Механизмы выживания и гибели клетокНИР

.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Раздел 1. Проведенные прижизненные исследования (n=16) показали, что процесс энтоза в клетках культуры МСF7 занимает длительное время (до 72 ч). Внедрение клеток может происходить на стадии телофазы митотического деления. Так же внедряться могут предварительно ошарившиеся и частично открепившиеся от подложки клетки. Нами впервые было показано, что внедрение происходит в близлежащие клетки. Энтоз может заканчиваться деградацией поглощенной клетки и выбросом неперевариваемых остатков или выходом внедрившейся клетки. При этом вышедшая клетка может как успешно распластаться, так и погибнуть. Энтоз так же может закончиться гибелью энтозной клетки. Выход внедрившейся клетки является достаточно частым событием. Рапздел 2. Для исследования судьбы отдельных микроядер и микроядерной клетки в целом были проведены прижизненные исследования (24 ч) поведения клеток культуры MCF7 и А431 с множественными микроядрами (спонтанно-возникшими и индуцированными воздействием паклитаксела). В контроле было проанализировано 7 микроядерных клеток MCF7 и 3 микроядерные клетки А431. Так же были проанализированы 3 микроядерные клетки MCF7 и 2 микроядерные клетки А431 после воздействия паклитаксла (с последующей отмывкой агента). Проведенные прижизненные исследования показали, что клетки с микроядрами сохраняют жизнеспособность (не вступают в апоптоз) в течении 24 ч. При этом элиминация микроядер зарегистрирована не была. Для анализа особенностей строения микроядер методом трансмиссионной электронной микроскопии была проанализирована целостность ядерной оболочки, т.к. нарушения могут приводить к проблемам в микроядерно-цитоплазматическом транспорте. Методом иммуноцитохимического окрашивания были проведены исследования локализации ламина А и ламина В в микроядрах в клетках культуры MCF7 и начато исследование распределения ламина В в клетках культуры А431. Исследовали как спонтанно-образовавшиеся (одиночные), так и паклитаксел-индуцированные (множественные) микроядра. Анализ распределения ламинов показал, что спонтанно-образовавшиеся одиночные микроядра могут содержать ламины А и В в составе ядерной оболочки. Некоторые микроядра имеют частично нарушенную ядерную оболочку. Часть микроядер не окрашивается антителами к ламинам А и В. При исследовании множественных микроядер в одной клетки могут присутствовать как микроядра содержащие ламины А и В в составе ядерной оболочки, так и микроядра в которых ядерная оболочка нарушена в разной степени, вплоть до полного отсутствия ламинов. Такая разнородность может отражать степень деградации микроядер. Проникновение белка р53 в ядро приводит к активации транскрипции генов, блокирующих продвижение по клеточному циклу и проапоптотических генов. Было проведено исследование локализации белка р53 в микроядрах клеток культуры МСF7 (р53+). Показано, что только 16,25±2,3% одиночных микроядер окрашиваются антителами к белку р53. Большая часть спонтанно образовавшихся одиночных микроядер не окрашивается антителами к р53. При этом апоптотический индекс составляет не более 0,5%. Таким образом, наличие микроядер в клетках MCF7 может не вызывать остановку клеточного цикла и гибель клеток. В клетках с множественными микроядрами, образовавшимися при действии паклитаксела, р53 присутствует лишь в некоторых микроядрах в составе одной клетки. Избирательное окрашивание микроядер может быть связано с нарушением транспорта (нарушением строения ядерной оболочки). Кроме того, р53 может проникать в микроядра, содержащие двойные разрывы ДНК. В связи с этим начаты исследования ко-локализации белка р53 и ламина В, а также белка р53 и гистона гаммаН2Х, маркирующего двойные разрывы ДНК. Для анализа функциональной активности микроядер начато исследование возможности репликации ДНК в микроядрах клеток культуры А431 с помощью включения BrdU. В клетках культуры MCF7 включения BrdU в микроядра не происходит, т.к. эти клетки имеют активный белок р53, который вызывает остановку прохождения клеточного цикла в клетках с микроядрами. Раздел 3. Жизнеспособность клеток линий А431 и НаСаТ при действии СВЕ оценивали методом МТТ-теста. За 100% был принят контроль с добавлением спирта. Было установлено, что через 48 ч после инкубации с СВЕ статистически значимое снижение жизнеспособности клеток происходит при концентрации СВЕ 40 мкМ и выше. Так, при действии 40 мкМ СВЕ количество живых клеток снижается на 26%, при действии 60 мкМ – на 34%, при действии 100 мкМ – на 45%. В линии НаСаТ через 48 ч после начала инкубации с СВЕ значимое снижение жизнеспособности клеток – на 56% – происходит только при концентрации агента, равной 100 мкМ. Более низкие концентрации, такие как 20 мкМ, 40 мкМ и 60 мкМ, не вызывают статистически значимого эффекта. Таким образом, кератиноциты НаСаТ оказываются более устойчивыми к индукции гибели при действии СВЕ, чем клетки эпидермоидной карциномы А431. В клетках линий А431 и НаСаТ состояние грЭПР на светомикроскопическом уровне исследовали с помощью иммуноцитохимического выявления резидентных белков грЭПР с последовательностью KDEL. В то время как в контроле ЭПР имеет в них вид мелкой сетки, заполняющей практически весь объём цитоплазмы, после инкубации в присутствии 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч в отдельных клетках иногда появляются окрашенные области, имеющие вид крупных кластеров. На ультраструктурном уровне при воздействии обнаруживаются как цистерны грЭПР, по структуре сходные с таковыми в контроле, так и претерпевающие различные изменения: так, могут появляться протяжённые участки, лишённые рибосом, а также возникать локальные расширения каналов ЭПР. Для визуализации аппарата Гольджи было проведено иммуноцитохимическое выявление матриксного белка p58K. При этом обнаружено, что в контроле аппарат Гольджи образует протяжённые области вблизи ядра клетки. В клетках, культивировавшихся в присутствии 40 мкМ СВЕ, аппарат Гольджи приобретает вид отдельных компактных кластеров, также, как правило, прилежащих к ядру. На ультраструктурном уровне при воздействии СВЕ в клетках А431 цистерны аппарата Гольджи значительно расширяются; при этом расширенными оказываются как цис-, так и медиальные и транс-части. Цистерны могут приобретать овальную форму, увеличивается размер окружающих везикул. При воздействии 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч в цитоплазме клеток А431 обнаруживается значительное увеличение числа и размеров цитоплазматических везикул кислого конпартмента. Кроме того, обнаруживается окрашивание цитоплазмы, которое может свидетельствовать об утечке красителя вследствие повреждения мембран. Значительное увеличение числа и размера везикул после инкубации клеток А431 в присутствии 40 мкМ СВЕ обнаруживается также на ультраструктурном уровне; среди них встречаются везикул, окружённые двойной мембраной. Такие везикулы представляют собой аутофагосомы. Аналогичные исследования были проведены в клетках линии НаСаТ. Результаты, полученные в данном случае, сходны с таковыми в линии А431, но имеют место при более высокой концентрации агента – 60 мкМ, в то время как при действии 40 мкМ картина практически не отличается от таковой в контроле. Для оценки роли стресса ЭПР в гибели клеток А431 и НаСаТ, а также исследования морфологических признаков стресса ЭПР, было проведено исследование действие на клетки дитиотреитола - восстанавливающего агента, который благодаря разрушению ддисульфидных связей нарушает сворачивание белков в полости грЭПР и таким образом индуцирует стресс. Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ-теста. Были протестированы концентрации ДТТ величиной 0,5 мМ, 1 мМ, 2 мМ и 4 мМ. По данным четырёх независимых экспериментов обнаружено, что по сравнению с контролем жизнеспособность клеток при данных концентрациях составляет 103 ± 5%, 100 ± 7 %, 87 ± 10% и 65 ± 19%, соответственно. В линии НаСаТ величина выживаемости при данных концентрациях составляет 93 ± 8%, 82 ± 9%, 65 ± 10% и 38 ± 7%, соответственно. Таким образом, клетки эпидермоидной карциномы человека оказываются более устойчивыми к действию данного агента, чем НаСаТ. Также было проведено предварительное исследование морфологии клеток на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. В линии А431 при концентрации 2 мМ ДТТнаблюдается значительное изменение морфологии клеток: они приобретают вытянутую, веретеновидную форму, цитоплазма их поджимается. При концентрации 1 мМ такие изменения выражены слабее и встречаются у относительно немногих клеток, а при действии 0,5 мМ картина практически не отличается от таковой в контроле. Сходная картина наблюдается и в линии НаСаТ. Раздел 4. Методом сканирующей микроскопии получены данные об изменении характера поверхности и активности мембраны в течение 6 часов постановки эксперимента на 3 сутки дифференцировки. На данном сроке большинство клеток (95-96%) в культуре ТНР-1 активно фагоцитируют, и состояние их плазматической мембраны находится в момент активного фагоцитоза, в части популяции наблюдается эффект после поглощения частиц. При фагоцитозе Fc-меченных частиц на поверхности плазматической мембраны клеток наблюдаются многочисленные выросты и формирование псевдоподий. Более 90% всей поверхности клеток активно. Размер выростов колеблется в диапазоне от 0,5 до 2 мкм. При этом псевдоподии могут достигать 3-4 мкм. Активная поверхность плазматической мембраны характерна для разных морфологических типов клеток: моноцитоподобных, макрофагоподобных «поляризованного» и «неполяризованного» типов. При фагоцитозе Man-частиц на поверхности плазматической мембраны не наблюдается активности. Плазматическая мембрана клеток формирует многочисленные складки, при этом выросты и псевдоподии отсутствуют. Наблюдается сглаживание поверхности клеток. Такое состояние мембраны показывает снижение фагоцитарной активности клеток на данном сроке, характерное для всех морфологических типов. При фагоцитозе Gel-частиц наблюдается различия в состоянии поверхности плазматической мембраны клеток. Доля клеток (50-60%) в популяции имеет многочисленные выросты и псевдоподии на мембране, что свидетельствует об активном состоянии мембраны. Встречаются в основном в макрофагоподобных клетках «неполяризованного» и «поляризованного» типов. При этом в популяции одновременно присутствуют клетки (примерно, 30-40%), мембрана которых сглажена. Это характерно для моноцитоподобного типа клеток и клеток с небольшими отростками. На мембране этих клеток отсутствуют выросты и псевдоподии, наблюдается формирование небольших складок, что свидетельствует о сниженном уровне их фагоцитарной активности. Для оценки влияния ЭЛС на фагоцитарную активность макрофагов в настоящем исследовании были использованы разные экспериментальные модели: 1) бронхо-алвеолярный лаваж (БАЛ) больных диссеминированным туберкулёзом. В исследовании были использован метод ТЭМ. Введение препарата ЭЛС в БАЛ больных диссеменированным туберкулёзом вызывает: снижение числа АМ(I) с 40% до 25%; активацию клеточной поверхности (появление многочисленных псевдоподий), фагоцитоз мембран PS; появление крупных фаголизосом в обеих субпопуляциях АМ. Раздел 5. Для выполнения поставленной задачи был использован комплексный набор методов. Для анализа морфологии клеток мы использовали световую микроскопию. Просвечивающую электронную микроскопию использовали для исследования ультраструктуры клеток и локализации поглощенных нанотрубок. Метод дифракции электронов был применен для детекции наночастиц в клетках и подтверждения их химическую природы. В эпителиальном слое желудка, тонкой и толстой кишки экспериментальных животных нами были выявлены локальные повреждения в виде нарушений эпителиального слоя: при окрашивании гематоксилин-эозином такие области имели вид светлых, рыхлых зон, располагающихся преимущественно в апикальной части ворсинок. Анализ ультраструктуры данных тканей с помощью электронной микроскопии показал, что в эпителиальном слое таких животных присутствовали группы клеток, находящихся на разных стадиях некротической гибели. Нами также наблюдались дистрофические изменения в печени: в области центральной вены цитоплазма гепатоцитов отличалась сильной неоднородностью окрашивания, содержала светлые зоны. Признаков воспалительного процесса в не выявлено. Исследование на полутонких срезах морфологии клеток показало, что в цитоплазме гепатоцитов присутствовали липидные капли размером 1-4 мкм и светлые вакуоли размером до 2-4 мкм. Гепатоциты были увеличены в размерах, также наблюдалась неоднородность цитоплазмы. Ультраструктурный анализ гепатоцитов показал зональное повышение встречаемости липидных включений неоднородной структуры, некоторые капли включали в себя зоны разной электронной плотности. Светлые вакуоли имели низкую электронную плотность, что свидетельствовало о гидратированном содержимом. Таким образом, выявленные ультраструктурные изменения в гепатоцитах указывают на развитие паренхиматозной дистрофии печени смешанного типа - жировой и гидропической. Нами не были выявлены накопления МУНТ в клетках и тканях исследованных органов. Таким образом, остается открытым вопрос, касающийся их проникновения через эпителиальный барьер тонкого кишечника, накопления или биодеградации в организме. В работе использовали МУНТ в составе промышленного материала «Таунит», а также МУНТ в составе промышленного материала «Деалтом». Оба наноматериала отличаются методами их промышленного получения, а также уровнем дефектности по углерод-углеродным связям («Деалтом» является менее дефектным). В качестве биологического окислителя использовали гипохлорит натрия в концентрациях 1 мМ и 100 мМ. Материал исследовали методами трансмиссионной и аналитической электронной микроскопии, а также использовали Рамановскую спектроскопию для выявления дефектов структуры. Модель макрофагального захвата МУНТ была отработана на клетках линии ТНР. Было установлено, что данный тип клеток способен захватывать кластеры нанотрубок и длительное время удерживать в фагосомах. На ультрастуктурном уровне наноматериал в фагосомах имеет высокую электронную плотность и хорошо выявляется. В ходе электронно-микроскопического исследования проинкубированных с гипохлоритом натрия (высокой и низкой концентраций) образцов, нами было продемонстрировано изменение внешнего вида обоих наноматериалов, выраженное в истончении стенок нанотрубок. Обработка гипохлоритом натрия в низкой концентрации привела к изменению внутреннего диаметра обоих наноматериалов в сторону его увеличения. При этом эффект высокой концентрации NaClO для двух типов нанотрубок оказался различным. Внутренний диаметр обработанных нанотрубок «Таунит» относительно контрольных увеличился, в то время как внешний диаметр при этом остался неизменным. Увеличения внутреннего диаметра наблюдались как локально, так и по всей длине нанотрубок. Нанотрубки «Диалтом» продемонстрировали повреждения стенок как с внутренней, так и с наружной стороны. Методом дифракции электронов было показано, что дифракционные кольца, характерные для МУНТ, остаются без изменений. Для подтверждения изменений в структуре МУНТ и оценки изменений количества дефектов, нами была использована Рамановская спектроскопия. Было установлено, что в ходе обработки обоих типов нанотрубок, количество структурных дефектов в них снижалось. Это позволяет сделать вывод, что гипохлорит натрия, окисляя поврежденные участки и разрушая их, способствует тому, что неповрежденными остаются графеновые слои с низким уровнем структурных дефектов. Для ответа на вопрос касательно деградации МУНТ в желудке, мы проинкубировали суспензию наноматериала «Таунит» с желудочным соком мыши. После инкубации основное количество МУНТ претерпело структурные изменения в виде повреждения внутренних и наружных стенок, или полного исчезновения трубчатой формы. При этом методом дифракции электронов были получены электронограммы, схожие с эталонными. Раздел 6. Клинический материал получен в ЦНИИ Туберкулёза. Для анализа выбран материал ткани лёгких с фиброзно-кавернозной формой туберкулёза (ФКТ). Для проведения сравнительного анализа забор материала производили из очагов некроза, разных участков перифокальной области и нормальной ткани. Для проведения ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) генов белков МЛУ каждый образец ткани замораживали в жидком азоте и размельчали в керамической ступке, затем там же гомогенизировали в 1 мл Tri-Reagent (MRC Inc., USA). Выделение тотальной РНК проводили в соответствии с протоколом производителя Tri Reagent. В области некроза тотальная РНК сильно разрушена в большинстве образцов, в связи с чем осуществлялся забор материала из области перифокальной зоны и нормальной лёгочной ткани. Результаты, полученные методом ОТ-ПЦР показали, что экспрессия белков МЛУ выявляется на достаточно высоком уровне во всех образцах и зонах анализа. Однако, применение метода РТ-ПЦР, который даёт более точные количественные данные, показало, что в операционном материале преобладает прежде всего экспрессия генов MDR1 и LRP, тогда как MRP1 и BCRP Определена линия мышей для изучения экспрессии генов белков МЛУ и предварительно проведён подбор праймеров и условий анализа экспрессии белков МЛУ в лёгочной ткани мышей. Для предварительного выбора модели проанализирован уровень экспрессии белков МЛУ в лёгких мышей различающихся уровнем чувствительности к заражению вирулентным штаммом M.tuberculosis. После оценки уровня экспрессии белков МЛУ сделан выбор в пользу линии BALB, так как мыши данной линии отличались наиболее низким уровнем экспрессии белков МЛУ в нормальной лёгочной ткани. Это означает, что при индукции активности этих белков можно с наибольшей степенью вероятности выявить увеличение экспрессии генов белков МЛУ. После заражения забой мышей проводился на следующие сроки эксперимента: 14, 28, 90 и 180 дней. Полученные методом ОТ-ПЦР результаты показали, что наиболее значимо возрастает экспрессия гена mdr1a; экспрессия гена bcrp практически не изменяется, гена lrp – варьирует и находится на низком уровне экспрессии для гена mrp1. Раздел 7. Однократное кратковременное (15 мин) световое воздействие слабым синим светом (λ440–470 нм, 1 дж/см2) на глаза очень старых (78-недельных) перепелов вызывает увеличение на 20% содержания митохондрий в клетках РПЭ без изменения их формы и ультраструктуры. Морфометрический анализ на электронномикроскопическом уровне хондриома рпэ японских перепелов разного возраста, содержащихся в условиях постоянного облучения синим (λ 440–470 нм), желтым (λ 530-560 нм) или обычным светом при сходной слабой дозе освещенности (1 дж/см2) показал, что при синем освещении численность митохондрий у птиц всех возрастов выше, чем в контрольных группах, особенно у молодых птиц (в 1,5 раза). При этом удельный объем митохондрий не изменился, т.