I гидролизовала такой ДНК-дуплекс в верхней цепи на расстоянии 4 п.н. от участка узнавания. NgoL с эффективностью примерно 10% также гидролизовал 190-звенный субстрат в единственном положении. Каталитическая активность химерных белков №1 и №2 была также протестирована с использованием 190-звенного ДНК-дуплекса. В случае химерного белка №1 гидролиз ДНК не наблюдался при инкубировании реакции при 37°С в течение 30 мин. При добавлении химерного белка №2 к ДНК-дуплексу наблюдали образование единственного продукта гидролиза с эффективностью около 5%. Вероятно, в случае химерного белка №1 «жесткий» линкерный домен НЭ BspD6I, состоящий из трех альфа-спиралей, препятствовал «правильному» расположению C-концевого (каталитического) домена NgoL на ДНК. В химерном белке №2 подвижный линкерный домен был взят из NgoL и обладал лабильной структурой, что позволило С-концевому домену NgoL связаться с ДНК-дуплексом и внести одноцепочечный разрыв. Положение гидролиза химерным белком №2 в настоящее время устанавливается. Таким образом, как и предполагалось изначально, различный тип связующего звена между ДНК-узнающим и каталитическим доменами действительно играет решающую роль при функционировании химерных белков. В ходе работы получен штамм Bacillus species D6, нокаутный по гену НЭ BspD6I (deltabspD6IN). На основе штамма deltabspD6IN для контрольных экспериментов был получен комплементный штамм, в котором удаленный ген НЭ BspD6I был «возвращен» в клетку с помощью соответствующей плазмиды. Для анализа роли НЭ BspD6I в клетке были получены кривые роста клеток Bacillus species D6 дикого и мутантного штаммов. Для этого растили ночные культуры, утром измеряли оптическую плотность при длине волны 600 нм и разбавляли культуры так, чтобы стартовая оптическая плотность была около 0,1 О.Е. во всех колбах. Объем питательной среды LB составлял 10% от объема колбы, клетки растили при постоянном перемешивании (240 об/мин). Оптическую плотность регистрировали в процессе роста клеток при 37, 45 и 55 градусах С, однако достоверного отличия в скорости роста клеток дикого и мутантного штаммов выявлено не было. В контрольных экспериментах анализировали скорость роста клеток комплементного штамма Bacillus species D6 (deltaBspD6IN+BspD6IN). Отличий от роста дикого и мутантного штаммов также не наблюдалось. При оценке фенотипов мутантного штамма и комплементного штамма клеток Bacillus species D6 по сравнению с клетками Bacillus species D6 дикого типа отличий выявлено не было. Методом флуоресцентной микроскопии отличий в морфологии образцов клеточных культур изучаемых штаммов не найдено. Возможно, дополнительная клеточная роль НЭ BspD6I может быть обнаружена при анализе роста клеток дикого и мутантного штаммов в различных стрессовых условиях или при изменении условий окружающей среды (например, при ответе на окислительный и солевой стрессы, холодовой шок). Известно, что ЭР в составе «химерных» высокоспецифичных белков, использующихся для редактирования генома, могут проявлять неспецифическую активность и гидролизовать нецелевую ДНК. В настоящее время активно разрабатываются методики, позволяющие контролировать процессы взаимодействия молекул с помощью внешнего сигнала, в том числе и за счет изменения температуры. В качестве примера можно привести разработку метода ПЦР с «горячим стартом» (Hot start PCR), где модифицированная ДНК-полимераза неактивна при комнатной температуре, что снижает уровень неспецифического синтеза ДНК. Для разработки метода регулирования активности НЭ BspD6I за счет изменения температуры вначале было решено использовать в качестве модельного объекта хорошо изученную гомодимерную ЭР SsoII. Нами показана возможность создания термопереключаемой гомодимерной ЭР путем ковалентного присоединения олигонуклеотида в определенное положение белковой молекулы (Abrosimova L.A. et al. IUBMB Life. 2013, 65, 1012). Регулирование активности НЭ является актуальной задачей для тех процессов, где в реакционной смеси присутствуют сразу несколько ферментов, и требуется их согласованная работа. Примером является реакция изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи, в ходе которой обычно накапливается большое количество неспецифических продуктов (Tan E. et al. Biochemistry. 2008, 47, 9987). В этой реакции одновременно участвуют НЭ и ДНК-полимераза с цепь-вытесняющей активностью. Для получения протяженного целевого продукта реакции необходимо, чтобы НЭ не вносила дополнительных разрывов в синтезируемую цепь ДНК (возможно при наличии нескольких участков узнавания НЭ). Для этого нужно разработать стратегию временного блокирования НЭ. В данной работе для повышения эффективности реакции изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи был сконструирован 26-звенный ДНК-дуплекс с ненуклеозидной вставкой на основе остатка триэтиленгликоля (обозначен как x) в позиции гидролиза ДНК НЭ BspD6I: 5'-CGTGGTCTCGAGTCTTCTxCAAGGTAC-3'/3'-GCACCAGAGCTCAGAAGA-GTTCCATG-5'. Нами показано, что при достаточном избытке триэтиленгликоль-содержащего ДНК-дуплекса по отношению к субстрату гидролитическая активность НЭ BspD6I подавляется при 55 градусах С. Для амплификации ДНК использовали ДНК-полимеразу Bst 3.0, которая обладает способностью вытеснять