| 1 |
1 июня 2018 г.-31 декабря 2018 г. |
Изучение секретируемых пептидаз фито - и энтомопатогенов и их взаимодействий с белковыми ингибиторами растительного и грибного происхождения с целью разработки препаратов защитного действия |
| Результаты этапа: Проведен поиск разнообразия и распространённости последовательностей пролин-специфичных пептидаз (ПСП) в секвенированных геномах 33 видов дикариомицетов, различающихся систематическим положением, жизненной формой и экологической нишей. используя в качестве запроса аминокислотные последовательности ПСП из баз данных SWISS-PROT и TrEMBL. Из 15 известных человеческих ПСП у исследованных видов грибов обнаружено 10, в то же время как для дипептидилпептидаз - 6, 8, 9 и 10, а также для аминопептидазы 2 грибных гомологов не выявлено. Показано, что некоторые из обнаруженных нами ПСП являются таксоноспецифичными. Все найденные ПСП охарактеризованы относительно функциональных групп активного центра, наличия пре- и про- последовательностей, а также трансмембранного сегмента, что должно облегчить понимание механизма их действия и выполняемых ими функций.
Cовместно с коллегами из Института экспериментальной ботаники им.В.Ф.Купревича НАНБ было проведено сравнительное исследование внеклеточных пептидаз и их ингибиторов из высших мицелиальных грибов с различным трофическим статусом. Активность ПСП пептидаз была выявлена у всех изученных 12 штаммов алкалофильных и алкалотолерантных микромицетов, выделенных из щелочных почв, грунтов и содовых озер. Частично очищенные препараты внеклеточных пептидаз были получены из распространенных фитопатогенов родов Colletotrichum, Cladosporium, Botrytis, а также энтомопатогена Ascosphaera apis, вызывающих разнообразные заболевания растений и насекомых. Эти ферменты были охарактеризованы с точки зрения физико-химических свойств и установлена их принадлежность к классам сериновых и цистеиновых пептидаз. Результаты исследований культурных и дикорастущих видов растений позволили установить наличие высокой положительной корреляционной связи между активностью ингибиторов трипсина и активностью ингибиторов экзогенных пептидаз. а также между активностью ингибиторов экзогенных пептидаз фитопатогенов и устойчивостью растений к болезням.
Продолжен скрининг пассируемой в течение ряда лет без селективного давления коллекции асептических трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) и их потомства следующего поколения и проведено пополнение коллекции трансгенных растений табака с геном ISP и дополнтельными фрагментами гена спидроина. На основании анализа биотестов и молекулярно-генетического анализа очевидно, что ткани всех трансгенных растений, несущих целевой ген ингибитора трипсина (ISP), вне зависимости от конструкции и количества дополнительных генов спидроина и их ориентации, подавляют рост газона бактерий и уменьшают зону лизиса в опытах на изолированных листьях значительно сильнее контрольных.
Получено разрешение на выдачу 2 совместных с белорусским партнером патентов в результате экспертного одобрения ранее поданных заявок (соответствующие файлы прилагаются).
Продолжен скрининг пассируемой в течение ряда лет без селективного давления коллекции асептических трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) и их потомства следующего поколения и проведено пополнение коллекции трансгенных растений табака с геном ISP и дополнтельными фрагментами гена спидроина. На основании анализа биотестов и молекулярно-генетического анализа очевидно, что ткани всех трансгенных растений, несущих целевой ген ингибитора трипсина (ISP), вне зависимости от конструкции и количества дополнительных генов спидроина и их ориентации, подавляют рост газона бактерий и уменьшают зону лизиса в опытах на изолированных листьях значительно сильнее контрольных.
Получено разрешение на выдачу 2 совместных с белорусским партнером патентов в результате экспертного одобрения ранее поданных заявок от 31.01.2014 г. (соответствующие файлы прилагаются).
|
| 2 |
1 июня 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Изучение секретируемых пептидаз фито - и энтомопатогенов и их взаимодействий с белковыми ингибиторами растительного и грибного происхождения с целью разработки препаратов защитного действия |
| Результаты этапа: Проведен поиск разнообразия и распространённости последовательностей пролин-специфичных пептидаз (ПСП) в секвенированных геномах 33 видов дикариомицетов, различающихся систематическим положением, жизненной формой и экологической нишей. используя в качестве запроса аминокислотные последовательности ПСП из баз данных SWISS-PROT и TrEMBL. Из 15 известных человеческих ПСП у исследованных видов грибов обнаружено 10, в то же время как для дипептидилпептидаз - 6, 8, 9 и 10, а также для аминопептидазы 2 грибных гомологов не выявлено. Показано, что некоторые из обнаруженных нами ПСП являются таксоноспецифичными. Все найденные ПСП охарактеризованы относительно функциональных групп активного центра, наличия пре- и про- последовательностей, а также трансмембранного сегмента, что должно облегчить понимание механизма их действия и выполняемых ими функций.