е. они в целом более мелкие. Наряду с этим значительно повысилось количество и удельный объем видоизмененных мтх - кольцевидной и гантелевидной формы, особенно у молодых птиц ( в 2,5 раза и в 1,6 раза соответственно, у старых птиц – в 1,8 и 1,4 раза). Ранее мы показали (зак и др., 2014) повышение содержания таких митохондрий в рпэ как по мере старения, так и после сильного однократного освещения синим светом глаз интактных перепелов. Образование подобных митохондрий описано в разных культурах клеток в условиях метаболического стресса (liu, hajnoczky, 2011). Поскольку такие органеллы обладают увеличенной площадью поверхности, полагают, что повышение их числа отражает стресс-адаптивную реакцию клетки, обеспечивая более высокие уровни энергетического обмена (roehlecke et al, 2009; ahmad et al, 2013). Удельная площадь поверхности крист в митохондриях после синего освещения оказалась незначительно (на 10%) снижена в разных возрастных группах, в большей степени – у видоизменённых митохондрий молодых птиц (на 22 %). Поскольку количество митохондрий повышено гораздо значительнее, суммарный эффект изменений хондриома в клетках РПЭ - увеличение общей рабочей площади энергопродукции. Проведена оценка общей окислительной метаболической активности клеток рпэ взрослых перепелов (35-недельных) биохимическим методом путем инкубации суспензии свежевыделенных клеток с ресазурином. Установлено, что окислительная метаболическая активность клеток рпэ у птиц, содержавшихся при синем повседневном освещении, выше в1,5 раза по сравнению с птицами, выращенными при жёлтом свете. Для выявления апоптотических ядер в клетках рпэ проведен tunel-анализ срезов сетчатки перепелов разного возраста. установлено, что у молодых птиц (15-25 недель) апоптотические ядра отсутствуют, а у старых птиц (52-55 недель) составляют 7 % от всех ядер. после короткого (40 минут) мощного облучения синим светом апоптотические ядра появляются у молодых птиц в количестве 4 %. после повседневного низкодозового синего освещения птиц такие ядра у молодых птиц отсутствуют. у старых птиц количество апоптотических ядер при разных световых режимах достоверно не менялось. Для выявления «закрытых» хориокапилляров в собственной сосудистой оболочке (ссо) глаз японских перепелов разного возраста при повседневном действии синего света проведено гистохимическое исследование ссо с помощью α-gal/nac-gal-специфичного лектина maclura pomifera agglutinin (mpa), избирательно окрашивающего эндотелий японского перепела. морфометрический анализ показал, что при старении птиц доля открытых хориокапилляров постепенно повышается (на 40%). при повседневном синем освещении доля открытых хориокапилляров у молодых птиц значительно возрастает по сравнению с контрольной группой (в 1,5 раза), а у старых птиц снижается на 28% от контрольных значений. Для определения степени проницаемости хориокапилляров ссо проведен их морфомерический анализ на электронномикроскопическом уровне. установлено, что число фенестр в эндотелии хориокапилляров со стороны рпэ с возрастом увеличивается, несколько снижаясь после 36 недель, число трансэпителиальных каналов (тэк) в это же время снижается на 27%. Повседневное синее освещение приводит к повышению числа фенестр в 2 раза у молодых птиц, при этом численность тэк не меняется. в остальных возрастных группах различий нет. Выполнен анализ на световом и электронномикропическом уровнях миокарда правого и левого желудочков очень старых -78-недельных перепелов Coturnix japonica. На светооптическом уровне отмечено в обоих отделах визуальное увеличение доли соединительной ткани и диаметра кардиомиоцитов по сравнению с более молодыми перепелами, более извилистый ход мышечных волокон. На электронно-микроскопическом уровне выявлено, что ядра кардиомиоцитов левого и правого желудочков имеют, как правило, неровные, иногда сильно инвагинированные границы, что характерно для кардиомиоцитов птиц независимо от возраста. Миофибриллы формируют пучки разной толщины, нередко отмечались зоны их истончения и разволокнения, но их относительный объем соответствует уровню у молодых птиц (48-49%). Митохондрии гетерогенны по своей ультраструктуре, встречаются их удлиненные профили, что описано и в миокарде человека при ряде патологий и при старении. Их относительный объем не отличается от значения у молодых птиц (29%). Кольцевидные митохондрии, отмеченные ранее в правом предсердии птиц средней и старшей возрастных групп, встречаются в правом, но не в левом, желудочке уже у молодых птиц и не увеличиваются с возрастом. В отличие от более молодых птиц на данном сроке в обоих отделах наблюдаются в сравнительно равном количестве крупные липофусциновые гранулы и миелиноподобные тельца - возможно, признаки деградации митохондрий, а также значительное количество липидных гранул, более выраженное в правом отделе.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Получены следующие результаты. При исследовании возможности нарушения внедрения одной клетки в другую при энтозе с помощью наночастиц показано, что воздействие наночастицами диоксида титана в культуре клеток MCF-7 подавляет процесс энтоза за счет нарушения формирования адгезионных контактов. При исследовании поздних стадий энтоза в клетках культуры MCF-7 с помощью прижизненных наблюдений и окрашивания витальными лизотрекерами обнаружено, что после лизосом-опосредованной деградации внедрившейся клетки неперевариваемые остатки подвергаются экструзии. Изучение роли стресса ЭПР в процессе апоптотической гибели как нормальных, так и опухолевых клеток было исследовано путем индукции стресса ЭПР воздействием дитиотреитолом (ДТТ) и бортезомибом. ДТТ представляет собой восстанавливающий агент, нарушающий формирование дисульфидных связей при сворачивании белков в люмене ЭПР. Бортезомиб является ингибитором протеасом. Методами световой микроскопии в светлом поле, флуоресцентной микроскопии, МТТ-теста, проточной цитофлуориметрии, трансмиссионной электронной микроскопии, ПЦР в реальном времени и морфометрии продемонстрировано, что ДТТ вызывает дозозависимую индукцию апоптоза в линии клеток эпидермоидной карциномы человека А431 и нормальных кератиноцитов человека НаСаТ, что сопровождается изменением формы клеток и морфологии аппарата Гольджи, причём клетки А431 проявляют большую устойчивость к воздействию, чем НаСаТ. Также показано дозозависимое цитотоксическое действие бортезомиба по отношению к клеткам А431; эффект не исчезает после устранения агента из среды культивирования. Кадмий является очень токсичным тяжелым металлом, способным накапливаться в различных тканях и органах человека, в том числе в головном мозге, что может вызывать нейродегенеративные процессы. Используя культивированные нейроны мозжечка крыс, мы продемонстрировали, что присутствие 1-5 мкМ кадмия в среде культивирования нейронов в течении 48 часов вызывает интенсивную гибель этих клеток. Используя Fluo-4 AM -специфический флуоресцентный зонд для регистрации внутриклеточного свободного кальция было показано, что 24-х -часовая обработка культивированных нейронов кадмием вызывает интенсивное увеличение флуоресценции Fluo-4 в цитоплазме этих клеток, что соответствует повышению в их цитоплазме содержания ионов кальция. Этот эффект частично предотвращался 1 мМ ацетилцистеина (NAC) или 5 мкМ ионов марганца. Одним из цитогенетических признаков хромосомной нестабильности является присутствие в клетках микроядер. Для решения вопроса о том, какую роль играет наличие микроядер и их происхождение в выживании и гибели опухолевых клеток были исследованы культуры клеток карциномы кожи человека (А431) и карциномы молочной железы (MCF-7). Показано, что популяция спонтанно образовавшихся микроядер в клетках культур А431 и MCF-7 отличается гетерогенностью по строению ядерной оболочки, наличию двунитевых разрывов ДНК, способности к репликации и накоплению белка р53.Выживаемость и гибель клеток с микроядрами может зависить от особенностей строения и функциональной активности микроядер. Изучение реализации фагоцитарной функции макрофагов имеет важное фундаментальное и прикладное значение для понимания их роли в защитных реакциях и развитии патологических процессов. В представленной работе продемонстрирована пластичность фагоцитарной активности клеток ТНР-1 (острая моноцитарная лейкемия человека) в процессе прохождения ими разных этапов макрофагальной дифференцировки по провоспалительному типу активации (М1 макрофаги). В процессе дифференцировки общая фагоцитарная активность клеток существенно возрастает, и фагоцитоз реализуется преимущественно через Fc-рецепторы, характерные для М1-макрофагов. На 7-е сутки дифференцировки, наряду с высоким уровнем фагоцитоза Fc- и Gel-частиц, активируется поглощение Mаn-частиц через маннозные рецепторы, что свидетельствует о проявлении активации М2-макрофагов. Полученные данные позволяют сделать вывод, что реализация и пластичность фагоцитарной активности клеток выявляются на определенных стадиях дифференцировки и связаны с формированием функционально-зрелого морфологического фенотипа. Многостенные углеродные трубки (МУНТ) могут оказаться в клетках многоклеточного организма в результате техногенных процессов, либо при их применении в качестве носителей для лекарственных препаратов. Для решения вопроса о судьбе МУНТ, оказавшихся в клетках и тканях многоклеточного организма, была изучена деградация двух типов промышленных МУНТ со схожими параметрами (с изначально одинаково высоким уровнем дефектов и толщиной стенок) под действием периодических добавок 1 мМ или 100 мМ гипохлорита натрия в качестве биологического окислителя. В работе использованы методы трансмиссионной, сканирующей, аналитической электронной микроскопии, а также Рамановская спектроскопия и энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия. Показано, что