Роль цитоскелета в клеточной подвижностиНИР

.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: 1. В 1991 году было показано, что отдельные микротрубочки врастают в активную ламеллу фибробласта и проходят очень близко от мест образования фокальных контактов (ФК), меченых винкулином. В месте прихода микротрубочки в отдельную протрузию, выдвигаемую клеткой, в протрузии начинается активный раффлинг, и через минуту после начала раффлинга в этом же месте начинает образовываться новый ФК (Geiger, 1991). Позднее, на клетках суточной культуры, было показано, что деполимеризация микротрубочек приводит к увеличению размеров зрелых фокальных контактов (Bershadsky et a., 1996; Kaverina et al., 1998; 2002). В то же время стабилизация микротрубочек не влияет на размер и плотность фокальных контактов, что было показано лишь на качественном уровне (Mikhailov, Gundersen, 1998). Таким образом, роль микротрубочек в динамике формирования и созревания фокальных контактов в распластывающейся клетке оставалась неизученной. Для проверки гипотезы о регуляции фокальных контактов системой микротрубочек моделью в настоящем исследовании послужили распластывающиеся фибробласты 3Т3, в которых были визуализированы фокальные контакты при помощи флуоресцентно меченого белка винкулина. Для подавления динамической нестабильности плюс-концов микротрубочек использовали раствор 100нМ нокодазола и 50 нМ таксола. Для описания динамики фокальных контактов были выбраны такие их параметры, как площадь, время существования и средняя интенсивность флуоресценции. Для анализа фокальных контактов в контрольной группе было исследовано 45 контактов в клетках, трансфецированных плазмидой, кодирующей белок фокальных контактов винкулин, конъюгированный с красным флуоресцентным белком RFP. Видеонаблюдения производились в течение 60 минут от начала распластывания, с интервалом между кадрами в 1 минуту. В процессе распластывания клетки подавляющее большинство фокальных контактов появлялись и исчезали в области ламеллы на расстоянии не больше 5 мкм от края клетки. За момент возникновения контакта был принят первый кадр, где интенсивность флуоресценции контакта превышала фон. Моментом исчезновения считался последний кадр, в котором интенсивность контакта все еще отличалась от фона. В момент возникновения контакт имеет площадь, которая варьирует от 0,13 до 4,15 мкм2 (средняя 1.15±0.12мкм2). Во время роста максимальная площадь, достигаемая контактами на краю распластывающихся фибробластов варьирует от 0.65 до 8.11 мкм2, средняя максимальная площадь составила 2.59±0.25мкм2. Площадь контакта в момент исчезновения варьирует от 0.22 до 1.81 мкм2 (средняя 0.69±0.06мкм2). Таким образом, площадь, на которой контакт визуализируется в момент возникновения, в среднем в 1,7 раз больше площади в момент исчезновения контакта (р=0.0065). Для дальнейшего анализа контакты разделили на 2 группы по максимальной площади, согласно классификации, принятой в литературе (Zamir, Geiger, 2001). К первой группе были отнесены мелкие контакты, площадь которых составляет менее 3 мкм2 (33 из 45), вторая группа – крупные контакты с площадью 3 и больше мкм2 . Мелкие контакты возникают со средней площадью 0.85±0.09 мкм2, достигают максимальной площади в 1.74±0.12 мкм2, и площадь в момент исчезновения составляет 0.55±0.04 мкм2. Крупные контакты возникают со средней площадью 1.97±0.30 мкм2, их максимальная площадь составляет 4.91±0.44 мкм2, площадь в момент исчезновения – 1.09±0.12 мкм2. В момент появления площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 2.3 раза (различие достоверно - р=0.0006). В момент исчезновения площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 2 раза, (различие достоверно, р<0.0001) (Рис. 6б). Таким образом, за время жизни ФК увеличивают свою площадь в 2-2.5 раза, как в начальной точке, так и в точке с максимальной площадью существуют группы мелких и крупных фокальных контактов. Такое разделение на две группы было принято за основу для дальнейшего анализа. Средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) отражает плотность молекул белка в фокальном контакте (Iср). Средняя интенсивность флуоресценции рассчитывается по формуле: Iср= I/S, ед. фл./ед. пл. где I – средняя интенсивность флуоресценции в данный момент времени, S – площадь фокального контакта в данный момент времени, ед. фл./ед. пл. – единица флуоресценции на единицу площади; СИФ мелких контактов в момент возникновения – 1.80±0.24 ед.фл./мкм2, в момент времени, когда они достигают максимальной площади – 0.84±0.07ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 2.33±0.19 ед.фл./мкм2, СИФ крупных контактов в момент возникновения – 0.78±0.18 ед.фл./мкм2, в точке с максимальной площадью – 0.27±0.03 ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 1.18±0.17 ед.фл./мкм2, при этом СИФ крупных контактов в момент их появления меньше в 1.5 раза, чем в момент исчезновения и больше, чем в точке с максимальной площадью в 2.9 раз. СИФ мелких контактов больше, чем СИФ крупных контактов в момент появления в 2.1 раза, в точке с максимальной площадью – в 3.1 раза, в момент исчезновения – в 2 раза, кроме того, для любой группы контактов минимальная СИФ коррелирует со временем стабильного существования контакта. Таким образом, в контрольных клетках: • площадь и яркость контакта в момент его возникновения всегда больше, чем в момент исчезновения; • площадь и яркость контакта растет с той же скоростью, что и уменьшается • скорость сборки и разборки крупных контактов всегда выше, чем мелких ФК • общее количество винкулина в крупных ФК всегда больше чем в мелких ФК, однако, в мелких ФК плотность винкулина всегда выше, чем в крупных. В условиях стабилизации микротрубочек площадь как крупных, так и мелких контактов статистически не отличается от контрольных значений. В момент возникновения контакт имеет площадь, которая варьирует от 0,27 до 3,45 мкм2 (средняя 0.88±0.09). Максимальная площадь ФК составляет от 0.50 до 9.61мкм2, средняя площадь – 2.21±0.27мкм2. Площадь в момент исчезновения контакта варьирует от 0.20 до 2.31мкм2, средняя площадь составила 0.62±0.07мкм2 (Рис. 10а). Так же, как и в случае контрольных клеток, контакты разделили на 2 группы, причем соотношение количества крупных и мелких контактов статистически не отличалось от контроля. Мелкие контакты возникают со средней площадью 0.76±0.07 мкм2, максимальная площадь их составляет 1.59±0.15 мкм2, площадь в момент исчезновения – 0.50±0.03 мкм2. Крупные контакты возникают со средней площадью 1.43±0.33 мкм2, максимальная площадь составляет 5.08±0.82 мкм2, площадь в момент исчезновения – 1.18±0.27 мкм2 (Рис. 10в). В момент появления площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 1.9 раза (Р=0.0006). В момент исчезновения площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 2.3 раза (Р<0.0001). В условиях стабилизации микротрубочек СИФ мелких контактов в момент возникновения составляет 1.77±0.14 ед.фл./мкм2, в точке с максимальной площадью – 0.97±0.09ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 2,46±0,18 ед.фл./мкм2, СИФ в момент возникновения меньше, чем в момент исчезновения в 1.4 раза. СИФ крупных контактов в момент возникновения составляет 0.99±0.20 ед.фл./мкм2, максимальная – 0.28±0.04 ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 1.35±0.33 ед.фл./мкм2, при этом СИФ крупных контактов в момент появления в момент исчезновения статистически не отличается. В момент времени, когда контакт достигает максимальной площади, СИФ меньше, чем в момент появления в 3.5 раза. Таким образом, при стабилизации микротрубочек крупные контакты, так же как и в контроле, появляются и исчезают с изначально большей площадью, чем мелкие, при этом площадь крупных контактов растет и уменьшается быстрее, чем площадь мелких. В крупных контактах содержится больше флуоресцентного белка (винкулина), чем в мелких, как в момент появления, так и в когда контакт достигает максимальной площади, и в момент исчезновения. Кроме того, в крупных контактах концентрация флуоресцентного белка на единицу площади меньше, чем в мелких контактах, как в момент появления, так и в точке с максимальной площадью и в момент исчезновения. Единственный параметр, по которому отличаются контрольная и опытная выборки – продолжительность стадии стабильного существования ФК. В нормальных распластывающихся клетках фокальные контакты, визуализированные при помощи винкулина, возникают на границе ламеллиподия-ламелла и существуют в среднем 21.07±1.71 минуту, а под воздействием нокодазола и таксола, стабилизирующих микротрубочки, время жизни винкулиновых контактов снижается до 15.27±1.06 минут. 