цепь в процессе синтеза ДНК, а также остается активной при повышенных температурах (около 65 градусов С). Реакцию изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи проводили при температурах 55 градусов С. На первом этапе в качестве ДНК-матрицы использовали 80-звенный ДНК-дуплекс с единственным участком узнавания НЭ BspD6I. Показано, что добавление в реакционную смесь 26-звенного ДНК-дуплекса с ненуклеозидной вставкой на основе остатка триэтиленгликоля снижает количество неспецифических продуктов в ходе амплификации. Далее в качестве матрицы использовали 200-звенный ПЦР-продукт, содержащий 2 участка узнавания НЭ BspD6I. Однако добиться снижения уровня синтеза побочных продуктов реакции при варьировании условий и концентраций реагентов в присутствии ДНК-«ловушки» не удалось. Вероятно, часть молекул ДНК-«ловушки» образовывала дуплекс с матричными цепями и таким образом также служила «затравкой» для синтеза ДНК, что приводило к появлению побочных продуктов реакции. Для снижения уровня неспецифического синтеза планируется в дальнейшем влиять на активность НЭ BspD6I за счет повышения температуры реакции. Так как оптимум активности НЭ BspD6I составляет 55 градусов С, дальнейшее повышение температуры реакции (≈ до 65 градусов С) должно приводить к ее инактивации, в то время как ДНК-полимераза Bst 3.0 будет способна эффективно проводить синтез ДНК при повышенной температуре. На сегодняшний день точный каталитический механизм действия НЭ BspD6I и конформационные перестройки ДНК-белкового комплекса в процессе взаимодействия фермента и субстрата не установлены. Поэтому в дополнение к запланированным работам нами также изучены особенности взаимодействия НЭ BspD6I с ДНК в предстационарных условиях (данные получали методом «остановленного потока» в институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) в лаборатории исследования модификации биополимеров под руководством проф. О.С. Федоровой совместно с д.х.н. Н.А. Кузнецовым). В качестве ДНК-субстратов использовали 19-звенные дуплексы, содержащие флуорофор FAM и тушитель флуоресценции BHQ1 в одной либо в разных цепях. Кинетические кривые анализировали с помощью программ OriginPro и DynaFit. Критерием оценки адекватности механизма являлось отклонение полученных теоретических кривых от экспериментальных данных. Определена кинетическая схема реакции комплексообразования НЭ с ДНК-субстратом в буферных растворах, содержащих ионы кальция или магния, подтвержден изгиб ДНК в процессе его комплексообразования с НЭ BspD6I. Для верификации полученных элементарных констант скорости провели независимый кинетический эксперимент в стационарных условиях. Полученная каталитическая константа скорости реакции хорошо согласуется с рассчитанной из данных предстационарной кинетики. Для изучения влияния длины фланкирующих последовательностей на скорость и эффективность катализа использовали набор ДНК-дуплексов длиной от 15 до 26 п.н. Востребованность НЭ в современной генетической инженерии и молекулярной биологии привела к дизайну «искусственных» НЭ с новой специфичностью. Нами подготовлен обзор в журнале «Биоорганическая химия», в котором суммированы методы получения таких ферментов, заключающиеся в нарушении димеризационного интерфейса, инактивации каталитического центра эндонуклеаз рестрикции и случайного мутагенеза их генов. Также нами рассмотрены основные методы использования НЭ в биотехнологии: для изотермической амплификации ДНК, введения меток в центральную часть протяженных молекул ДНК, картирования генома. Приведены примеры применения НЭ для целей генной терапии при конструировании химерных белков с заданной специфичностью. Описано использование НЭ для усиления аналитического сигнала в системах детекции нуклеиновых кислот, белков и малых молекул. В ходе работы дополнительно исследованы свойства мутантной формы НЭ BspD6I(C11S,C160S) по сравнению с диким типом НЭ BspD6I. В результате впервые выяснена роль остатков цистеина НЭ BspD6I во взаимодействии с ДНК методом “кросслинкинга” с использованием дуплексов, содержащих 2-пиридилдисульфидную группу при С2'-атоме углеводного фрагмента в заданном положении олигонуклеотидной цепи (Абросимова Л.А. и др. Молекул. биология. 2020, 54, 1–13, принята к печати). Показано, что остатки цистеина, как N-концевого ДНК-связывающего, так и С-концевого каталитического доменов НЭ BspD6I, сближены с ДНК в процессе образования фермент-субстратного комплекса. При этом замена остатков Сys N-концевого домена на Ser не приводила к существенному нарушению функций белка. Создан бесцистеиновый вариант НЭ BspD6I. Изучение его свойств позволит получить дополнительную информацию о функциональной значимости остатков Cys этого уникального фермента. Флуоресцентное мечение белков по остаткам Cys в последнее время получило широкое распространение в связи с развитием подходов к исследованию механизмов функционирования биомолекул, основанных на методах флуоресцентного резонансного переноса энергии и флуоресцентной микроскопии одиночных молекул. Такой подход планируется применить в будущем и к НЭ BspD6I. Для этого необходимо понимание изначальной роли остатков Cys в функционировании белка и того, как модификация повлияет на активность фермента.