оба типа промышленных МУНТ подвергаются деградации, но динамика и выраженность данного процесса сильно различаются. В настоящее время возможность активации механизмов лекарственной устойчивости к противотуберкулёзным препаратам на уровне соматических клеток изучена недостаточно. Такая возможность существует прежде всего за счёт активации АТФ-связывающих белков-транспортёров, локализующихся на плазматической мембране соматических клеток разного происхождения и обеспечивающих формирование «множественной лекарственной устойчивости» (МЛУ). В работе проведён анализ экспрессии генов основных белков, отвечающих за развитие и формирование механизма МЛУ в клетках человека и показано, что в туберкуломах лёгких человека выявляется наиболее высокая экспрессия гена mdr1 - одного из основных генов МЛУ. Для решения вопроса о влиянии длительного действия синего света низкой интенсивности на клетки и ткани глаза в разных возрастных группах многоклеточных организмов проведен сравнительный морфометрический анализ на светооптическом и субмикроскопическом уровне возрастных изменений сетчатки у быстростареющих японских перепелов (Сoturnix japonica), используемых как модель человеческого глаза, содержавшихся при разных условиях освещения. Установлено, что повседневное действие низкодозового синего света ( коротковолновая часть спектра белой светодиодной лампы, λ440–470 нм), по сравнению с освещением, содержащим желтый спектр, вызывает в зоне глазного дна, а также в макулярной зоне разнохарактерные изменения толщины сетчатки, фотосенсорного слоя и размеров клеток (высоты тел и длины апикальных отростков) ретинального пигментного эпителия (РПЭ) - эти изменения наиболее выражены у молодых птиц. На тотальных препаратах РПЭ установлено уменьшение средней площади клеток у молодых и взрослых птиц в той же степени, что происходит у птиц старшего возраста, содержавшихся при желтом освещении. В фотосенсорном слое сетчатки у молодых и средневозрастных перепелов изменяется процентное содержание колбочек разной светочувствительности и соответствует этому показателю для старых птиц. На основе электронномикроскопического анализа численности субклеточных компонентов эндотелия хориокапилляров ССО (фенестр, трансэпителиальных каналов, межклеточных контактов, псевдоподий) и их распределения по разным сторонам капилляров установлено, что структурно-функциональная поляризация хориокапилляров на внутреннюю и внешнюю стороны с возрастом становится менее выраженной, а повседневное синее освещение приводит к более раннему и более значительному перераспределению структурных компонентов эндотелиальных клеток. Для получения полной картины возраст-зависимых процессов в сердце японского перепела (Сoturnix japonica), используемого как модельного объекта для изучения патологических и возрастных процессов в сердце млекопитающих и человека, проведено исследование клеточной гибели в миокарде желудочков юных неполовозрелых (возраст 6 недель) и старых перепелов (78 недель). Не выявлено методом TUNEL апоптотической гибели клеток в миокарде левого и правого желудочков юных птиц, однако у старых перепелов были единичные случаи апоптотических клеток. Такие данные согласуются с известными для сердца млекопитающих, что подтверждает возможность применения японского перепела как модельного объекта для возрастных процессов в сердце млекопитающих. Зон некрозов не выявлено в миокарде желудочков птиц всех возрастов. Также проведен ультраструктурный морфометрический анализ кардиомиоцитов желудочков 6-недельных (юных) перепелов. По сравнению с более старшими возрастными группами, на этом сроке в клетках миокарда в объеме цитоплазмы преобладают не миофибриллы, а митохондрии, что более выражено в правом желудочке. На основании этих и ранее полученных ультраструктурных данных можно заключить, что внутриклеточные признаки развития возрастных изменений весьма сходны в сердце птиц и млекопитающих.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Проблема сохранения жизнеспособности опухолевых клеток после воздействия химиотерапевтическими препаратами остаётся одной из наиболее актуальных проблем в области биологии опухолевых клеток и онкологии. Проведённое нами исследование показало, что после воздействия таким химиотерапевтическим препаратом, как паклитакселом до 65% клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека (MCF-7) сохраняют жизнеспособность в течение 7 сут. Воздействие паклитакселом с последующим удалением агента приводит к формированию популяции клеток с микроядрами, характеризующимися наличием повреждений ядерной оболочки, возникновением двунитевых разрывов ДНК, низкой пролиферативной активностью и активацией белка р53. Бортазомиб также является одним из наиболее применяемым в химиотерапии опухолей препаратом. В нашей работе обнаружено, что бортезомиб вызывает снижение жизнеспособности клеток как эпидермоидной карциномы А431, так и нормальных кератиноцитов НаСаТ; эффект при этом носит дозозависимый характер, а устойчивость обеих исследованных клеточных линий к воздействию данного агента примерно одинакова. После снятия воздействия снижение выживаемости клеток продолжилось. В обеих линиях бортезомиб вызывает повышение уровня экспрессии маркёров стресса ЭПР, таких как ATF4, CHOP и GRP78. На ультраструктурном уровне в клетках линии НаСаТ обнаруживается значительное расширение каналов ЭПР, а также изменение ультраструктуры митохондрий, несмотря на то, что выход цитохрома с обнаружен не был. При использовании ДТТ также наблюдается дозозависимый эффект, но при снятии воздействия жизнеспособность клеток может увеличиваться. Выход цитохрома с в процессе воздействия как бортазомибом, так и ДТТ на клетки НаСаТ не выявлен. Это свидетельствует об отсутствии участия митохондриального механизма в индукции апоптоза данными агентами. Таким образом, именно стресс ЭПР является механизмом запуска апоптоза при воздействии как бортезомибом, так и ДТТ в клетках НаСаТ и А431. Явление стресса ЭПР было обнаружено также при действии растительных гормонов. Показано, что все изученные растительные гормоны активируют гены стресса ЭПР, но последовательность активации генов через 24 часа воздействия - разная у нормальных и опухолевых клеток. Абсцизовая кислота (АБК) и гиберрелиновая кислота (ГК) оказывают разное влияние на компоненты секреторно-синтетической системы культивируемых клеток соединительнотканного происхождения. Мы предполагаем, что в дермальных фибробластах АБК вызывает активацию процессов, связанных с ЭПР-фагией, а в клетках фибросаркомы НТ1080 – с дифференцировкой клеток. ЖК стимулировала увеличение содержания аутофагосом в популяции клеток эпидермоидной карциномы А431 и не оказывала такого влияния на иммортализованную линию кератиноцитов НаСаТ. Появление аутофагосом может быть следствием стресса ЭПР и одним из признаков дифференцировки кератиноцитов. Судьба наноалмазов к клетках человека интересна как с позиций возможности применения этих наночастиц в качестве носителей лекарственных препартов, так и с позиций нанобезопасности. Полученные результаты свидетельствуют, что наноалмазы могут окисляться под действием биологически активных окислителей, которые образуются макрофагами. Это может иметь практическое применение в области биомедицинских исследований, так как свидетельствует о возможности деградации наноалмазов в макрофагах. Исследование механизмов выживания клеток при действии противотуберкулёзных препаратов проводилось с целью выявления роли белков множественной лекарственной устойчивости. В результате было обнаружено, что в лёгких экспериментальных животных не только выявляется экспрессия основных генов МЛУ при экспериментальном туберкулёзе, но и их экспрессия индуцируется при химиотерапии рифампицином. На культивированных клетках-зернах мозжечка крыс показано влияние ионов цинка на процесс гибели этих клеток, вызванной глутаматной токсичностью или окислительным стрессом. Продемонстрировано, что ионы цинка в нетоксических концентрациях способны повышать выживаемость нейронов при ряде негативных воздействий. Облучение синим светом в низких дозах (≤ 1 Дж/см2) оказывает фотобиомодуляционный эффект на клетки РПЭ старых птиц, стимулируя их метаболическую активность и активность их митохондрий посредством фотоактивации цитохром с оксидазы, а также повышая содержание митохондрий. Длительное освещение низкодозовым синим светом сказывается на состоянии мембраны Бруха, особенно у молодых птиц, что может привести к нарушению проницаемости гематоретинального барьера. Также оно способно изменять миграционную активность эндотелиальных клеток. Облучение синим светом в низких дозах (≤ 1 Дж/см2) оказывает фотобиомодуляционный эффект на клетки РПЭ старых птиц, стимулируя их метаболическую активность и активность их митохондрий посредством фотоактивации цитохром с оксидазы, а также повышая содержание митохондрий. Полученные данные по состоянию микроциркуляторного русла перепелов об отсутствии возраст-зависимых изменений в миокарде желудочков отличаются от имеющихся данных по миокарду млекопитающих при старении, указывая на границы применимости перепела как модельного объекта для изучения возрастных процессов в сердце млекопитающих и человека. Данные по ультраструктурным изменениям предсердных кардиомиоцитов указывают на гетерохронное развитие возрастных изменений в разных отделах сердца перепела, с более быстрым старением в секреторных кардиомиоцитах предсердий, выраженным уже у птиц среднего возраста. Однако в целом возрастные изменения предсердных кардиомиоцитов перепела совпадают с описанными для желудочковых, и с известными для миокарда млекопитающих, включая человека. Комплексное изучение структуры компонентов ядра и цитоплазмы клеток антиподальных комплексов зародышевых мешков пшеницы в ходе программируемой клеточной гибели показало, что уплотнение хроматина, разрывы ДНК, выявляемые методом TUNEL, выход цитохрома с из митохондрий, выявляемые при гибели антиподальных клеток оплодотворенных зародышевых мешков пшеницы, характерны для апоптоз-подобного типа клеточной гибели по классификации Reape and McCabe (Reape and McCabe, 2013). Разрушение тонопластов вакуолей и деградация органелл большей части антиподальных клеток неоплодотворенных зародышевых мешков, события аналогичные, происходящим при вакуолярной клеточной гибели (Van Doorn et al., 2011). Длительное воздействие 10мкМ латрункулина В в отсутствии сети актиновых филаментов нарушаются все системы микротрубочек интерфазных и митотических клеток. Веретено деления не формируется. Изменяется структура ядерной оболочки. Нарушается цитокинез.