2. EB белки являются основной группой плюс-концевых белков микротрубочек, контролирующей их динамические параметры, в частности, частоту катастроф и скорость деполимеризации (Komarova et al., 2005). Гиперэкспрессия EB – белков отмечена в различных видах карцином печени, пищевода и желудка (Fujii et al., 2005; Nishigaki et al., 2005), показано, что увеличение экспрессии EB белков приводит к опухолевой прогрессии, однако до сих пор не показана функциональная роль EB белков как регулятора одной систем цитоскелета на различных стадиях миграции клетки. Для исследования роли EB белков в регуляции клеточной подвижности были нами были получены стабильные линии фибробластов 3Т3, экспрессирующие shРНК к последовательностям EB3 и EB1. Последовательности shРНК были взяты из статьи Komarova et al., 2005. В фиксированных контрольных клетках 3Т3, окрашенных антителами к белкам EB1 и EB3, были видны комето-подобные структуры длиной около 2 мкм. В клетках, экспрессирующих shРНК к EB белкам, в большинстве случаев кометы исчезали полностью, а у некоторых клеток, где кометы оставались, нарушалось их пространственное распределение в клетке. По данным ПЦР в реальном времени уровень экспрессии мРНК и EB3 и EB1 снижался в клетках, экспрессирующих shРНК в среднем на два порядка по сравнению с контролем. Нами было показано, что нокдаун EB3, так же, как и нокдаун EB1, замедляет распластывание клеток, при этом значительно изменяется их морфология. В отсутствие EB1 и EB3 в клетках исчезает быстрая фаза распластывания, описанная нами ранее (Творогова, Воробьев, 2012). Для описания кинетики распластывания были отснято распластывание 40 клеток для каждой из групп «контроль», «нокдаун EB1», «нокдаун EB3», съемка велась в течение 180 минут с интервалом 1 минута между кадрами. Через 20 минут после начала распластывания площадь клеток с нокдауном EB3 была в среднем в два раза меньше, чем площадь контрольных клеток (4,13±0,41 в контроле против 1,83±0,15 в клетках с нокдауном EB3), сходные значения были также получены для клеток с нокдауном EB1. За 180 минут с начала распластывания клетки со сниженной экспрессией плюс-концевых белков микротрубочек не могли увеличить площадь до значений, достигаемых контрольными клетками. В случае нокдауна EB1 эффект оказался более выраженным: через три часа после начала распластывания площадь клеток с нокдауном EB1 оказывалась в среднем в 2.3 раза меньше контрольных значений, тогда как площадь клеток с нокдауном EB3 была меньше контрольных значений в среднем в 1.6 раза. С точки зрения морфологии клетки с нокдауном одного из EB белков или клетки с двойным нокдауном отличаются от нормальных тем, что практически не могут образовать нормальную ламеллу. Ее способны образовать лишь 6% клеток, и еще 10 % клеток способны вытягиваться на субстрате, тогда как остальные клетки длительное время сохраняют шарообразную форму, образуют блебсы и практически не увеличивают свою площадь, тогда как в контроле порядка 60% образуют нормальную ламеллу и еще порядка 20% способны вытягиваться. Описанная кинетика распластывания клеток в условиях подавления экспрессии плюс-концевых белков сходна с таковой для клеток с подавленной динамической нестабильностью микротрубочек в условиях действия наномолярных доз нокодазола и таксола. Эффект нокдауна EB белков на распластывание клеток, по-видимому, является результатом неспособности клеток регулировать сигнальные каскады, приводящие к перестройкам цитоскелета, так как показано, одной из функций EB белков является сопряжение работы сети микротрубочек, отвечающей за поляризацию клетки, и компонентов актинового цитоскелета, отвечающих за распластывание клеток. Роль EB белков в интеграции двух систем цитоскелета также подтверждается возможностью непосредственного взаимодействия EB1 с белком ACF7 из семейства спектраплакинов, образующих связи между актиновыми филаментами и микротрубочками. В отсутствие ACF7 EB1 по-прежнему связываются с микротрубочками, однако сами микротрубочки больше не растут вдоль стресс-фибрилл и перестают связываться с кортикальным актином. В результате микротрубочки становятся менее стабильными и менее радиально направленными, что приводит к нарушению способности клетки к миграции (Kodama, 2003). 3. Для проверки гипотезы о возможной регуляции параметров динамики фокальных контактов через систему микротрубочек стабильная линия клеток 3Т3, экспрессирующая плюс-концевой белок микротрубочек EB3-RFP, была дополнительно трансфецирована белком ранних фокальных адгезий паксиллином. Движение клеток снимали в течение 30 минут, интервал между кадрами составил 3 секунды, необходимым условием для оценки параметров динамики фокальных контактов в зависимости от динамики плюс-концов микротрубочек было наличие активной ламеллы. На каждом кадре фильма измерялась площадь фокального контакта и число плюс-концов микротрубочек, чей контур оказался на расстоянии не более 0,5 мкм от контура фокального контакта на данном кадре. В суммарной выборке среднее время жизни контактов, содержащих паксиллин, было значительно короче, чем фокальных контактов, содержащих винкулин, и составило всего лишь 152±22 с. Оказалось, что время жизни фокального контакта вне зависимости от его расположения (в ламелле или в теле клетки) или площади (как для крупных, так и для мелких контактов) коррелирует со средним числом МТ, оказывающихся вблизи ФК за весь период его существования: чем больше микротрубочек попадает в фокальный контакт, тем меньше время жизни фокального контакта (коэффициент корреляции Спирмена R=-0.78)
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: На данном этапе проекта мы описали поведение микротрубочек (МТ) нецентросомального происхождения, поведение которых обусловлено особенностями локальных участков цитоплазмы и показали, что центросома отвечает за рост менее чем 10% от всей популяции МТ. Кроме того, было показано, что около 50% клеток в популяции не имеют активной центросомы, выполняющей роль ЦОМТ в клетке. Анализ параметров центросомальных МТ В первой части работы мы проанализировали 4800 треков плюс-концов микротрубочек в 89 фибробластах 3Т3 с постоянной экспрессией плюс-концевого белка МТ EB3, конъюгированного с флуоресцентным белком EB3. Средняя длина трека составила was 5.7±5.5 мкм (диапазон от 1.2 до 59.1 мкм), средняя продолжительность роста для всех треков составила 17.3±16.1 с (диапазон от 6 до 72 с), скорость роста составила 21.5±19 мкм/мин (диапазон от 3.3 до 29.5 мкм/мин) (Рис.1). Из 4800 МТ только 158 росли более 40 с, и только для 169 длина трека составила более 10 мкм, что значительно меньше радиуса клетки. Основное количество таких клеток начиналось в цитоплазме или у края клетки, но не у центросомы. Согласно предыдущим исследованиям, нецентросомальные МТ в цитоплазме могут быть разделены на МТ внутренней зоны цитоплазмы (рост которых начинается на расстоянии не менее 5 мкм от центросомы) и МТ на краю клетки (рост которых начинается на расстоянии не более 2 мкм от края клетки). Отдельно мы проанализировали треки МТ, идущие от центросомы. В клетках с постоянной экспрессией EB3-RFP центросома может быть определена как яркий кластер как яркий кластер комет в центре клетке, диаметром порядка 1.5 мкм в объеме (расчёт по четырем последовательным оптическим срезам). Интегральная яркость в этой области составила 7.3±3.4 одиночных комет (по сравнению с 2.6±1.2 комет для области такого же размера в цитоплазме). Для объемной реконструкции были отсняты 124 z-стека с инкрементом в 0.5 мкм. Анализ таких z-стеков показал, что центросома в активном состоянии присутствует лишь в 68 клетках из 124, тогда как в 56 она не функционировала как ЦОМТ (Рис.2). Клетки с активной и неактивной центросомой не отличались по своей площади и форме. В клетках с активной центросомой было описано 1560 МТ центросомального происхождения. Средняя длина таких треков составила 5.3±2.7 мкм. Из 1560 МТ только 562 росли в течение более 12 с, 74 МТ продолжали расти в течение 15-40 с, и только для 5 продолжительность периодов роста составила более 40 с. Для треков длиной более 1 мкм скорость нуклеации составила 18.0±7.0 в минуту. Анализ MIP (проекций по максимальной интенсивности) показал, что от центросомы до края клетки растет очень небольшое количество МТ, таким образом, большинство МТ, растущих от центросомы, не достигает края клетки. Описание основных субпопуляций МТ нецентросомального происхождения Продолжительность периодов роста для свободных МТ, растущих около края клетки, составила 22.6±1.3с, средняя длина треков составила 6.9±0.1 мкм, а средняя скорость роста составила 24.7±1.3 мкм/мин. Для свободных МТ во внутренней цитоплазме все характеристики распределений статистически не отличались от МТ, растущих у края клетки. Так, для таких МТ средняя длина трека составила 6.2±0.1 мкм, средняя продолжительность периодов роста составила 15.8±0.3 с, скорость роста составила 23.9±0.6 мкм/мин (Рис.3) Для анализа пространственного распределения нецентросомальных МТ мы также построили проекции по максимальной интенсивности. Треки таких МТ либо росли прямо, либо слегка изгибались, причем большинство изогнутых МТ располагались вблизи края клетки. Качественный анализ таких изображений показал, что наибольшая плотность растущих МТ наблюдается около краев клетки, где происходит постоянное выдвижение и ретракция ламеллы. Такой край мы называли «активным» с точки зрения количества растущих МТ и общей организации ламеллы (Рис.4). Для оценки количества МТ, растущих в разных зонах клетки, мы измерили плотность распределения плюс-концов для 300 комет в 7 клетках с постоянной экспрессией EB3-RFP. Для этого на кадрах были выделена одинаковые площади около центросомы (на расстоянии 2-4 мкм, не включая яркий кластер комет в самой центросоме), во внутренней цитоплазме, на активном крае клетки и на ее стабильном крае. Распределение плюс-концов комет оказалось неравномерным для активного и стабильного края. Наибольшая плотность плюс-концов наблюдалась на активном крае клетки (на расстоянии 2 мкм от плазматической мембраны) - 0.37±0.05 комет на 1 мкм2, что статистически не отличалось от значения плотности комет вблизи центросомы. Вблизи стабильного края клетки плотность комет значительно уменьшилась и составила (0.17±0.05 комет на 1 мкм2). Плотность комет остается примерно одинаковой на расстоянии до 20 мкм от центра клетки, после чего начинает линейно возрастать в направлении края клетки (Рис.5). Таким образом, центросомальные