Гистогенез и гистофизиология органов иммунной системы и барьерных тканей при адаптационных и воспалительных процессах.НИР

Histogenesis and histophysiology of the immune system organs and barrier tissues in the adaptation and inflammatory processes.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Гистогенез и гистофизиология органов иммунной системы и барьерных тканей при адаптационных и воспалительных процессах.
Результаты этапа: На экспериментальной модели острого воспаления в стенке воздушного мешка показано, что профилактическое введении SkQ1 снижает миграцию ТК в очаг воспаления и их дегрануляцию, а так же образование медиаторов воспаления, включая гистамин, который повышает проницаемость сосудистой стенки. Инкубация эндотелиальных клеток линии EAhy926 в течение 30 минут и 24 часов в культуральной среде содержащей, соответственно, 10 и 1 мкМ гистамина не нарушает целостность адгезивных контактов. Липофильный катион SkQ1 — C12TPP не оказывает влияния на выраженность экссудативной реакции при остром воспалении у мышей. При экспериментальном остром колите, индуцированном 1% раствором ДСН, выявлены нарушения эпителиально-слизистого барьера, характеризующиеся увеличением числа бактерий, контактирующих с эпителиальными клетками, снижением толщины гликокаликса и высоты микроворсинок на каемчатых колоноцитах. При хроническом колите эпителиально-слизистый барьер восстанавливается. При остром и хроническом колите статистически значимо увеличивается уровень мРНК клаудина CLDN2, что отражает повышение проницаемости плотных контактов. При остром колите статистически значимо снижается уровень мРНК секреторного муцина Muc3, что связано с нарушением барьерной функции гликокаликса. При хроническом колите возрастает уровень мРНК муцинов мембранно-ассоциированного Muc1 и секреторного Muc2, а уровень мембранно-ассоциированного Muc13 снижается, что отражает как изменения физико-химических свойств слизи, так и нарушения сигналинга. По сравнению с контрольной группой при остром колите уровень мРНК провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и противовоспалительного TGFβ возрастет, а уровень мРНК IL-2, IFNɣ, IL-12, IL-17, IL-4 и IL-10 не изменяется. При хроническом колите по сравнению с контрольной группой повышается уровень мРНК противовоспалительного IL-10 и иммунорегуляторного IL-12. По сравнению с самками у самцов контрольной группы в слизистой оболочке ободочной кишки выше объемная доля бокаловидных клеток, клеточных элементов в собственной пластинке слизистой оболочки, что отражает большую выраженность у них компартментов слизистого и иммунологического барьеров. При остром и хроническом язвенном колите выявлены изменения субпопуляционного состава лимфоцитов. По сравнению с контролем в стенке ободочной кишки возрастает количество CD3+CD4+ Т-хелперов, CD3-CD19+ В-лимфоцитов, уменьшается – цитотоксических Т-лимфоцитов. При хроническом язвенном колите увеличивается абсолютное число иммуносупрессорных CD4+CD25+FOXP3+ регуляторных Т-лимфоцитов, что свидетельствует о поляризации иммунного ответа по Тх-2 типу. В тимусе при экспериментальном остром и хроническом язвенном колите повышается количество цитокератин-19 позитивных клеток и тимических телец и количество эпителиальных клеток в мозговом веществе. В тимусе при остром язвенном колите возрастает относительное содержание дендритных клеток и уменьшается количество В-, цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-хелперов, дубль позитивных (CD4+CD8+) лимфоцитов и макрофагов. При хроническом колите увеличивается количество В- лимфоцитов, а число макрофагов по сравнению с контролем уменьшается. Выявленные при морфологическом и морфометрическом исследовании изменения тимуса при остром язвенном колите свидетельствуют об увеличении миграции и гибели тимоцитов, при хроническом колите — о восстановлении коры за счет активации процессов пролиферации и дифференцировки тимоцитов. При остром язвенном колите, индуцированном декстрансульфатом натрия, у мышей линии C57Bl/6 в мышечной оболочке дистального отдела ободочной кишки обнаружены клетки Кахаля внутри- и межмышечной популяций с признаками альтерации.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Гистогенез и гистофизиология органов иммунной системы и барьерных тканей при адаптационных и воспалительных процессах.