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Проведенное исследование показало, что для достижения различных целей можно применять различные криопротекторы: для первичных кератиноцитов использование РЕ10 и CS10 позволяет максимально быстро увеличить количество клеток, добавление LA к PE10 и CS10 может смещать баланс в сторону дифференцировки клеток. Данные, полученные при исследовании клеток с микроядрами, позволяют предположить, что в культуре НаСаТ спонтанно возникающие полиплоидные клетки вступают в патологический митоз, завершающийся образованием клеток с МЯ, которые элиминируются из популяции путем апоптотической гибели. Индуктор стресса ЭПР ДТТ и растительные гормоны АБК и ГК не вызывают снижение жизнеспособности дермальных фибробластов человека при 24-часовой инкубации в диапазоне концентраций от 0,5 до 4 мМ: исследуемые агенты не вызывают гибели клеток и не приводят к задержке прохождения клеток по клеточному циклу. При действии АБК и ГК наблюдается разная последовательность активации генов стресса ЭПР у дермальных фибробластов; и активация одного из генов дифференцировки происходит только при действии АБК. Полученные результаты показывают, что исследуемые РГ индуцируют стресс ЭПР в клетках НаСаТ и А431 по разному механизму, в частности, активация маркёра стресса ЭПР GRP78 после инкубации с ЖК наблюдалась только в иммортализованнх кератиноцитах, а после инкубации с ГК – только в клетках эпидермоидной карциномы. В то же время, ЖК стимулировала аутофагию только в клетках А431, а ГК – в обоих типах клеток. В культурах HaCaT и А431 воздействие индуктора стресса ЭПР ДТТ не вызывает изменений в структуре ЭПР ни на световом, ни на ультраструктурном уровне. Воздействие 75 нМ бортезомиба приводит к расширению каналов ЭПР, которое регистрируется только на ультраструктурном уровне и сохраняется после снятия воздействия в обеих культурах HaCaT и А431. 25 нМ бортезомиб вызывает обратимое расширение цистерн ЭПР только в культуре HaCaT. Воздействие 2 мМ ДТТ, 75 нМ и 25 нМ бортезомиба не приводит к изменениям в структуре аппарата Гольджи. Увеличение уровня экспрессии маркерных генов стресса ЭПР (GRP78, ATF4 и CHOP) при инкубации клеток HaCaT и А431 с 2 мМ ДТТ и с 75 нМ бортезомибом. Явление анастаза после снятия воздействия 2 мМ ДТТ и 25 нМ бортезомиба не обнаружено. Модельный коньюгат (ND-TCPP) образован наноалмазом (ND) и мезо-тетра(4-карбоксифенил)порфирином (TCPP). Показано, что отдельные наноалмазы-ТСРР имеют полигональную форму и размеры 4-7 нм. В макрофагах человека ND-ТСРР выявляются в виде электронно-плотного материала внутри многочисленных эндосом, размер которых варьирует от 200 нм до 3 мкм. При этом в структуре макрофагов не выявлено выраженных патологических изменений, что позволяет предположить, что присутствие данного вида наночастиц в отсутствии сенсибилизации не оказывает токсического действия на клетки человека. Наноалмазы без флуорохрома характеризуются увеличением содержания кислорода в 1,5 раза после их длительной инкубации (в течение 10 дней) с макрофагами ТНР-1. Это свидетельствует об окислении таких наночастиц внутриклеточными биологически-активными веществами макрофагов человека. При этом методы аналитической ТЭМ не позволяют провести анализ степени биодеградации наночастиц алмаза при их конъюгации с флуорохромом. Проведена оценка фагоцитарной активности клеток ТНР-1 на разных сроках макрофагальной дифференцировки (3 и 7 суток) и при разной длительности фагоцитарного процесса (3 и 6 часов инкубации). Оценка фагоцитарного индекса и интенсивности фагоцитоза проведена двум методами с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и проточной цитометрии с визуализацией. Предварительные данные показали, что оба метода дают сравнимые результаты анализа. Наибольшая фагоцитарная активность макрофагов регистрируется при рецепторном фагоцитозе латексных частиц с IgG, что свидетельствует о преобладании М1 пути активации макрофагов. Осуществлён подбор праймеров для анализа уровня экспрессии про- и противовоспалительных генов и генов множественной лекарственной устойчивости в макрофагах человека. Поставлены эксперименты на модели макрофагов человека линии ТНР-1 с применением разных латексных частиц для индукции конститутивного и разных вариантов рецепаторного фагоцитоза. Показано, что более дифференцированные нейроны, в условиях in vitro, более чувствительны к кадмиевой токсичности. Данные по возраст-зависимым изменениям в митохондриоме миокарда перепелов подтверждают ранее выявленное нами по другим параметрам гетерохронное развитие возрастных изменений в разных отделах сердца, с более быстрым старением в секреторных КМЦ предсердий птиц. В целом японский перепел может быть рекомендован в качестве модели ускоренного старения желудочков, но не предсердий, сердца млекопитающих. Введение ММСК-ПК человека снижает развитие деструктивных изменений миокарда сердца крыс в остром и хроническом постинфарктном периоде при индуцированном изопротеренолом инфаркте; более выраженный эффект имеют ММСК, культивируемые в 3D условиях. Мелатонин в зависимости от применяемой дозы оказывает негативное воздействие на морфологию и митотическую активность клеток культуры ARPE-19. Однако его действие в низких концентрациях обратимо и не изменяет потенциал-образующую способность хондриома. Непосредственное действие мелатонина на глаза японских перепелов вызывает смещение меланосом в клетках РПЭ и изменение в них доли митохондрий аномальной формы. На основании трехмерной реконструкции выделенных политенных хромосом антиподальных клеток, находящихся на разных стадиях онтогенеза, отдельных участков плеч политенных хромосом, и анализа их ультраструктуры, предложена модель структуры политенных хромосом растений. Разработана методика получения препаратов распластанных политенных хромосом растений.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Исследование обратимости цитотоксического эффекта различных концентраций сукцината витамина Е (СВЕ) после снятия воздействия. α-Токоферилсукцинат (сукцинат витамина Е — СВЕ) представляет собой сукциниловый эфир α-токоферола — хорошо известного антиоксиданта. Вследствие этерификации СВЕ не обладает окислительно-восстановительной активностью. В многочисленных экспериментах было показано, что СВЕ обладает потенциальными противоопухолевыми свойствами по отношению к широкому ряду злокачественных клеток различного происхождения, при этом оказываясь значительно менее цитотоксическим по отношению к нормальным клеткам и тканям. В данной работе была протестирована возможность обратимости влияния СВЕ на выживание популяции клеток эпидермоидной карциномы человека при действии различных концентраций агента. Спустя 72 ч после снятия воздействия СВЕ обнаруживается, что при использовании концентраций СВЕ от 20 до 60 мкМ происходит восстановление числа жизнеспособных клеток до контрольного уровня. При этом при 100 мкМ СВЕ число жизнеспособных клеток составляет только 20% от контроля, при 150 мкМ и 200 мкМ – 6.3%. Таким образом, действие СВЕ на популяцию клеток А431 обратимо в течение 72 ч после отмывки и при концентрациях агента до 60 мкМ включительно. Исследование индукции стресса ЭПР в клетках А431 и HaCaT при воздействии туникамицином. Стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР) является потенциальным путем развития апоптотической гибели как нормальных, так и опухолевых клеток. Механизмы обратимости апоптоза после устранения проапоптотического воздействия с индукцией стресса ЭПР описаны скудно; связь стресса ЭПР, UPR (unfolded protein response) и развития опухолей представляет интерес для разработки новых методов лечения злокачественных новообразований. Туникамицин — один из самых распространенных индукторов стресса ЭПР, применяемых в лабораторных исследованиях. Механизм его действия заключается в ингибировании N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазы и нарушении N-гликозилирования белков в эндоплазматическом ретикулуме. Это вызывает накопление дефектных белков в люмене ЭПР и ответ на несвернутые белки (UPR). Туникамицин рассматривается как потенциальный агент для комбинированной химиотерапии опухолей с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). В данной работе было проведено исследование влияния индуктора стресса ЭПР туникамицина на жизнеспособность клеток культур нормального и опухолевого происхождения — HaCaT и А431 соответственно. Для этого использовали МТТ-тест. Клетки инкубировали с туникамицином в