МТ составляют небольшую часть МТ цитоплазмы, поэтому на следующем этапе работы была выдвинута гипотеза о существовании цитоплазматических кластеров роста МТ. Для того чтобы обнаружить такие кластеры, цитоплазма каждой клетки была поделена на зоны диаметром 2 мкм. Для последующего анализа были выбраны зоны, соответствующие следующим критериям: 1) в этих зона присутствовали изгибающиеся МТ и 2) число треков, начинающихся в таких зонах, было больше, чем в среднем в цитоплазме (3 и более событий в минуту). В результате мы обнаружили 113 таких зон в 89 клетках. Среднее число МТ, начинающих свой рост в таких зонах, составило 6.2±0.9 событий в минуту, что в 3 раза больше, чем в среднем по цитоплазме (2.0±0.7 событий в минуту). В предыдущих исследованиях на эпителиальных клетках было показано, что такие цитоплазматические кластеры роста МТ могут быть ассоциированы с аппаратом Гольджи. Окраска клеток антителами к белку K58 (специфическому компоненту аппарата Гольджи) показала, что в фибробластах 3Т3 он локализован преимущественно в перинуклеарной области, ориентирован по направлению к ведущему краю клетки и имеет средний размер 6.3±2.0 мкм2 (N=10) (Рис.6), тогда как цитоплазматические кластеры роста МТ располагались преимущественно около края клетки (на расстоянии 5.6±2.5 мкм от плазматической мембраны) и имели размер не более 2 мкм2. Цитоплазматические кластеры роста МТ были найдены в клетках как с активной, так и с неактивной центросомой. Количество таких кластеров на клетку варьировало от 1 до 3 (1 кластер был найден в 41 клетке, 2 кластера - в 21 клетке и 3 кластера в 10 клетках), то есть каждая клетка содержала хотя бы один такой кластер. Клетки с одним и двумя цитоплазматическими кластерами роста МТ не отличались друг от друга по площади и параметрам формы (Рис.7). Параметры роста МТ (скорость и продолжительность) в клетках с одним кластером были немного выше по сравнению с динамическими параметрами МТ для клеток с двумя кластерами (Таблица 1). Таблица 1. Динамические параметры роста МТ в клетках с 1 и 2 цитоплазматическими кластерами роста (данные представлены в виде среднее±ошибка среднего) 1 фокус на клетку 2 фокуса на клетку Число клеток 41 21 Число треков 1348 1202 Длина, мкм 8.2±0.5 6.2±0.4 Длительность периодов роста, с 16.5±0.2 15.8±0.2 Скорость роста, мкм/мин 30.0±0.4 24.8±0.4 Для выяснения роли цитоплазматических нецентросомальных МТ в организации системы МТ в фибробластах 3Т3, в таких клетках была отслежена пространственная организация сети МТ в процессе восстановления после их полной деполимеризации. Для этого клетки 3Т3, трансфецированные плазмидой, кодирующей GFP-тубулин, в течение 1 часа инкубировали в присутствии высоких дозами нокодазола (4 мкМ), после чего отмывали ингибитор, и фиксировали клетки через 5 минут и через 1 час после отмывки от ингибитора. В клетках, трансфецированных GFP- тубулином, МТ начинали расти во всех зонах цитоплазмы через 2 минуты после удаления нокодазола. В таких клетках были отчетливо видны кластеры коротких радиально растущих МТ. Эти кластеры локализовались преимущественно около ядра и представляли собой активную центросому (в 270 клетках из 350). В остальных 80 клетках рост МТ начинался диффузно во всех зонах цитоплазмы. Для того чтобы более детально охарактеризовать динамику роста МТ после восстановления от нокодазола, были отсняты фильмы для 30 клеток со стабильной экспрессией EB3-RFP с теми же условиями эксперимента. В присутствии нокодазола в цитоплазме клеток полностью отсутствовали кометы, однако в некоторых клетках по-прежнему присутствовала активная центросома, визуализируемая как яркий кластер комет в центре клетки. Яркость такого кластера составила 3.9±0.4 EB3-RFP комет (по сравнению с 7.3±3.4 в контроле). Первые кометы появились в цитоплазме клеток через 2 минуты после удаления нокодазола. Хотя активная центросома присутствовала в 28 из 30 отснятых клеток, основная масса МТ начинала расти от нецентросомальных кластеров роста в цитоплазме клетки, причем рост происходил преимущественно вдоль краев клетки (Рис.8). Частота событий роста новых МТ в первые минуты после удаления нокодазола составила 421±114 событий в минуту, что в 1.5 раза меньше, чем в контроле. Через час после удаления нокодазола частота событий роста новых МТ приблизилась к нормальным значениям и составила 674±174 событий в минуту. Продолжительность периодов роста МТ также возросла с 11.3±3.2 с через 5 минут до 15.0±5.2 с через час после удаления нокодазола. Проверка гипотезы о регуляции фокальных контактов динамичными микротрубочками в клетках с мезенхимальным типом подвижности На предыдущем этапе работы (в 2016 году) были описаны динамические параметры фокальных контактов (ФК) в распластывающихся клетках и показано наличие корреляции между количеством динамических микротрубочек в зоне ФК и скоростью их разборки (чем больше динамических МТ оказывается в зоне отдельного ФК в течение его жизни, тем быстрее он разбирается). В контрольных клетках большинство ФК образовывалось и исчезало на расстоянии не более 5 мкм от края клетки. За момент возникновения контакта был принят 1 кадр, где интенсивность флуоресценции его отличалась от значений интенсивности фона, моментом исчезновения считался кадр, где интенсивность флуоресценции все еще отличалась от значений интенсивности фона или тот кадр, где происходило разделение существующего контакта на два новых. Для 520 контактов в 22 клетках были измерены следующие характеристики: время жизни, площадь, и интегральная интенсивность флуоресценции (характеристика, отражающее общее количество маркерного белка в ФК). В контрольных клетках среднее время жизни ФК составило 27.5±8.5 минут, из которых 19.3±3.9 минуты составила стадия стабильного существования контакта. Средняя площадь ФК составила 2.2±0.6 мкм2. Средняя интегральная интенсивность флуоресценции в стабильных ФК (измеренная в кадре с максимальной площадью ФК) составила 2.14±0.15 ед.фл./мкм2. Для оценки влияния динамичных МТ на параметры ФК была выведена линия фибробластов 3Т3 со сниженной экспрессией EB3 в результате нокдауна гена EB3 с помощью shРНК. Методами ПЦР в реальном времени и вестерн-блотинга было показано, что уровень экспрессии мРНК и белка EB3 в таких клетках снижен как минимум на два порядка (Рис.9). Динамика и морфология ФК в клетках 3Т3 со сниженной экспрессией белка EB3 (всего проанализировано 152 контакта в 10 клетках) отличается от контроля. В этом случае ФК локализуются в околоядерной области, а клетки практически не формируют ламеллоподий (Рис.10). Средняя площадь ФК в таких клетках была в 1.5 раза больше, чем в контроле, и составила 3.7±0.8 мкм2. Среднее время жизни таких контактов увеличенго по сравнению с контролем и составляет 76.0±12.8 минут. В то же время значения интегральной интенсивности ФК в клетках со сниженной экспрессией EB3 статистически не отличались от контроля. Схожие характеристики были получены для ФК в клетках с частично стабилизированными МТ (100 нМ таксола и 50 нМ нокодазола). Так, среднее время жизни ФК в клетках со стабилизированными МТ составило 81.2±7.8 минут, средняя площадь контактов в кадре с максимальной площадью составила 2.9±0.5 мкм2. Таким образом, на данном этапе работы стало возможно сделать следующие выводы: 1) Центросома как ЦОМТ неактивна примерно в 50% популяции фибробластов 3Т3. 2) В интерфазных фибробластах центросома формирует относительно короткие МТ, вклад которых в общую организацию сети МТ в цитоплазме невелик. 3) Микротрубочки нецентросомальнго происхождения растут в основном вдоль краев клетки, причем плотность растущих плюс-концов МТ максимальна на активном крае клетки. 4) Нецентросомальные МТ могут расти от цитоплазматических локусов роста, находящихся на расстоянии не более чем 5 мкм от края клетки 5) Рост МТ de novo при восстановлении сети интерфазных МТ начинается одновременно на центросоме и в нескольких зонах цитоплазмы клетки. 6) В клетках с подавленной экспрессией плюс-концевого белка МТ EB3, также как и в клетках со стабилизированной ингибиторами системой МТ повышается среднее время жизни и площадь фокальных контактов, кроме того, значительное количество ФК начинает локализоваться в теле клетки.