Результаты этапа: На модели подкожного «воздушного мешка» у мышей при интраперитонеальном введении SkQ1 установлено, что SkQ1 подавляет активацию тучных клеток (ТК), ведущую к их дегрануляции и выбросу гистамина. Обнаружено достоверное уменьшение степени дегрануляции ТК в стенках мешка. Полученные результаты указывают на участие мтАФК в процессе активации ТК, снижение степени их дегрануляции под действием SkQ1 может играть ключевую роль в противовоспалительной активности этого митохондриально-направленного антиоксиданта. По клиническим проявлениям и морфологическим данным при потреблении в течение 5 суток 1% и 5% раствора ДСН у мышей C57Bl/6 развивается, соответственно, менее тяжелый острый язвенный и более тяжелый фибринозно-язвенный колит. Установлено, что при экспериментальном язвенном колите в механизмах развития острого и хронического процесса и иммунологических нарушений важную роль играет эндотоксинемия, вызывающая развитие системных воспалительных реакций. По сравнению с контрольной группой при катарально-язвенном колите уровень эндотоксина повышается в 3,8 раз, при тяжелом фибринозно-язвенном колите – в 9,6 раз, а при хроническом язвенном колите в 3,9 раз. Показано, что по сравнению с контролем при экспериментальном тяжелом остром язвенном колите численность популяции фибробластоподобных клеток и гистоархитектоника их сети не изменяется. По данным оценки субпопуляций лимфоцитов при нарастании выраженности патологического процесса при остром язвенном колите в периферической крови абсолютное количество Т-хелперов и В-лимфоцитов уменьшалось, в 3,2 и 3,5 раз, соответственно, в 1,5 раз увеличивается количество CD4+CD25+FOXP3+ регуляторных Т-лимфоцитов; в тимусе снижалось общее количество лимфоцитов, В-, незрелых CD4+CD8+ лимфоцитов и увеличивалось содержание CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-лимфоцитов; в брыжеечных лимфатических узлах абсолютное количество лимфоцитов в 1,4 раза, в 2 раза Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а содержание В- и регуляторных Т-лимфоцитов увеличивалось в 1,4 и 3 раза соответственно. Воспалительный и язвенный процессы в ободочной кишке при экспериментальном остром катарально-язвенном колите более выражены у самцов, а при хроническом – у самок. При остром катарально-язвенном колите у самок и самцов в бокаловидных клетках снижается содержание нейтральных гликопротеинов, а у самцов и высокосульфатированных, устойчивых к бактериальным гликозидазам. Эти данные указывают на более выраженные нарушения эпителиального барьера у самцов по сравнению с самками. Разработаны подходы для создания модели ороговевающего эпидермиса человека in vitro. Продемонстрирована возможность получения многослойного эпидермального пласта и его экспонирования на границе жидкость/воздух. Определены оптимальные условия проведения процесса корнификации.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Гистогенез и гистофизиология органов иммунной системы и барьерных тканей при адаптационных и воспалительных процессах.
Результаты этапа: Выполнение исследования «Роль слабого разобщения окислительного фосфорилирования в регуляции барьерной функции эндотелия» позволило сформулировать гипотетическую схему действия ФНО на барьерную функцию эндотелия и механизм защиты эндотелиального монослоя под действием слабого разобщения окислительного фосфорилирования. Слабое разобщение изменяет внутриклеточные сигнальные каскады, запускаемые в ответ на ФНО, предотвращая трансляцию, секрецию или активацию проMMP9, что приводит к снижению содержания активной формы MMP9 во внеклеточной среде, и, как следствие, предотвращает расщепление VE-кадгерина и разборку адгезионных контактов, приводя к снижению проницаемости эндотелия, оказывая тем самым противовоспалительное действие. О молекулярных и клеточных механизмах, управляющих барьерной функцией эпителия кишечника, а также роли митохондрий в этом процессе на сегодняшний день известно крайне мало. Впервые нами получены данные, показывающие, что слабое разобщение окислительного фосфорилирования влияет на процесс регуляции проницаемости кишечного эпителия. Дальнейшие исследования позволят более детально изучить механизмы этого влияния. Понимание данных механизмов позволит не только расширить фундаментальные знания о функционировании митохондрий, но и может лечь в основу разработки новых подходов к лечению воспалительных заболеваний кишечника с использованием разобщителей окислительного фосфорилирования. Обобщая