течение 24 часов или с СВЕ в течение 48 ч. Были использованы концентрации туникамицина 2 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл и СВЕ 20 мкМ, 40 мкМ, 60 мкМ, 100 мкМ, 150 мкМ и 200 мкМ. Снятие воздействия СВЕ проводили через 48 ч; жизнеспособность клеток оценивали спустя 72 ч после добавления свежей культуральной среды. При инкубации культуры А431 с туникамицином в концентрации 2 мкг/мл доля жизнеспособных клеток составила 78.8%; при концентрации 5 мкг/мл – 79.8%; при концентрации 10 мкг/мл – 75.2%. При инкубации культуры HaCaT с туникамицином в концентрации 2 мкг/мл доля жизнеспособных клеток составила 78.1%; при концентрации 5 мкг/мл – 78.0%; при концентрации 10 мкг/мл – 81.5%. Выяснено, что воздействие туникамицина на клетки А431 и HaCaT не является дозозависимым в исследованном диапазоне концентраций (2 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл), что соответствует литературным данным. Для дальнейших исследований выбрана концентрация туникамицина 2 мкг/мл, так как эта концентрация оказывает сублетальное воздействие на обе культуры. Исследование уровня кальция с помощью Ca2+- чувствительного зонда Fluo-4/AM в клетках до и после обработки растительными гормонами. Ранее полученные данные показывают, что растительные гормоны абсцизовая (АБК) и гиббереллиновая (ГК) кислоты вызывают повышение уровня экспрессии генов, ассоциированных со стрессом ЭПР, в нормальных (кератиноциты человека НаСаТ) и опухолевых (эпидермоидная карцинома человека А431) клеточных линиях эпидермального происхождения. Кроме этого, АБК и ГК повышают уровень синтеза маркера дифференцировки кератиноцитов инволюкрина в опухолевых клетках, а для ГК дополнительно показано усиление синтеза филаггрина в обеих клеточных линиях. Ионы двухвалентного кальция являются вторичными мессенджерами, концентрация которых может значительно возрастать в ответ на различные проявления клеточного стресса и участвовать в передаче внутриклеточных сигналов. Показано, что стресс ЭПР сопровождается повышением уровня Са2+ в цитоплазме за счёт его высвобождения из депо. Таким образом, оценка уровня внутриклеточного кальция после воздействия растительными гормонами может дополнительно свидетельствовать в пользу развития стресса ЭПР и его последствий (в том числе и активации дифференцировки). Нашей целью было определить роль повышения уровня внутриклеточного кальция в развитии стресса ЭПР и дифференцировке кератиноцитов при действии растительных гормонов. Оценку уровня кальция в клетке проводили с помощью загрузки зонда Fluo-4 AM ester (в концентрации 1,5 мкМ) и последующей съёмки динамики кальциевых волн после добавления агентов. В качестве позитивного контроля использовали активатор стресса ЭПР дитиотреитол (ДТТ). С помощью планшетного ридера Anthos было показано, что как в клетках НаСаТ, так и в клетках А431, ГК вызывает достоверное повышение уровня кальция на отрезке 0-40 секунд после её добавления, которое затем плавно снижается в течение последующих 10 минут. Похожий эффект наблюдался при воздействии ДТТ. При действии АБК значительных отличий от контроля выявлено не было. Эти данные получили дополнительное подтверждение при наблюдении за динамикой кальция в единичных клетках А431 с помощью конфокальной микроскопии. После добавления ГК на графиках интенсивности флуоресценции, полученных после обработки последовательно снятых изображений, виден пик и последующее плавное снижение. Определение уровня синтеза белка-маркёра стресса ЭПР GRP78 и гладкомышечного актина α-SMA в дермальных фибробластах в контроле и при воздействии дитиотреитола (ДТТ), абсцизовой кислоты (АБК) и гиббереллиновой кислоты (ГК). Для количественного анализа влияния АБК, ГК и ДТТ на запуск стресса ЭПР (синтез маркёра стресса ЭПР GRP78) и синтез маркёра дифференцировки дермальных фибробластов гладкомышечного актина α-SMA мы оценили уровень синтеза белков GRP78 и α-SMA с помощью вестерн-блоттинга. Получены предварительные данные: уровень синтеза GRP78 в дермальных фибробластах повышался при действии ДТТ в 4 раза, при действии АБК снижался в 1,3 раза, при действии ГК повышался в 1,5 раза. Это может свидетельствовать о том, что растительные гормоны АБК и ГК оказывают более мягкое влияние на уровень синтеза GRP78, чем индуктор стресса ЭПР, и это влияние у АБК и ГК носит противоположный характер. Можно также предположить, что ГК запускает синтез GRP78, а, следовательно, стресс ЭПР. ДТТ, АБК и ГК вызывали снижение уровня синтеза α-SMA. При действии ДТТ он снижался в 2,7 раза, при действии АБК - в 1,4 раза, а при действии ГК – в 1,8 раза. То есть влияние растительных гормонов и индуктора стресса ЭПР на синтез маркёра дифференцировки носило сходный характер. Повышение уровня синтеза маркёра стресса ЭПР и одновременное снижение уровня синтеза α-SMA при действии ДТТ и ГК может быть следствием снижения общего уровня синтеза белков из-за индукции стресса ЭПР. Снижение уровня синтеза α-SMA при действии АБК может свидетельствовать о влиянии этого растительного гормона на дифференцировочный статус дермальных фибробластов. Определение уровеня синтеза маркеров дифференцировки кератиноцитов трансглутаминазы I, кератинов 5, 14, 1, 10, каспазы 14 с помощью вестерн-блоттинга. Были проведены предварительные исследования по иммуноцитохимическому выявлению кератина 14, являющегося маркёром малодифференцированных кератиноцитов базального слоя эпидермиса, в клетках НаСаТ и А431. Показано отсутствие этого маркера в обоих типах клеток. Возможно, это связано с качеством используемых антител. Раннее полученные данные показали, что уровень маркёра дифференцировки кератиноцитов инволюкрина возрастает в клетках А431 после инкубации с растительными гормонами жасмоновой кислотой (ЖК), АБК и ГК. Прикрепление инволюкрина к плазматической мембране катализируется ферментом трансглутаминазой I. Известно, что активность этого фермента в клетках А431 подавлена. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к трансглутаминазе I не выявило этого фермента ни в клетках НаСаТ, ни в клетках А431. Возможно, это также связано с качеством или особенностями используемых антител. Данные нуждаются в дополнительной верификации с использованием другой панели антител. Анализ содержания коллагена методом ИФА в клетках фибросаркомы НТ1080 в контроле и при воздействии ДТТ, АБК и ГК. Для того, чтобы оценить влияние фитогормонов АБК и ГК и индуктора стресса ЭПР ДТТ на секрецию коллагена I, проанализировано содержание коллагена I в среде культивирования дермальных фибробластов и клеток фибросаркомы НТ1080 в контрольных образцах и после 24-часового культивирования с 2 мМ АБК или ГК с помощью ИФА. Получены предварительные данные, согласно которым при отсутствии растительных гормонов в среде культивирования дермальные фибробласты секретировали коллаген I в среду культивирования, а клетки фибросаркомы – нет. Это согласуется с данными литературы (Pihlajaniemi et al, 1981; Fertala et al, 1994), согласно которым клетки фибросаркомы НТ1080 не синтезируют коллаген I при культивировании в стандартных условиях. При действии АБК содержание коллагена I в среде культивирования дермальных фибробластов увеличивалось на 187,55 пг/мл, а при действии ГК – уменьшалось на 102, 1 пг/мл. Это может свидетельствовать об изменении интенсивности секреции коллагена I дермальными фибробластами под воздействием АБК и ГК. Напротив, в среде культивирования клеток фибросаркомы АБК и ГК не изменяли содержания коллагена I. Это может свидетельствовать о том, что АБК и ГК не влияют на процессы синтеза коллагена I в клетках фибросаркомы, или стимулируют только его синтез, но не секрецию. Культивирование дермальных фибробластов с индуктором стресса ЭПР ДТТ приводило к значительному снижению содержания коллагена I в среде культивирования. Возможно, ДТТ подавляет синтез коллагена I дермальными фибробластами, что приводит к снижению его секреции. Исследование влияния α-липоевой кислоты (ЛК) на пролиферативную активность и дифференцировочный потенциал иммортализованных кератиноцитов человека линии НаСаТ и кератиноцитов кожи. Методом МТТ было показано, что замедление пролиферации клеток культуры НаСаТ происходит при воздействии 100 и 200 мкМ ЛК в течение 96 часов, а при воздействии 400 мкМ ЛК происходит уменьшение числа клеток. Замедление пролиферации может быть связано как с увеличением гибели клеток, так и с дифференцировкой клеток. Окрашивание антителами против маркеров дифференцировки инволюкрина и лорикрина показало, что при воздействии 100 мкМ ЛК появляются клетки с повышенным содержанием как лорикрина, так и инволюкрина, что может свидетельствовать об индукции дифференцировки. Оценка интенсивности флуоресценции в программе Fiji ImageJ показала увеличение данного параметра в популяции в присутствии 100 мкМ ЛК. Также методом МТТ проведен анализ действия ЛК на первичные кератиноциты человека. Установлено увеличение числа клеток при действии 100 мкМ ЛК в течение 10 часов. При этом иммуноцитохимическое окрашивание показало, что инволюкрин и лорикрин в клетках не выявляются, цитокератин 14 присутствует во всех клетках, в единичных клетках появляется маркер пролиферации цитокератин 10. Методом проточной цитофлуориметрии выявлено незначительное увеличение доли лорикрин-положительных клеток: с 4% в контроле до 8%. Также увеличивается интенсивность окрашивания работающих митохондрий MitoTracker®Orange. При культивировании первичных кератиноцитов в присутствии 200 мкм ЛК наблюдается замедление пролиферации (метод МТТ). При этом, по данным проточной цитофлуориметрии, возрастает