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: Задача 1. описать нарушения морфологии и динамики распластывания клеток при стабилизации и деполимеризации микротрубочек для нормальных фибробластов мыши (клеток MEF), чтобы показать универсальность описанного ранее феномена Морфология и кинетика распластывания клеток MEF (мышиные эмбриональные фибробласты) на стекле была сходной с таковой для фибробластов Vero (описана в Творогова, Воробьев, 2012 (14)). Как и в случае фибробластов Vero, клетки прикреплялись к субстрату и начинали формировать ламеллу в течение 10.2±2.8 минут после прикрепления. От момента прикрепления и до начала выдвижения ламеллы клетки формировали маленькие быстро исчезающие блебсы. После этого начиналась фаза быстрого распластывания, которое происходило изотропно (с выдвижением ровной округлой ламеллы по периметру большей части клетки) или анизотропно (с выдвижением нескольких неровных ламелл). Во время фазы быстрого распластывания за первые 10 минут площадь клеток MEF увеличилась в 3.15±0.48 раз (по сравнению с 4.46±0.44 раз для клеток Vero). Скорость распластывания в первые 10 минут составила 146.1±2.9 мкм2/мин, за следующие 10 минут упала в 5 раз, и к концу 20-й минуты суммарное увеличение площади для клеток MEF составило 3.88±0.51 раза (по сравнению с 5.07±0.44 раз для клеток Vero) (Рисунок 1А, Таблица 1). После 20 минут распластывание резко замедлялось, и клетки приобретали неправильную форму. Средняя скорость распластывания в период с 21 по 60 минуту составила 8.29±1.49 мкм2/мин, и к концу первого часа клетки увеличили свою площадь в 4.88±0.57 раз относительно начальных значений (6.64±0.0.35 раза для клеток Vero). К концу первого часа распластывания все клетки сформировали стабильные края, и некоторые начали движение по субстрату. Фаза медленного распластывания продолжалась в течение трех часов, и к концу третьего часа средний коэффициент увеличения площади для клеток MEF составил 6.35±0.53 раза (7.52±0.48 раза для клеток Vero). При полной деполимеризации микротрубочек (МТ) в присутствии 4 мкМ нокодазола клетки оставались округлыми в течение длительного времени с момента прикрепления (среднее время для клеток MEF составило 72±48 минут). В течение этого времени в клетках происходил интенсивный блеббинг без образования ламеллиподий. Некоторые клетки не смогли начать распластывание в течение всех 6 часов наблюдения. Распластывание начиналось с формирования маленькой ламеллы, однако блеббинг не прекращался и продолжался в течение 1-3 часов после начала распластывания. Распластывание клеток с деполимеризованными МТ всегда происходило анизотропно, и в некоторых случаях было обратимым. В течение первых 10 минут среднее увеличение площади составило 2.08±0.09 раза (рисунок 1Б, Таблица 2). К концу первого часа клетки увеличили площадь в 2.61±0.19 раза, и к концу третьего часа площадь клеток MEF с деполимеризованными МТ увеличилась в 3.84±0.13 раза относительно начальных значений (что в среднем в два раза ниже, чем в контроле). Клетки с деполимеризованными МТ оставались неполяризованными даже через три часа после начала распластывания и не приобретали вытянутую форму (фактор элонгации EF через 3 часа составил 1.17±0.02 по сравнению с 1.64±0.10 для контрольных клеток). Таким образом, полная деполимеризация МТ приводит к удлинению фазы блеббинга, замедлению быстрой фазы распластывания, обратимости процесса и общему замедлению распластывания в часовой шкале. Учитывая, что часть наблюдаемых эффектов может быть связана не с исчезновением МТ, а с замедлением их динамики, мы оценили кинетику распластывания клеток MEF при частичном подавлении динамики МТ сочетанием низких доз нокодазола и таксола (100 нМ и 150 нМ соответственно). Как и в случае деполимеризованных МТ, в клетках после прикрепления образуются многочисленные блебсы, блеббинг клеток не прекращается в течение 1-3 часов после прикрепления. В случае частичного подавления динамики МТ распластывание клеток также происходит преимущественно анизотропно. В отличие от клеток с деполимеризованными МТ, клетки со стабилизированными МТ вытягивались к концу третьего часа (фактор элонгации EF 1.68±0.03) и образовывали ламеллу, сходную по морфологии с ламеллой контрольных клеток. Клетки со стабилизированными МТ распластывались быстрее, чем клетки с деполимеризованными МТ, но медленнее, чем в контроле. Через 20 минут площадь клеток со стабилизированными МТ увеличилась в 2.64±0.23 раза, через час площадь клеток увеличилась в 3.45±0.26 раза, и через три часа клетки увеличили свою площадь в 4.29±0.36 раза относительно контрольных значений. В сумме подавление динамики МТ приводит к удлинению фазы блеббинга, замедлению быстрой фазы распластывания и замедлению распластывания в часовой шкале. Отличие в поведении клеток со стабилизированными МТ от клеток с деполимеризованными МТ заключается в морфологии ламеллы. величине блебсов и способности клеток к элонгации. Таким образом, на данном этапе мы продемонстрировали универсальность ранее описанного феномена регуляции фазы быстрого распластывания динамичными МТ на примере фибробластов 3Т3, Vero и MEF. Задача 2. сравнить морфологию клеток и динамику их распластывания под воздействием различных ингибиторов сигнального каскада фосфорилирования легкой цепи миозина II (Y-27632 и блеббистатина) Считается, что распластывание клеток в основном регулируется через сокращение актомиозинового комплекса, так как в процессе прикрепления и распластывания на субстрате клетки развивают значительное механическое усилие. Для изучения влияния актомиозинового сокращения на различные фазы распластывания мы использовали ингибиторы каскада фосфорилирования легкой цепи миозина II Y27632 (ингибирует Rho – ассоциированную киназу ROCK) и блеббистатин (ингибирует АТФ-азную активность миозина). Влияние ингибиторов на процесс распластывания оценивали на клетках MEF и 3T3. Основное отличие от контроля в этом случае заключалось в отсутствии клеток с изотропным распластыванием. С самого начала распластывания клетки формировали длинные протрузии в нескольких направлениях, клетки приобрели изрезанные края и звездчатую форму с многочисленными удлиненными протрузиями. Кинетика распластывания клеток в присутствии обоих ингибиторов не отличалась от контроля в течение первых 20 минут после начала распластывания. После прикрепления фибробласты 3Т3 не образовывали блеббсов и начинали формировать ламеллу через 10.5±4.2 минут (Y-27632) или через 7.5±4.5 минут после прикрепления (блеббистатин). В течение первых 10 минут в присутствии блеббистатина клетки увеличили площадь в 3.89±0.34 раз, в конце первого часа площадь увеличилась в 6.39±0.24 раз, и через три часа после начала распластывания увеличение площади для клеток 3Т3 составило 6.47±0.28 относительно контрольных значений. В присутствии Y-27632 кинетика распластывания клеток 3Т3 была аналогичной. Эти значения чуть меньше контрольных в целой популяции, но совпадают со значениями для кинетики анизотропно распластывающихся клеток. Скорость распластывания для клеток 3Т3 в присутствии блеббистатина в течение первых 10 минут составила 54.9±6.86 мкм2/мин, 7.10±1.63 мкм2/мин в интервале 21-60 минут и снизилась до 0.21±0.40 мкм2/мин в интервале 61-180 минут. В присутствии Y-27632 начальная скорость распластывания составила 39.04±4.94 мкм2/мин, что несколько ниже контрольных значений. В дальнейшем скорость распластывания фибробластов 3Т3 в присутствии Y-27632 снизилась до 5.97±0.84 мкм2/мин в интервале 21-60 минут и до 1.24±0.34 мкм2/мин в интервале от 61 до 180 мнут. Кинетика распластывания фибробластов MEF в присутствии ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина была аналогична таковой для клеток 3Т3 и не отличалась от контрольных значений. Через 20 минут после начала распластывания клетки MEF увеличили площадь в 3.36±0.21 раза в присутствии блеббистатина (в 4.01±0.27 раза в присутствии Y-27632). Через 180 минут относительное увеличение площади клеток MEF в присутствии блеббистатина составило 5.42±0.24 и 5.72±0.45 в присутствии Y-27632. Таким образом, ингибирование фосфорилирования легкой цепи миозина II не приводит к замедлению распластывания фибробластов в часовой шкале, однако значительно меняет морфологию клеток. Задача 3. Описать феномен восстановления быстрого распластывания фибробластов при одновременной стабилизации сети микротрубочек и ингибировании фосфорилирования легкой цепи миозина II. Мы предположили, что динамичные микротрубочки могут влиять на процесс распластывания через ингибирование каскада легкой цепи миозина. Тогда в клетках с нарушенной системой микротрубочек в присутствии ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина должна восстанавливаться кинетика процесса распластывания, близкая к контрольным клеткам. Для проверки этой гипотезы мы описали кинетику и морфологию процесса распластывания для клеток MEF и 3Т3 в присутствии ингибиторов МТ и ингибиторов фосфорилирования легкой цепи миозина. Добавление блебистатина к клеткам с деполимеризованными МТ не оказало эффекта на морфологию клеток, тогда как добавление Y-27632 привело к восстановлению формы клеток в часовой шкале. Через три часа после начала распластывания клетки с деполимеризованными МТ в присутствии блеббистатина оставались практически округлыми (EF=1.37±0.12), однако край клеток был сильно изрезан (значение циркулярности 0.34±0.19), тогда как в присутствии Y-27632 клетки с деполимеризованными МТ вытягивались (EF=1.64±0.22), а их край был практически ровным (значение циркулярности 0.62±0.19). И в том и в другом случае в клетках практически отсутствовал блеббинг, а общая морфология клеток совпадала с морфологией клеток в присутствии только нокодазола: распластывание начиналось с формирования маленьких псевдоподий и формирования нескольких узких ламелл. В присутствии блеббистатина в клетках с деполимеризованными МТ восстанавливалась кинетика быстрой фазы распластывания: в первые 10 минут скорость распластывания составила 57.98±6.67 мкм2/мин, и снизилась до 2.43±1.29 мкм2/мин через 20 минут. Кинетика распластывания клеток с деполимеризованными МТ в присутствии Y-27632 была практически линейной: в первые 10 минут скорость распластывания составила 15.72±3.36 мкм2/мин (что, тем не менее, в два раза выше, чем в клетках в присутствии только нокодазола) и снизилась до 8.06±1.00 мкм2/мин через 20 минут. Клетки со стабилизированными МТ в присутствии ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина начинали распластывание с формирования нескольких длинных ламелл. В некоторых случаях в таких клетках начиналось формирование широкой ламеллы, однако вскоре она разделялась на несколько более мелких ламелл с асинхронной скоростью роста. Добавление блеббистатина к клеткам со стабилизированными МТ восстанавливало кинетику нормальную кинетику быстрой фазы распластывания: в течение первых 10 минут средняя скорость распластывания составила 