данные полученные при изучении влияния митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 на секреторную и миграционную активность тучных клеток в ранней экссудативной фазе каррагинан-индуцированного воспаления в модели «воздушного мешка» у мышей, можно заключить, что мтАФК играют важную роль в активации тучных клеток, ведущей к их дегрануляции и секреции гистамина. Поскольку гистамин способствует повышению проницаемости стенок сосудов и миграции лейкоцитов в область воспаления, подавление активации ТК под действием митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 может вносить существенный вклад в его противовоспалительное действие. Полученный в результате оценки кратковременного системного воздействия антиоксиданта SkQ1 на проницаемость стенки сосудов при локальном подкожном введении гистамина у мышей результат свидетельствует о том, что подавление мтАФК с помощью антиоксиданта SkQ1 не влияет на проницаемость стенки сосудов в ответ на гистамин. Изучение влияния SkQ1 на секреторную активность тучных клеток, а также на проницаемость сосудов под действием гистамина на только расширяет представление о роли мтАФК в функциональной активности тучных клеток, но и вносит вклад в научную основу для разработки новых противовоспалительных препаратов. В исследовании «Сравнительная характеристика клинических и морфологических проявлений острого и хронического язвенного колита и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, брыжеечных лимфатических узлов и ободочной кишки у самцов и самок мышей C57Bl/6» впервые охарактеризованы половые различия структурных изменений ободочной кишки, эпителиального барьера и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, брыжеечных лимфатических узлов и ободочной кишки у мышей C57Bl/6 в норме и при разной тяжести острого и хронического язвенного колита. Выявлены половые различия структурной организации ободочной кишки у половозрелых мышей C57Bl/6 в норме. По сравнению с самками у самцов больше длина ободочной кишки, число лимфоидных узелков в ней и количество клеток в собственной пластинке слизистой оболочки, а также содержание секреторных бокаловидных и эндокринных клеток. Функционирование иммунной системы в физиологических условиях у самок мышей обеспечивается относительно высоким содержанием Т-регуляторных лимфоцитов. При умеренном и тяжелом остром язвенном колите клинические проявления, распространенность язвенного процесса и воспалительная реакция более выражены у самцов. При умеренном остром язвенном колите, индуцированном 1% ДСН, у самок выявлены компенсаторные изменения эпителиального барьера, среди секреторных эпителиальных клеток возрастает количество бокаловидных. В то же время развитие обеих форм острого язвенного колита у самок по сравнению с самцами происходит на фоне низкого содержания Т-регуляторных лимфоцитов. При хроническом язвенном колите у самок, по сравнению с самцами, воспалительный процесс в ободочной кишке более тяжелый, что обусловлено снижением содержания Т-регуляторных лимфоцитов. Напротив, у самцов количество регуляторных Т-лимфоцитов многократно повышается в периферической крови и брыжеечных лимфатических узлах. В отличие от самцов, у самок наблюдаются более выраженные компенсаторные изменения эпителиального барьера: у них высокая объёмная доля бокаловидных клеток, а у самцов этот показатель не отличается от контроля. Полученные в эксперименте результаты по половым различиям тяжести острого и хронического язвенного колита, нарушения эпителиального барьера и субпопуляционного состава лимфоцитов являются базовыми при проведении подобных исследований у человека и показывают, что лечение язвенного колита разными лекарственными средствами, включая иммунотропные препараты, следует проводить с учетом пола. Проведенные исследования по подтеме «Моделирование эпидермальной дифференцировки и корнификации в культуре клеток человек» позволяют заключить, что иммортализованные кератиноциты линии HaCaT возможно использовать в монослойной совместной культуре с дермальными фибробластами для первичного скриннинга процессов дифференцировки в эпидермальных кератиноцитах. Для адекватного моделирования процесссов эпидермальной корнификации более пригодны трехмерные живые эквиваленты кожи на основе первичных кератиноцитов человека.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Гистогенез и гистофизиология органов иммунной системы и барьерных тканей при адаптационных и воспалительных процессах.