доля цитокератин10-позитивных клеток (до 20%) и лорикрин-положительных клеток (до 30%). Интенсивность окрашивания работающих митохондрий MitoTracker®Orange не меняется. В присутствии 400 и 800 мкМ ЛК происходит снижение числа первичных кератиноцитов (метод МТТ). Исследование пути образования клеток с микроядрами в культуре иммортализованных кератиноцитов человека линии НаСаТ и дальнейшей судьбы таких клеток (с использованием прижизненных наблюдений). Показано, что в процессе культивирования кератиноцитов человека линии НаСаТ происходит увеличение числа клеток с микроядрами (МЯ) с 4 % (на 3 сутки) до 19% (на 6 сутки). В клетках обнаруживаются как мелкие МЯ (до 4 мкм), так и крупные. Реже всего встречаются клетки с множественными МЯ, в которых невозможно выделить основное ядро (2,5%). Число клеток, содержащих мелкие МЯ увеличивается к 6 суткам культивирования, число клеток с крупными МЯ достоверно не меняется. Клетки с МЯ могут возникать в результате нарушения деления клеток. Подсчет митотического индекса показал, что число митозов в культуре НаСаТ падает в процессе культивирования с 2,1% до 0,5%. Многополюсных митозов и К-митозов обнаружено не было. Источником возникновения МЯ может служить образование хромосомных мостов при расхождении хромосом. Число клеток, содержащие хромосомные мостики, составляло 0,5% (на 3 сутки) и 0,4% (на 6 сутки). Поскольку МЯ могут возникать в результате патологических митозов полиплоидных клеток, был проведен морфометрический анализ плоидности по окрашиванию DAPI в программе Fiji ImageJ. Число клеток с плоидностью в 2 раза превышающей медиану плоидности в популяции возрастает к 6 суткам культивирования (с 8 до 12%). Нетрансформированные клетки, имеющие повреждения ДНК (в том числе, МЯ), могут останавливаться в прохождении клеточного цикла и в дальнейшем подвергаться апоптотической гибели. Ключевым регулятором данного процесса является фактор транскрипции белок р53. Морфометрический анализ накопления р53 в ядрах клеток (оценивалось соотношение интенсивности флуоресценции в ядре и цитоплазме клетки), выполненный в программе Fiji ImageJ, показал, что на 3 сутки культивирования р53 в небольшом количестве присутствует в большинстве ядер клеток. Клетки с повышенным содержанием ДНК характеризуются повышенным содержанием р53 в ядре. Ядра клеток с мелкими МЯ накапливают больше р53 по сравнению с одноядерными клетками, но меньше, по сравнению с ядрами клеток с крупными МЯ. Перемещение р53 в мелкие МЯ, как правило, затруднено; р53 в большей степени накапливается в крупных МЯ. На 6 сутки культивирования увеличивается число клеток с пониженным содержанием р53 в ядре. Это относится и к одноядерным клеткам, и к клеткам с повышенным содержанием ДНК, и к клеткам с мелкими и крупными МЯ, и к собственно мелким и крупным МЯ. Однако, на 6 сутки культивирования также увеличивается число клеток всех типов с повышенным накоплением р53 в ядре. Прижизненные наблюдения показали, что клетки с крупными (предположительно полиплоидными) ядрами на 3-4 сутки культивирования вступают в митоз, заканчивающийся образованием клеток с МЯ (10 из 23 случаев, 5 клеток погибли). Клетки с множественными МЯ гибнут путем апоптоза (8 из 15 случаев). Для выяснения возможности активации митохондриального пути запуска апоптоза в клетках с МЯ, проведено окрашивание антителами против цитохрома с. Выход цитохрома с в цитоплазму был отмечен как в клетках с мелкими МЯ (в 1 клетке из 10), так и в клетках с крупными МЯ (в 4 клетках из 12). Исследование возможности использования ионов цинка для защиты культивированных нейронов коры головного мозга от токсического действия ионов кадмия. При использовании МТТ-метода для оценки выживаемости культивированных клеток нейронов коры головного мозга крыс обнаружено, что ионы кадмия в концентрации выше 5 мкМ оказывают цитотоксическое действие. Показано, что ионы цинка (10-30 мкМ) достоверно увеличивают выживаемость нейронов при кадмиевой токсичности. Хлорид кадмия и хлорид цинка добавляли непосредственно в среду культивирования на 48 часов. Цинк является необходимым металлом для жизнедеятельности организмов, поэтому показанное защитное действие Zn2+ при кадмиевой нейроцитотоксичности очень перспективно для создания стратегии защиты нервной ткани от повреждения тяжелыми металлами. Характеристика реакции клеток млекопитающих на введение промышленных углеродных наночастиц и выявление клеточных механизмов, опосредующих их деградацию. Нами не было выявлено скоплений фуллерена С60 в энтероцитах тонкого кишечника. При этом наблюдались патологические изменения органов пищеварительной системы, локальные некрозы в области кишечных ворсинок, с частичным разрушением энтероцитарного слоя. Также имела место паренхиматозная жировая дистрофия печени - в гепатоцитах были выявлены множественные липидные капли. Это позволяет предположить наличие непрямого механизма воздействия наночастиц фуллерена С60 на печень после повреждений стенок кишки. После инкубации МУНТ с клетками THP-1 показано истончение стенок нанотрубок при внеклеточной деградации, и исчезновение внутреннего канала и последующая деградация до аморфного углерода при внутриклеточной. Также при обоих типах деградации снижалась общая плотность дефектов МУНТ, и снизился уровень содержания кислорода, что позволяет предположить кислородсодержащую природу дефектов. Наночастицы алмаза преимущественно подвергались окислению клетками, вследствие чего рос уровень кислорода в образцах после инкубации. При этом как для наночастиц алмаза, так и для МУНТ установлено, что их попадание в клетки приводит к развитию нарушений липидного обмена (накопление липидных капель в цитоплазме), аутофагии и последующей гибели клеток путем некрозов. Таким образом, можно заключить, что контакт клеток с промышленными углеродными наночастицами может вести к клеточным патологиям, при этом клетки способны элиминировать эти наночастицы с помощью окислительной деградации, как вне- так и внутриклеточно. Изучение влияния рецепторного фагоцитоза и препарата 1-го ряда – рифампицина – на активацию макрофагов человека. Отработана методика оценки фагоцитарной активности макрофагов ТНР-1 двумя методами: конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (1) и проточной цитометрии с визуализацией (2). Показано, что метод (1) позволяет оценить локализацию частиц внутри макрофагов и интенсивность поглощения частиц, но требует больших временных затрат. Метод (2) позволяет быстро провести оценку фагоцитарной активности клеток по косвенному параметру интенсивности флуоресценции. Оба метода показали преобладание рецепторного пути фагоцитоза с использованием IgG-частиц, что характерно для М1-макрофагов. Оценка регенеративного потенциала мультипотентных клеток из разных источников при восстановлении миокарда после инфаркта. Проведён сравнительный ультраструктурный анализ мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) человека, культивируемых в монослое (2 D) и в форме сфероидов (3D); оценивается их влияние на восстановление кардиомиоцитов миокарда в постинфарктный период. Предполагается, что тип культивирования влияет на метаболическую активность клеток, и следовательно на их действие в постинфарктном миокарде. Выявлено, что клетки ММСК человека в составе сфероидов (3D), в отличие от 2 D культуры, имеют более правильную форму и меньший размер, а их ядра характеризуются более неправильными очертаниями. Митохондрии при 3D культивировании в основном небольших размеров, тогда как в монослое (2 D) размеры и форма митохондрий многообразны. Показано, что трансэпикардиальное введение ММСК оказывает позитивный эффект на кардиомиоциты миокарда, уменьшая повреждения ядра, миофибрилл, митохондрий через 7 суток на модели мелкоочагового инфаркта крыс, индуцированного изопротеренолом. Указанный эффект значительно более выражен при введении ММСК при 3D культивировании (сфероиды), что согласуется с ранее полученными данными на светооптическом уровне на хроническом сроке (28 сут). Выявлены ультраструктурные отличия ММСК человека в зависимости от типа культивирования (2D и 3D): в размере и форме клеток и в их митохондриоме, что может обуславливать их различные свойства при использовании в постинфарктном миокарде. Показано, что введение ММСК человека снижает ультраструктурные нарушения кардиомиоцитов миокарда сердца крыс при индуцированном изопротеренолом инфаркте на 7 сутки; более выраженный эффект имеют ММСК, культивируемые в 3D условиях. Исследование возрастных морфо-функциональных изменений пигментного эпителия сетчатки и периферических отделов глаза японских перепелов (Coturnix japonicа), содержавшихся при освещении низкодозовым синим светом. Проведен светомикроскопический морфометрический анализ ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и склеры в глазах птенцов (возраст 9 суток) и молодых птиц (возраст 20 суток) японских перепелов, содержавшихся после вылупления при повседневном низкодозовом синем и желтом освещении. Установлено, что в условиях синего света у всех птиц отмечается снижение толщины слоя РПЭ с уменьшением высоты тел клеток и длины меланинсодержащих апикальных отростков, но наиболее оно выражено у 20 суточных птиц (в среднем в 1,2 раза). Также установлено, что во всех группах птиц толщина склеры в центральной области заднего глазного бокала (там, где находится макулярная зона) в среднем в 2 раза превышает толщину краевых участков; у 20-суточных птиц, содержавшихся при синем свете, она снижена в 1,2 раза по сравнению с птицами, содержавшимися при желтом свете, при этом толщина краевых участков остается прежней. Полученные результаты могут отражать изменение формы глазного яблока с увеличением его длинной оси, т.