56.54±7.62 мкм2/мин, в следующие 10 минут упала до 19.56±4.92 мкм2/мин, дальнейшее распластывание проходило так же, как и в контроле. Через 20 минут после прикрепления средняя площадь клеток увеличилась в 4.25±0.36 раз, через час она возросла в 5.53±0.33 раз, и в течение 3 часов площадь клеток увеличилась в 6.67±0.29 раз относительно начальных значений. Добавление Y-27632 к клеткам со стабилизированными МТ также восстанавливало кинетику быстрой фазы распластывания. В первые 10 минут средняя скорость распластывания составила 30.84±4.95 мкм2/мин, в следующие 10 минут она упала до 18.82±2.7 мкм2/мин, за этот отрезок относительная средняя площадь клеток увеличилась в 3.53±0.27 раз (рисунок 1В, Г). В интервале 21-60 минут средняя скорость распластывания составила 8.47±1.22 мкм2/мин, и через час средняя площадь клеток увеличилась в 5.23±0.33 раз. Через час после прикрепления клеток скорость распластывания упала до 1.98±0.43 мкм2/мин, и через три часа средняя площадь клеток возросла в 6.39±0.28 раз по сравнению с начальными значениями. Те же эффекты мы наблюдали для клеток MEF со стабилизированными МТ в присутствии ингибиторов фосфорилирования миозина (Таблица 2). Так же, как и для клеток 3Т3, добавление ингибиторов фосфорилирования миозина восстанавливало нормальную кинетику распластывания для клеток со стабилизированными МТ, и эффект восстановления кинетики распластывания был более выражен в случае блеббистатина, чем в случае добавления Y-27632. Таким образом, мы показали, что добавление ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина к клеткам со стабилизированными МТ восстанавливает нормальную кинетику распластывания за счет снижения активности актмиозинового аппарата клетки. Задача 4. Описать морфологию сети актиновых филаментов и распределение паттернов фосфорилирования миозина II в распластывающихся фибробластах под воздействием вышеперечисленных ингибиторов Так как процесс распластывания в значительной мере зависит от баланса между протрузиями, создаваемыми клеткой за счет полимеризации актина, и ретракциями, индуцируемыми активностью миозина II, мы проанализировали отличия в организации сети актиновых филаментов в клетках 3Т3 с нормальной и разрушенной системой МТ на разных временных точках после начала распластывания. В клетках с изотропным распластыванием актиновые пучки не формировались в течение 10 минут после прикрепления. Через 10-20 минут после начала распластывания в некоторых клетках возникали тонкие пучки актиновых филаментов (актиновые арки), идущие параллельно краю клетки, а миозин был распределен равномерно по всей ламелле. В интервале 21-60 минут актиновые арки постепенно замещались толстыми пучками стресс-фибрилл. Через 60 минут после начала распластывания в клетках сформировались стресс-фибриллы с регулярно расположенными на них молекулами миозина (Рисунок 2). Стабилизация или деполимеризация МТ стимулировала образование толстых актиновых пучков и формированием стресс-фибрилл: через 20 минут после начала распластывания во всех клетках были сформированы толстые стресс-фибриллы с молекулами миозина, декорирующими актиновые филаменты. Однако во всех клетках отсутствовала сформированная ламелла. Через час в клетках со стабилизированными МТ формировались короткие пучки актиновых филаментов по всему телу клетки, в клетках с деполимеризованными МТ практически исчезла сеть актиновых филаментов. На поздних стадиях распластывания (через три часа) в клетках с нарушенной системой МТ основная часть актиновых пучков находилась в теле клетке, тогда как в контрольных клетках пучки актина практически отсутствовали в теле клетки. Инкубация клеток с блеббистатином и Y-27632 препятствовала формированию толстых пучков актиновых филаментов и реорганизации актинового цитоскелета: через 20 минут в клетках появлялось небольшое количество тонких актиновых пучков, через час и через три часа пучки актиновых филаментов оставались, однако не происходило формирования стресс-фибрилл. Учитывая, что ингибиторы каскада фосфорилирования легкой цепи миозина II восстанавливали кинетику распластывания в клетках со стабилизированными МТ, мы предположили, что динамичные МТ могут влиять на статус фосфорилирования легкой цепи миозина II (MLCII). Для проверки данного предположения мы окрасили антителами к MLCII фиксированные препараты клеток 3Т3 с нормальной системой МТ, стабилизированными или деполимеризованноми МТ через 5 минут и через 20 минут после начала распластывания. Через 5 минут после начала распластывания в клетках с нарушенной системой МТ визуализировалось кольцо из молекул фосфорилированного миозина вблизи от края клетки, тогда как в контрольных клетках кластеры фосфорилированного миозина были локализованы диффузно по телу клетки (Рисунок 3). Таким образом, мы описали морфологию актиновых филаментов в клетках с нарушенной системой МТ в процессе распластывания, и показали, что динамичные МТ напрямую влияют на статус фосфорилирования легкой цепи миозина II, а значит, и на процесс актомиозинового сокращения на ранних стадиях распластывания. Заключение На основании результатов этапа стало возможным предложить следующую модель распластывания клеток: после начального прикрепления клетки сохраняют округлую форму и начинают формировать блеббсы вследствие активации актомиозинового сокращения в кортикальном слое цитоплазмы (фаза Р0). В конце этой фазы натяжение в кортикальном слое умешьшается, и начинается активная полимеризация актиновых филаментов для увеличения площади клетки на субстрате. В этот временной период динамические МТ опосредуют релаксацию миозина, что в сочетании с полимеризацией кортикального актина приводит к быстрому росту площади клетки (фаза Р1). После истощения пула неполимеризованного актина начинается процесс формирования пучков актиновых фмиламентов, что в сочетании с активацией миозина II приводит к началу медленной фазы распластывания (фаза Р2). Наши результаты свидетельствуют об универсальности описанного феномена и имеют важное значение для изучения возможных механизмов опухолевого роста и инвазии. Поставленные задачи проекта выполнены полностью. По результатам проекта подготовлена и принята в печать статья в журнале Biology Open (IF=2.2).
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: В качестве объектов исследования были выбраны фибробласты линии 3Т3 (эмбриональные фибробласты мыши). Для визуализации фокальных контактов клетки трансфецировали плазмидой, кодирующей ген белка винкулина, слитый с красным флуоресцентгным белком RFP и проводили цейтраферную съемку в течение 8 часов, интервал между кадарами составил 5 минут. На полученных последовательностях изображений анализировали морфологические и динамические параметры ФК (площадь и время жизни соответственно). Площадь фокальных контактов рассчитывалась автоматически в программе ImageJ после создания контура в ручном режиме. Статистическую обработку производили в программе GraphPad Prizm 5 по критерию Манна-Уитни. Время жизни рассчитывалось как разница между последним и первым кадром в которых существовал фокальный контакт. Большая часть фокальных контактов (порядка 80%) в клетках сосредоточена на периферии (не далее, чем 10 мкм от края плазматической мембраны) (рис. 1а, г). Для статичного кадра медиана количества ФК, существующих на краю клетки, равна 43.5 (32-56, N=10), тогда как в теле клетки она равна 4 (0-18, N=10). Формирование ФК происходит фронтом по краю активной ламеллы, каждый новый фронт располагается ближе, чем предыдущий, к убегающему вперед краю клетки. Рост ФК происходит в направлении от клеточного края, при этом ФК приобретают продолговатую форму. В теле клетки формирование ФК носит спонтанный характер и является независимым от краевой подвижности клетки процессом, в теле чаще встречаются ФК округлой формы. Жизненный цикл всех ФК можно разделить на следующие стадии: стадия сборки (время, когда площадь контакта увеличивается), стадия стабильного существования (время, когда площадь контакта максимальна и практически не меняется) и стадия разборки (время, когда площадь контакта уменьшается). Медианная площадь ФК в клетках 3Т3 составляет 0.62 мкм2 (диапазон 0.07-5.2, выборка 750 контактов в 5 клетках), медианное время жизни в контрольных клетках 3Т3 составило 33.5 минуты (диапазон 6-164 минуты, 60 контактов в 6 клетках) Задача 2. Описать морфологические и динамические параметры фокальных контактов в присутствии ингибиторов каскада малой ГТФазы RhoA (Y-27632 и ML-7) При инкубации клеток с 10 мкМ ингибитора киназы ROCK (Y-27632) увеличивается время жизни ФК. В присутствии Y-27632 медиана времени жизни ФК возрастает до 49.5 минут (диапазон 13-121 минуты, N=50), то есть контакты становятся более стабильными. В присутствии ингибитора киназы MLCK (10 мкМ ML-7) продолжительность времени жизни ФК также возрастает, в этом случае медиана составляет 59.5 минут (диапазон 18-271 минуты, N=50). Ингибирование фосфорилирования миозина приводило не только к увеличению времени жизни ФК, но и к уменьшению их площади. В условиях подавления активности киназы ROCK (10 мкМ Y-27632) медиана площади фокальных контактов в клетках 3Т3 уменьшается в 2 раза (до 0.31 мкм2 относительно контрольного значения 0.62 мкм2,, различия статистически значимы, сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни, p<0.0001) (рис. 1д). В условиях ингибирования киназы MLCK медианная площадь фокальных контактов в фибробластах линии 3Т3 в присутствии 10 мкМ ML-7 составляет 0.26 мкм2 (диапазон 0.07-2.25 мкм2, N=287) (рис.1 в,е), различия от контроля также оказались