Результаты этапа: Научно-исследовательскую работу проводили по следующим направлениям. 1. Исследование противоаллергических свойств митохондриально- направленного антиоксиданта на основе пластохинона SkQ1 и разобщителя окислительного фосфорилирования С12TPP в моделях in vitro и in vivo. Было исследовано влияние митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 и разобщителя окислительного фосфорилирования С12TPP на фрагментацию митохондрий в ходе антиген-зависимой дегрануляции опухолевых тучных клеток линии RBL-2H3. Митохондрии и секреторные гранулы клеток визуализировали с помощью специфических флуоресцентных зондов. Показано, что SkQ1 и C12TPP предотвращают фрагментацию митохондрий в стимулированных клетках RBL-2H3. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что мтАФК могут участвовать в дегрануляции тучных клеток посредством индукции фрагментации митохондрий. 2. Исследование влияния митохондриально- направленного антиоксиданта на основе пластохинона SkQ1 и разобщителя окислительного фосфорилирования С12TPP на индуцированную липополисахаридом провоспалительную активацию макрофагов (линия THP-1). Исследовали влияние митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 и разобщителя окислительного фосфорилирования С12TPP на активацию инфламмасом в макрофагах, дифференцированных из моноцитов линии THP-1. Стимуляцию макрофагов осуществляли в два этапа: праймирование с помощью липополисахарида и активация (АТФ или нигерицин). Активность инфламмасом определяли по уровню секреции цитокина IL-1β. Содержание цитокина в кондиционированной среде определяли методом ИФА. Показано, что предобработка дифференцированных клеток THP-1 SkQ1 перед добавлением активирующего сигнала приводит к достоверному увеличению активации инфламмасом С12ТРР и продукции IL-1β. Полученные данные свидетельствуют о том, что мтАФК ингибируют активацию инфламмасом в макрофагах. 3. Изучение влияния митохондриально-направленного антиоксиданта на основе пластохинона SkQ1 и разобщителя окислительного фосфорилирования С12TPP на острое воспаление в мышиной модели язвенного колита, индуцированного пероральным введением декстрансульфата натрия. К настоящему времени отработана модель острого язвенного колита in vivo, индуцируемую пероральным применением 1% раствора декстрансульфата натрия у самцов мышей линии C57Bl/6 в течение 6 дней. У опытных мышей наблюдались клинические признаки колита. Для микроскопического исследования изготовлены гистологические препараты. Предварительный микроскопический анализ выявил типичные картины острого воспалительного процесса в стенке кишечника животных с индуцированным колитом. Начат эксперимент по исследованию терапевтического потенциала группы митохондриально-направленных соединений (SkQ1, C12-TPP и динитрофенол) в данной модели. 4. Выявление половых гистофизиологических различий барьера толстой кишки у мышей C57BL/6 при стрессорном холодовом воздействии. После курсового холодового воздействия патологических изменений в ободочной кишке, изменений содержания клеточных элементов в слизистой оболочке, числа эндокринныхх клеток, объемной доли бокаловидных клеток и содержания в них нейтральных и высокосульфатированных муцинов после 14 дней ежедневного 10-20-ти минутного холодового воздействия не было выявлено ни у самцов, ни у самок мышей C57BL/6. У самцов мышей контрольной и опытной группы объемная доля бокаловидных клеток была меньше, чем у самцов. Таким образом, в выбранном режиме холодовое воздействие не оказывало стрессорного эффекта на гистофизиологию эпителиального барьера ни у самцов, ни у самок. 5. Определение роли клеточной адгезии в эффективности эпидермальной дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека. Плюрипотентные стволовые клетки человека способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков, то есть во все соматические клетки. Проведено исследование влияния отдельных компонентов внеклеточного матрикса – коллагена IY типа, фибронектина, ламинина и витронектина - на культивирование ИПСК человека и разработан протокол дифференцировки ИПСК в эпидермальном направлении. Для каждого из использованных матриксов была проведена оценка эффективности обеспечиваемой адгезии ИПСК и способности к поддержанию роста их колоний в течение нескольких пассажей, при этом наиболее эффективным при культивировании субстратом оказался ламинин. Разработан эффективный протокол эпидермальной дифференцировки плюрипотентных клеток. Полученные результаты будут использованы при создание тканевых эквивалентов кожи.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. MGU_NIR-2019-MakarovaOV.docx MGU_NIR-2019-MakarovaOV.docx 38,8 КБ 17 декабря 2019 [makarovov]