е. служить одним из признаков развития миопии у молодых птиц при повседневном облучении синим светом. При электронно-микроскопическом анализе РПЭ 9-суточных птенцов, содержавшихся при синем свете, существенных изменений ультраструктуры клеток не обнаружено. В их хориокапиллярах чаще, чем в группе «желтых» птиц, наблюдаются тонкие базальные участки эндотелия, содержащие фенестры и трансэпителиальные каналы (ТЭК), чаще встречаются ТЭК на противоположной стороне капилляров. Результаты сходны с полученными ранее для более взрослых птиц. Исследование роли митохондриальных активных форм кислорода (мтАФК) в процессах локального и системного острого воспаления. Проведено исследование механизма защитного действия митохондриально- направленного антиоксиданта SkQ1 и разобщителей окислительного фосфорилирования и дыхания (С12TPP и динитрофенола) на барьерную функцию кишечного эпителия Caco-2 в условиях повреждающего воздействия. Методом флуоресцентной микроскопии показано, что длительная предобработка (4 дня) клеток кишечного эпителия Caco-2 разобщителями окислительного фосфорилирования С12TPP и динитрофенола, а также митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1 предотвращает деградацию плотных контактов в условиях различных повреждающих воздействий (этанол, липополисахарид, фактор некроза опухоли, декстрансульфат натрия - ДСН). Поскольку в дальнейшем мы исследовали терапевтический потенциал данных соединений в модели острого ДСН-индуцированного колита у мышей, то мы остановились на изучении молекулярного механизма повреждающего действия ДСН на культуре аденокарциномы кишечного эпителия Caco-2. Оценена активность компонентов сигнальных путей AMPK, NF-kB и MAP-киназных сигнальных путей путем определения количества их фосфорилированных форм методом вестерн блоттинга, однако статистически достоверных изменений в клетках культуры Caco-2 под действием ДСН не обнаружено. Исследовано влияние SkQ1 и разобщителей окислительного фосфорилирования и дыхания С12TPP и динитрофенола на клинические проявления, проницаемость кишечного барьера и воспалительные изменения при экспериментальном остром язвенном колите, индуцированном декстрансульфатом натрия. Оценивали терапевтический потенциал SkQ1 и С12TPP и динитрофенола в модели острого язвенного колита, вызванного 1% раствором ДСН. У мышей, принимавших SkQ1, по сравнению с нелеченными мышами, на качественном уровне отмечался менее распространенный язвенный процесс, а C12TPP и динитрофенол не оказывали защитного эффекта. Защитный эффект SkQ1 может быть связан не только с предотвращением нарушения эпителиального барьера, но и с подавлением активности иммунных клеток и их способности к инфильтрации очага воспаления. Исследована роль митохондрий в активации тучных клеток in vitro. Исследование выполнено на клетках линии базофильной лейкемии крыс RBL-2H3. С помощью флуоресцентного зонда TMRM исследовали изменение трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) в ходе антиген-зависимой стимуляции клеток. Стимуляция клеток сопровождается кратковременным снижением, а затем ростом ΔΨm (на 20% по сравнению с нестимулированными клетками). Далее оценили продукцию митохондриальных АФК с помощью флуоресцентного зонда MitoSOX, являющегося индикатором супероксид-аниона. Предобработка клеток RBL-2H3 SkQ1 и C12TPP снижала антиген-зависимую дегрануляцию клеток, предотвращала фрагментацию митохондрий, но не влияла на ΔΨm и уровень продукции мтАФК. Это свидетельствует о том, что защитный механизм действия данных соединений может быть не связан напрямую с их антиоксидантым и разобщающим свойствами. Используя метод вестерн блоттинга, мы обнаружили, что SkQ1 и C12TPP предотвращают активацию mTORC1-сигнального пути в стимулированных антигеном клетках RBL-2H3. Полученные данные свидетельствуют об участии митохондрий в регуляции mTORC1-сигнального пути в ходе антиген-зависимой стимуляции тучных клеток. Для исследования роли митохондриального STAT3 в антиген-зависимой активации тучных клеток мы использовали митохондриально-направленные ингибиторы STAT3 – Mitocur-1 и Mitocur-3. Предобработка клеток RBL-2H3 с Mitocur-1 или Mitocur-3 снижала их антиген-индуцированную дегрануляцию. С помощью различных методов показано, что данные соединения вызывают фрагментацию митохондрий и митофагию. Полученные результаты указывают, что подавление активности митохондриального STAT3 с помощью Mitocur-1 и Mitocur-3 запускает митофагию, в результате чего происходит уменьшение числа митохондрий. Полученные нами данные свидетельствуют о важной роли митохондрии в антиген-зависимой активации тучных клеток. Характеристика структурно-функциональных особенностей хромосом и ядрышек клеток антиподальных комплексов оплодотворенных и неоплодотворенных зародышевых мешков пшеницы в ходе дифференцировки и программируемой клеточной гибели (ПКГ). На ранних этапах гибели антиподального комплекса тела политенных хромосом более плотные по сравнению с хромосомами ядер на стадии дифференцировки, хромосомные территории сближены. Однако поскольку раунды редупликации геномов клеток апикального и среднего ярусов комплекса продолжаются, измерили содержание ДНК в ядрах антиподального комплекса на стадиях их гибели и показали, что их плоидность может достигать 250 с. В антиподальных клетках, находящихся на более поздних стадиях гибели, выявляются ядра с разной степенью объединения хромосомных территорий, в телах хромосом выявляются многочисленные лакуны не одинакового размера. Встречаются ядра, в которых объединены несколько хромосом и ядра, в которых отдельные хромосомные территории неразличимы. На поздних этапах гибели часть клеток апикального яруса и среднего, уплощены и вытянуты. В некоторых ядрах клеток апикального яруса наблюдается частичная фрагментация хроматина, на более поздних этапах гибели встречаются ядра с полностью фрагментированным хроматином. Наиболее сильным изменениям подвергаются крупные ядра клеток апикального яруса, в мелких ядрах клеток базального яруса объединение хромосомных территорий происходит позже, они уплощаются, но не фрагментируются. На финальных этапах гибели все ядра комплекса вытянутые и располагаются в узкой области на поверхности многоклеточного эндосперма. В ядрах клеток антиподальных комплексов неоплодотворенных зародышевых мешков политенные хромосомы максимально декомпактизованы, в процессе ПКГ этих клеток наблюдается постепенная фрагментация политенных хромосом. На стадии дифференцировки комплекса в ядрах антипод выявляются 1-4 ядрышек. В процессе гибели клеток антиподального комплекса зародышевого мешка происходят структурные изменения ядрышек, сегрегация отдельных компонентов ядрышка и перераспределение их в тела политенных хромосом. Сегрегированные компоненты ядрышка выявляются в лакунах политенных хромосом ядер антиподального комплекса в виде структур различного размера и формы. В этих структурах удалось выявить некоторые формирующие их компоненты. Аргентофильные белки ядрышка, после Ag-NOR окрашивания, выявляются на поверхности структур, локализованных в телах политенных хромосом, в виде ровного слоя или формируя одну-две «шапочки». Покрытые аргентофильными белками глобулы упорядочено располагаются в телах политенных хромосом. Теломерные участки политенных хромосом, граничащие с ядерной оболочкой, расплетены на хроматиды, между ними выявляются сегрегированные глобулы. В цитоплазме антипод также выявляются подобные глобулы. РНК выявляется в ядрышках и в большинстве лакун политенных хромосом, после дифференциального окрашивания ДНК и РНК акридиновым оранжевым. Мажорный белок плотного фибриллярного компонента ядрышка – фибрилларин в ядрах антиподальных клеток выявлен после иммуноцитохимического окрашивания. В некоторых ядрах комплекса фибрилларин выявляется в области ядрышка, в других - как в ядрышке, так и в лакунах политенных хромосом. В части ядер фибрилларин не выявляется в дефинитивном ядрышке, а лишь в сегрегатах на поверхности и в лакунах политенных хромосом. При этом фибрилларин формирует большие и мелкие агрегаты неправильной формы. Часть лакун хромосом не содержит РНК и фибрилларина. Перераспределение материала ядрышка в ходе ПКГ выявлено во всех ядрах клеток антиподального комплекса. В процессе гибели большинства клеток гигантские ядрышки антипод сильно уплощаются и расслаиваются, в них выявляются многочисленные гетерогенные фибриллярные центры. В ядрах антиподальных клеток на поздних стадиях гибели происходит расслоение и перераспределение материала ядрышка в область хромосом. Сегрегированные компоненты ядрышка, располагаются между хроматид и различаются по размеру и форме. Их структура может быть неоднородна. Часть из них выглядит как округлые однородные тельца, другие имеют неправильную форму, а некоторые имеют сложную структуру, когда к центральной менее плотной области примыкают один или два более плотных сегментов сегрегированного материала. Изменения структуры ядрышка сопровождают изменение хромосом в ходе ПКГ, начиная с уплотнения хроматина и заканчивая полной перестройкой хроматина ядра. Сегрегация компонентов ядрышка является одним из ранних морфологических маркеров ПКГ антиподальных клеток. В ядрах антиподальных клеток неоплодотворенных зародышевых мешков в процессе ПКГ сегрегации компонентов ядрышка не выявляется, ядрышко долго сохраняет свою нативную структуру.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".