статистически значимыми (сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни, p<0.0001). Кроме того, при инкубации клеток с ML-7 мы наблюдали появление большого количества ФК в теле клетки. Таким образом, снижение количества фосфорилированного миозина как при ингибировании киназы MLCK, так и при ингибировании вышестоящей киназы ROCK приводит к стабилизации фокальных контактов и их частичной разборке в клетках 3Т3. Задача 3. описать морфологию сети актиновых филаментов фокальных контактов на фиксированных препаратах Актиновый цитоскелет в контрольных клетках представлен сетью коротких актиновых фибрилл, распределенных как по периферии, так и в теле клетки, толстыми пучками стресс фибрилл и кортикальным актином, стабильные края представлены в виде актиновых арок (рис. 2). Актомиозиновое сокращение и возникающее вследствие этого в клетке натяжение влияет на поведение ФК. Следовательно, можно предполагать, что ингибирование фосфорилирования миозина, приводящее к релаксации этого натяжения, также будет влиять на поведение ФК. Мы проанализировали морфологию клеток и структуру актинового цитоскелета на фиксированных препаратах клеток, окрашенных фаллоидином через 30, 60 и 120 минут инкубации, качественный эффект для обоих ингибиторов наблюдался уже в первой контрольной точке (30 минут). В целом, удалось проследить градацию действия ингибиторов на структуры актинового цитоскелета: наиболее чувствительны стресс фибриллы, после чего происходит разборка актина кортикальной зоны, затем в клетках разбираются тонкие актиновые филаменты, наиболее устойчивы к действию ингибиторов оказываются актиновые арки стабильных краев клетки. При инкубации с Y-27632 клетки приобретают характерную «звездчатую» форму. Площадь клеток сначала возрастает на 36% по сравнению с контрольными значениями (2838.46 мкм2 против 2082.55 мкм2), после чего наблюдается линейное снижение площади, занимаемой клеткой, спустя 120 минут инкубации с ингибитором различие составляет 10% (2291.48 мкм2 против 2082.55 мкм2), однако различие статистически недостоверно. Фактор элонгации снижается до 1.61 (по сравнению с 1.78 в контроле). Сеть кортикальных фибрилл разрежена, стресс фибриллы полностью разбираются или, в единичных случаях, тонкие пучки сохраняются по периферии клетки (после часа инкубации даже тонкие стресс-фибриллы в клетках отсутствуют). На стабильных краях клетки сохраняются тонкие актиновые арки, заметно увеличение числа зон стабильного края (Рис. 3, Y-27632). Под действием ML-7 клетки сильнее распластываются и формируют широкую зону активной ламеллы. В течение первого часа инкубации площадь клеток относительно контроля возрастает на 60% (медиана 3309.94 мкм2 против 2082.55 мкм2 в контроле), после чего наблюдается незначительное снижение площади. Клетки становятся более округлыми (фактор элонгации снижается до 1.51 по сравнению с 1.78 в контроле). Изменения актинового цитоскелета в случае инкубации с ML-7 такие же, как при инкубации с Y-27632, однако разборка стресс-фибрилл наблюдается только после 2 часов инкубации (спустя полчаса инкубации стресс фибриллы интактны) (Рис. 3, ML-7).
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: Реферат Миграция клеток играет ведущую роль в процессах эмбрионального развития, заживления ран, иммунном ответе и ряде других процессов. Процесс миграции клеток состоит из нескольких стадий – выдвижения ламеллы, ее закрепления на субстрате с помощью фокальных контактов и затем подтягивания задней части клетки. Этот процесс зависит от координированной работы акто-миозинового цитоскелета и организации системы фокальных контактов (адгезий), удерживающих клетку на субстрате. Пространственно-временная регуляция динамики полимеризации актина и акто-миозинового сокращения обеспечивает распластывание и движение клеток, а микротрубочки играют важную регуляторную роль в движении нормальных фибробластов, кератиноцитов и многих раковых клеток. Нарушение процессов регуляции систем цитоскелета может менять миграторный потенциал клеток и приводить к метастазированию и инвазии, что характерно для наиболее агрессивных типов опухолей. Процесс метастазирования подразумевает собой четыре последовательно сменяющееся стадии: открепление, миграция, инвазия и прикрепление, все эти стадии невозможны без взаимодействия микротрубочек, актомиозиновой системы и фокальных контактов. Фокальные контакты обеспечивают закрепление клетки на внеклеточном матриксе, и связывают внеклеточный матрикс с цитоскелетом. Таким образом возникает сопряженная система, в которой сигналы могут проходить как извне внутрь клетки, так и обратно, отражая реакцию клетки на изменения во внеклеточном матриксе. В результате клетка способна генерировать тяговые усилия, необходимые для продвижения по субстрату. Изучение особенностей регуляции ФК в опухолевых клетках позволит выявить новые потенциальные мишени для терапии, направленной на предотвращение расселения клеток злокачественных новообразований. Целью настоящего исследования стал анализ роли компонентов цитоскелета и регулирующих его факторов в пространственно-временной организации подвижных клеток во время прикрепления, распластывания, поляризации и движения. При реализации исследования были поставлены следующие задачи: 1. Описать поведение фокальных контактов в условиях подавления динамической нестабильности микротрубочек 2. Описать динамические параметры микротрубочек нецентросомального происхождения в клетках с мезенхимальным типом подвижности 3. Проанализировать роль динамических микротрубочек на различных этапах распластывания фибробластов 4. Описать взаимодействие систем актинового цитоскелета и фокальных контактов в клетках с мезенхимальным типом подвижности, проанализировать регуляцию этих взаимодействий через сигнальный каскад фосфорилирования легкой цепи миозина 5. Исследовать влияние киназ каскада фосфорилирования миозина II на динамику ФК в опухолевых клетках В качестве объектов исследования были выбраны нормальные клетки с мезенхимальным типом подвижности (мышиные фибробласты линии 3Т3, первичные мышиные фибробласты - MEF) и опухолевые клетки (линия фибросаркомы U2OS и линия аденокарциномы человека А549). В ходе исследования были получены следующие основные результаты: На первом этапе работы было показано, что микротрубочки участвуют в регуляции динамики фокальных контактов, и подавление динамической нестабильности МТ приводит к увеличению времени жизни стабильных ФК на краю клетки. Во второй части работы было показано, что в фибробластах линии 3Т3 динамичные микротрубочки регулируют поведение ФК – их площадь, время жизни, и локализацию. В частности, при стабилизации микротрубочек ингибиторами или при подавлении экспрессии плюс-концевого белка EB3 увеличивается площадь и время жизни фокальных контактов, при этом большое количество фокальных контактов появляется в теле клетки. На основании результатов третьего этапа стало возможным предложить следующую модель распластывания клеток: после прикрепления клетки сохраняют форму и начинают формировать блеббсы вследствие активации актомиозинового сокращения в кортикальном слое цитоплазмы (фаза Р0). В конце этой фазы натяжение в кортикальном слое уменьшается, и начинается активная полимеризация актиновых филаментов на краю клетки, приводящая к увеличению площади клетки на субстрате. В этот временной период динамические МТ опосредуют релаксацию миозина II, что в сочетании с полимеризацией кортикального актина приводит к быстрому росту площади клетки (фаза Р1) в течение нескольких минут. После истощения пула неполимеризованного актина начинается процесс формирования пучков актиновых филаментов, что в сочетании с активацией миозина II приводит к началу медленной фазы распластывания (фаза Р2), которая продолжается несколько часов. Основное внимание на четвертом этапе работы было уделено проверке гипотезы о различии эффектов, происходящих в разных зонах клетки, при инактивации ROCK и MLCK – киназ, фосфорилирующих миозин II в клетках 3Т3. Подавление активности миозин II-фосфорилирующих киназ ROCK и MLCK приводит к уменьшению площади фокальных контактов на краю клетки, при этом не меняет количество маркерного белка, а также в полной разборке ФК в теле клетки. Различия в эффектах ингибиторов касаются преимущественно актинового цитоскелета: подавление киназы ROCK приводит к разборке актиновых структур и диссоциации фосфорилированного миозина II, тогда как подавление киназы MLCK не оказывает воздействие на образование актомиозинового комплекса в обеих клеточных линиях. На пятом этапе работы было показано, что ингибирование киназы ROCK в клетках А549 и клетках U2OS приводит к увеличению времени жизни ФК на краю клетки, при этом уменьшается их площадь и интегральная интенсивность флуоресценции, а ФК в теле клетки исчезают. При ингибировании киназы MLCK на краю клетки возрастает время жизни ФК, снижается их интегральная интенсивность флуоресценции, однако площадь ФК при ингибировании MLCK значимо не изменяется. Проведённое исследование поведения различных систем цитоскелета и их взаимосвязи в процессах распластывания и движения клеток позволило получить более полное представление о взаимодействии компонентов цитоскелета и роли сигнальных молекул в организации фокальных контактов и клеточной подвижности. Эти результаты имеют большое фундаментальное значение, поскольку регуляция цитоскелета необходима для нормального гистогенеза, а также могут быть использованы в прикладных исследованиях по подвижности и метастазированию раковых клеток. Введение Миграция клеток играет