Исследование адаптивных изменений в спектре внеклеточных пептидаз мицелиальных грибов, относящимися к различным таксонам и трофическим группам показало , что спектр секретируемых ферментов и их основные характеристики являются видо- и штаммоспецифичными. Синтез и секреция этих пептидаз определяются фазами развития гриба, а также наличием ряда индукторов как рН среды, присутствия в среде белкового субстрата либо сложной белковой структуры типа клеточной стенки. Для исследованных в работе фитопатогенов характерна секреция трипсин-подобных пептидаз, которые могут рассматриваться как маркеры и участники патогенеза.
Cовместно с коллегами из Института экспериментальной ботаники им.В.Ф.Купревича НАНБ было проведено сравнительное исследование внеклеточных пептидаз и их ингибиторов из высших мицелиальных грибов с различным трофическим статусом. Активность ПСП пептидаз была выявлена у всех изученных 12 штаммов алкалофильных и алкалотолерантных микромицетов, выделенных из щелочных почв, грунтов и содовых озер. Частично очищенные препараты внеклеточных пептидаз были получены из распространенных фитопатогенов родов Colletotrichum, Cladosporium, Botrytis, а также энтомопатогена Ascosphaera apis, вызывающих разнообразные заболевания растений и насекомых. Эти ферменты были охарактеризованы с точки зрения физико-химических свойств и установлена их принадлежность к классам сериновых и цистеиновых пептидаз. Установлено и подтверждено наличие высокой положительной корреляционной связи между активностью ингибиторов трипсина и активностью ингибиторов экзогенных пептидаз у культурных и дикорастущих видов растений. а также между активностью ингибиторов экзогенных пептидаз фитопатогенов и устойчивостью растений к болезням. Результаты исследований вносят вклад в понимание механизмов взаимодействия патоген–растение и роли в этом процессе специфических белковых ингибиторов экзогенных пептидаз патогенных микроорганизмов. Полученные в ходе выполнения настоящей работы сведения могут быть использованы в селекционно-генетических исследованиях по созданию сортов и видов сельскохозяйственных культур с повышенной устойчивостью к патогенной микрофлоре и насекомым-вредителям, а также для создания препаратов защитного действия.
Продолжен скрининг пассируемой в течение ряда лет без селективного давления коллекции асептических трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) и их потомства следующего поколения и проведено пополнение коллекции трансгенных растений табака с геном ISP и дополнтельными фрагментами гена спидроина (белок паутины). На основании анализа биотестов и молекулярно-генетического анализа очевидно, что ткани всех трансгенных растений, несущих целевой ген ингибитора трипсина (ISP), вне зависимости от конструкции и количества дополнительных генов спидроина и их ориентации, подавляют рост газона бактерий и уменьшают зону лизиса в опытах на изолированных листьях значительно сильнее контрольных. Полученные результаты подтверждают сохранение экспрессии целевого гена ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) в течение многолетнего пассирования коллекции трансгенных растений табака в асептической культуре без селективного давления.
Длительно пассируемая без селективного давления коллекция асептических трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) была пополнена серией трансгенных растений табака с гетерологичными генами антимикробного пептида из дикого вида пшеницы Triticum kiharae и дефензина из звездчатки Stellaria media. Сравнительный анализ полученных трансгенных растений табака указывает на то, что введение в них гетерологичных растительных генов разной природы (ингибиторы протеиназ, дефензины, антимикробные пептиды), используемых растением в разнообразных механизмах защиты от фитопатогенов, приводит к примерно одинаковому повышению фитопатогенной активности тканей трансгенных растений.
Получено 2 совместных с белорусским партнером патента по результатам предыдущих работ (соответствующие файлы прилагаются).
|