ведущую роль в процессах эмбрионального развития, заживления ран, иммунном ответе и ряде других процессов. Процесс миграции клеток состоит из нескольких стадий – выдвижения ламеллы, ее закрепления на субстрате с помощью фокальных контактов, и затем подтягивания задней части клетки. Пространственно-временная регуляция динамики полимеризации актина и актомиозинового сокращения обеспечивает распластывание и движение клеток, а микротрубочки (МТ) играют важную регуляторную роль в движении нормальных фибробластов, кератиноцитов и многих раковых клеток. Процесс миграции также зависит от координированной работы акто-миозинового цитоскелета и системы фокальных контактов (ФК), удерживающих клетку на субстрате. По данным последних статей супермолекулярный комплекс ФК включает более 50 белков, непосредственно входящих в состав ФК, и еще порядка 200 белков, ассоциированных с ними (Byron and Frame, 2016). Структура, форма, размер, время жизни и расположение ФК сильно варьируют. Параметры ФК определяются конкретным молекулярным составом для каждого отдельного случая и зависит от происхождения клеток и их потенциала к миграции. Актуальность работы В последнее время показано, что адгезия клеток к внеклеточному матриксу является фактором, определяющим способность опухолевых клеток к инвазии и метастазированию. С одной стороны, внеклеточный матрикс рассматривается как один из множества факторов микроокружения, которые влияют на резистентность раковых клеток к химио- и лучевой терапии. Было показано, что гиперэкспрессия некоторых типов интегриновых рецепторов (и других белков ФК) повышает чувствительность раковых клеток к различным режимам лечения, включая лучевую терапию, химиотерапию и новые молекулярные терапевтические агенты (Eke and Cordes, 2015). С другой стороны, многие белки ФК (киназа фокальных контактов - FAK, паксилин) были предложены в качестве мишеней для ингибирования инвазии раковых клеток, поскольку сигналы от белков ФК являются фундаментальными для определения инвазивного (и как следствие метастатического) потенциала опухолевых клеток (Gkretsi, Stylianopoulos, 2018). Нарушение процессов регуляции динамики ФК может менять миграторный потенциал клеток и приводить к активному метастазированию и инвазии, что характерно для наиболее агрессивных типов опухолей. Изучение особенностей регуляции ФК в опухолевых клетках позволит выявить новые потенциальные мишени для терапии, направленной на предотвращение расселения клеток злокачественных новообразований. Данный анализ позволит прогнозировать результаты применения существующих схем химиотерапии, а также оптимизировать разработку новых схем полихимиотерапии онкологических заболеваний. ФК и элементы цитоскелета В процессе движения клетки на ее краю происходит постоянный процесс сборки-разборки фокальных контактов, который дополнительно регулируется при помощи элементов цитоскелета (микротрубочек и актиновых микрофиламентов). Микрофиламенты являются первым по важности компонентом цитоскелета, определяющим характеристики фокальных контактов. Структура актиновых стресс-фибрилл, непосредственно связанных с ФК, определяет степень механического натяжения и, в конечном итоге, способность клетки к передвижению с использованием сократимых элементов цитоскелета. В клетках с мезенхимальным типом подвижности встречается несколько типов актиновых фибрилл. Их классификация основана на структурной организации, наличии миозина, и связью с фокальными контактами. (Small et al., 1998; Hotulainen and Lappalainen, 2006). Дорзальные фибриллы прикреплены к ФК только с одного конца и не содержат миозин II, вследствие чего не могут сокращаться и являются стабилизирующими структурами (Tojkander et al., 2012). Поперечные дуги представляют собой изогнутые сократительные стресс фибриллы, содержат α-актинин и миозин II. Поперечные дуги не связаны с ФК напрямую, их косвенная связь осуществляется через дорзальные фибриллы. Дорзальные фибриллы и поперечные дуги формируются при полимеризации актина de novo и образуют единую динамическую сеть, которая может являться источником формирования вентральных стресс фибрилл (Hotulainen and Lappalainen, 2006). Вентральные стресс-фибриллы представляют собой актомиозиновые комплексы, способные сокращаться за счет большого количества, декорирующего их немышечного миозина II. Вентральные стресс-фибриллы заякорены с ФК с обоих концов. Кроме того, актиновый цитоскелет формирует перинуклеарную актиновую корзину (шапку) вокруг ядра, также состоящую из пучков актина и миозина II, соединяющую ядерную оболочку с ФК (Khatau et al., 2009). Подобное взаимодействие позволяет распространяться механическому натяжению от периферии клетки к ядру (Kim et al., 2012; Li et al., 2014; Shiu et al., 2018). В процессе возникновения механического натяжения стресс-фибриллы и ФК стабилизируют друг друга. Так, перемещение зиксина из ФК в состав стресс-фибрилл способствует стабилизации сократительных структур и усиливает натяжение (Yoshigi et al., 2005; Colombelli et al., 2009; Fabry et al., 2011). С другой стороны, натяжение, генерируемое сокращением стресс-фибрилл способствует включению винкулина в структуру ФК (Yamashita et al., 2014). При ингибировании актомиозиновой сократимости клеток ФК разбираются (Chrzanowska-Wodnicka and Burridge, 1996; Balaban et al., 2001). С другой стороны, при ингибировании формирования ФК в клетках не образуются стресс-фибриллы (Brieher, 2013). Если приложить дополнительное натяжение к клетке извне или усилить сократимость клетки, то это приводит к увеличению числа и размеров ФК, а также к росту пучков актиновых филаментов (Hirata et. al., 2008). Считается, что ФК на ведущем крае клетки работают как «механические ловушки», регулирующие ретроградный ток актина и его полимеризацию на ведущем крае клетки (Mitchison, Kirschner, 1988). Если полагать, что степень сокращения актомиозинового комплекса и скорость полимеризации актина для клетки постоянна, то усиление взаимодействия между актиновым цитоскелетом и внеклеточным матриксом (ВКМ) через ФК должно привести к исчезновению ретроградного тока актина, увеличению силы натяжения и более активному выдвижению ведущего края, тогда как нарушение взаимодействия между актиновым цитоскелетом и ВКМ должно привести к усилению ретроградного тока, уменьшению силы натяжения и подавлению выдвижения ведущего края. Одним из простых следствий гипотезы «механической ловушки» является предположение, что в условиях постоянного сократительного ответа клетки, вызванного активностью миозина II, скорость выдвижения протрузий должна отрицательно коррелировать со скоростью ретроградного тока актина. Это предположение было проверено для конуса роста аксонов (Lin, Forscher, 1995), филоподий фибробластов (Mallavarapu, Mitchison, 1999) и эпителиальных клеток (Ponti et al., 2004). В более общем виде показано, что скорость ретроградного тока актина на краю клетки велика в неподвижных или медленно движущихся клетках (Lin, Forscher, 1995; Ponti et al., 2004; Salmon et al. 2002) и в отсутствие интегриновых адгезий (Alexandrova et al., 2008), но минимальна в быстро движущихся кератоцитах (Theriot, Mitchison, 1991). Визуализация динамики белков в пределах ФК показала, что некоторые актин-связывающие и структурные белки ФК, такие как альфа-актинин, винкулин и талин в различной степени также вовлечены в ретроградный ток вместе с молекулами актина (Brown et al., 2006; Guo, Wang, 2007; Hu et al., 2007), в то время как молекулы зиксина, паксилина и FAK практически не перемещаются. Эти данные свидетельствуют о том, что «механическая ловушка» актин/ФК/ВКМ является подвижной структурой, допускающей подвижность белков, однако способной генерировать достаточные силы натяжения. Микротрубочки представляют собой второй компонент системы цитоскелета, определяющий динамику ФК. В 1991 году было показано, что отдельные микротрубочки врастают в активную ламеллу фибробласта и проходят очень близко от мест образования ФК, меченых винкулином. В месте прихода микротрубочки в отдельную протрузию, выдвигаемую клеткой, в протрузии начинается активный раффлинг, и через минуту после начала раффлинга в этом же месте начинает образовываться новый ФК (Geiger, 1991). Позднее на клетках суточной культуры было показано, что деполимеризация микротрубочек приводит к увеличению размеров зрелых фокальных контактов (Bershadsky et a., 1996; Kaverina et al., 1998; 2002). В то же время стабилизация микротрубочек не влияет на размер и плотность фокальных контактов, что было показано лишь на качественном уровне (Mikhailov, Gundersen, 1998). Ezratty и соавторы показали, что деполимеризация МТ высокими дозами нокодазола приводит к стабилизации ФК и более сильному сцеплению клеток с ВКМ. Отмывка от нокодазола приводит к временной разборке ФК на фоне восстановления МТ (Ezratty et al., 2009). Кроме того, под воздействием нокодазола увеличивается количество белков ФК, фосфорилированных по остаткам тирозина, а при отмывке от нокодазола количество фосфорилированных по тирозину белков возвращается к норме (Ezratty et al., 2005). Прямой контакт динамичного плюс-конца микротрубочек с ФК приводит его разборке (Efimov et. al., 2008). Моторные белки МТ, как участники внутриклеточного транспорта, также участвуют в регуляции динамики фокальных контактов. В фибробластах, доминантно-негативных по кинезину-1, ФК увеличиваются в размере, но их количество уменьшается, как и в клетках под воздействием нокодазола. Показано, что ингибирование динеина не влияет на морфологию и динамику фокальных контактов в фибробластах лягушки (Krylyshkina et al., 2002). Однако в более поздних исследованиях показано, что динеин участвует в разборке ФК (Ezratty et al., 2005; Ezratty et al., 2009) Миграция клеток и ФК Миграция клеток осуществляется в несколько этапов: выдвижение участка ламеллы, прикрепление его к внеклеточному матриксу, распластывание и подтягивание тела. Образование ламеллы происходит благодаря полимеризации актина на ведущем крае и работе комплекса ARP2/3, создающему разветвленную сеть. Прикрепление выдвинувшегося участка происходит за счет интегринового взаимодействия с лигандами внеклеточного матрикса. Затем происходит быстрое рекрутирование белков контакта и его созревание. Белки контактов и актиновый цитоскелет тесно взаимодействуют на всех этапах движения клеток. Так, в винкулин-дефицитных клетках не происходит рекрутирования ARP2/3 комплекса и не образуется ламелл (DeMali and Burridge, 2003). В ходе движения клеток по субстрату ФК захватывают лиганды ВКМ, при взаимодействии ФК с актиновыми филаментами развиваются тянущие силы, необходимые для вытягивания тела клетки вперед и следующего за этим подтягивания задней части. Таким образом, направленная миграция требует непрерывной и скоординированной перестройки актиновых фибрилл и ФК на переднем краю клетки, в теле и хвосте клетки (Case at. al., 2015; Wichert et. al., 2003). В зависимости от морфологических параметров и функций принято разделять ФК на 3 группы: фокальные комплексы, фокальные контакты и фибриллярные адгезии. При этом все три группы ассоциированы с сократимыми актомиозиновыми фибриллами. Сначала на краю ламеллы формируются фокальные комплексы в месте мембранного раффлинга (Fournier et al., 2010). Фокальные комплексы являются точечными структурами размером около 1 мкм2, и содержат типичные для ФК белки (Choi et al. 2011). Затем фокальные комплексы созревают в фокальные контакты, которые имеют удлиненную форму и достигают размеров вдоль длинной оси около 2 мкм (Murphy and Courtneidge 2011). Все это происходит на границе ламеллиподия-ламелла по краю ретроградного тока актина. Затем, когда ФК оказываются в теле клетки, они созревают в фибриллярные адгезии, имеющие размеры до 10 мкм2 (Zamir et al.1999; Geiger et al.2001; Zamir and Geiger, 2001). Однако, такие фибриллярные адгезии возникают только при наличии фибронектиновых фибрилл во ВКМ. Рецепторами фибронектина являются интегрины типа α5β1, а также цитоплазматический белок тензин (Zamiretal. 2000; Geigeretal. 2001). Механотрансдукция и сигнальные каскады ФК Фокальные контакты являются своеобразным декодером, позволяющим преобразовывать внешнее механическое напряжение в биохимические внутриклеточные сигналы (Ingber, 2006). Внешними источниками натяжения являются сжимающие, растягивающие напряжения, производимые субстратом или моделируемые в опыте. Внутриклеточные силы возникают вследствие осмотического давления или генерируются актиновыми микрофиламентами и работой моторных белков - миозинов или кинезинов и динеинов. Основными регуляторами механотрансдукции являются Rho белки (RhoA, RhoB). Так же, как и Rac (Rac1, Rac2) или cdc (cdc42), Rho-белки относятся к суперсемейству Ras, представляющему собой малые ГТФазы. На данный момент установлено, что под контролем этой группы белков находится множество физиологических функций в нормальных и опухолевых клетках, будь то полимеризация актина, формирование ламелл, сборка стресс-фибрилл, ФК или регулирование воспаления и злокачественного роста (Hall, 2005). За переведение молекул этого суперсемейства в активную форму ответственны GEFs (факторы обмена гуанина) и GAPs (белки, активирующие ГТФазы). Все белки суперсемейства Ras в клетке находятся в равновесии между ГТФ-связанной (активной) способной к восприятию и передаче сигналов или ГДФ-связанной (неактивной) формами. Rho семейство белков представлено несколькими высокогомологичными изоформами, различие межу которыми определяется только в момент посттрансляционных изменений С-концевого домена. Наиболее важным участником каскада регуляции ФК является малая ГТФаза RhoA. RhoA способна свободно распределяться по цитоплазме за счет взаимодействия с RhoGDI, извлекающим его из мембранных структур путем специфического связывания, и таким образом не ограничена в перемещении по всей клетке. На протяжении достаточно долгого промежутка времени зоной функционирования RhoA считалось тело клетки. Активность RhoA на периферии клетки была установлена с помощью FRET-сенсора к активной RhoA: в мигрирующих клетках активная RhoA формирует узкую полоску вдоль ведущего края клетки (Pertz et al., 2006). Увеличение активности RhoA при этом было прямо пропорционально росту протрузии на ведущем крае. Активность белка в теле клетки на протяжении всего эксперимента оставалась крайне низкой и минимальной в зонах колокализации с маркерным белком аппарата Гольджи (ARAP1). Также было показано, что клетки с конститутивно неактивным мутантом RhoA не могут формировать ламеллу, а в условиях гиперэкспрессии RhoA клетки открепляются от субстрата. В другом эксперименте было показано, что снижение уровня RhoA, в клетках рака простаты PC3 проявляется в формировании узких протрузий в двух-трех направлениях. Это значительно ухудшает подвижность клеток за счет децентрализации быстрой перестройки ФК в зоне растущих ламеллиподий. Трансфецированные клетки по сравнению с контролем двигались заметно менее направленно (Vega et al., 2011). Активная RhoA оказывается опорной точкой для целого комплекса процессов, связанных с клеточной подвижностью. С одной стороны, RhoA действует непосредственно на ФК, а с другой – через контроль внутреннего натяжения, создаваемого в клетке актин-миозиновым взаимодействием. В первом случае процесс во многом сопряжён с механотрансдукцией. За счет изменения плотности и текучести клеточных мембран происходит корректирование силы импульса, приходящего извне и проникающего внутрь клетки. В таком случае клетки перестают мигрировать и образовывать ламеллу с активным краем, не реагируя на поступающие извне сигналы. Если сигнал все же проходит, то в ответ на механический стимул происходит рекрутирование регуляторных киназ ФК: FAK и Src (Liu et al., 2014). Киназа фокальных контактов (FAK) представляет собой нерецепторную тирозинкиназу, которая играет ключевую роль в созревании и поддержании стабильности ФК. Для сигнальных путей от интегриновых рецепторов FAK выступает в качестве основного звена. Интегрин одним из первых белков рекрутирует FAK к ФК. При этом FAK содержит сайт связывания с талином, что делает возможным рекрутирование к месту формирования адгезии ещё одного из структурных белков ФК. Для молодых ФК это подтверждается экспериментально (Lawson et al., 2012). Другая важная составляющая действия FAK в клетке – регуляция взаимодействия ФК с актином. В живых клетках FAK и актин колокализованы, на фиксированных препаратах клеток эндотелия было показано формирование FAK-бляшек вокруг концов стресс-фибрилл на ведущем крае клетки (Hu et al., 2014). FAK обладает способностью фосфорилировать и привлекать к ФК многие белки, в том числе паксилин (Smith et al., 2013). Количество FAK в месте адгезии тем выше, чем выше там количество фосфорилированного паксилина, что говорит о наличии положительной обратной связи (Zaidel-Bar et al., 2007). Однако, в отличие от паксилина, FAK обладает активностью лишь на ведущем крае клетки. Известно, что нокдаун по генам, кодирующим FAK, приводит к снижению подвижности клеток, за счет увеличения числа зрелых фокальных адгезий по периферии клетки в линии эмбриональных стволовых клеток (Ilic et al., 1995). В втором случае RhoA регулирует динамику ФК через контроль внутреннего натяжения, который осуществляется как со стороны актина, так и со стороны миозина. Действие RhoA на актин осуществляется в зоне растущей ламеллы, где RhoA выступает как фактор, стимулирующий его полимеризацию в ответ на активацию FAK, и обеспечивающий ассоциацию молодых контактов со стресс-фибриллами. Полимеризация актина находится под контролем прямой мишени RhoA - формина mDia1. Их непосредственное взаимодействие было показано в экспериментах с инкубацией клеток с С3 трансферазой. С3 ингибирует RhoA, лишая клетки возможности формировать новые ФК. Введение в такие клетки конститутивно активного мутанта mDia1 снимает блок формирования фокальных адгезий. В клетках возобновляется миграция. Основная роль mDia1 в сборке ФК заключается в запуске полимеризации актина на переднем крае растущей стресс-фибриллы (Zigmond et al., 2004). Механизм выглядит следующим образом: «упираясь» в границу ведущего края клетки, фибрилла перетягивает мембрану на нижнюю сторону, предоставляя новую область, доступную для формирования новых адгезий. Однажды связавшись с мономером актина, mDia1 остается связанным с растущим концом фибриллы и стремится к связыванию новых мономеров, цикл повторяется. Помимо полимеризации актина, RhoA способна индуцировать также его деполимеризацию через Rho-ассоциированную киназу (Rho assosiated kinase, ROCK) и её мишень - LIM киназу. Интересно, что фосфорилирование миозина, необходимое для его взаимодействия с актином и развития контрактильного ответа клетки, осуществляется той же киназой ROCK. При этом ROCK может непосредственно фосфорилировать легкие цепи миозина по Ser19, или сохранять их фосфорилированное состояние через ингибирование фосфатазы миозина, действуя на ее MYPT субъединицу (Amano et al., 1996). Показано, что в ответ на ингибирование киназы ROCK Y-27632 клетки аденокарциномы простаты PC3 не теряли способности к направленному движению, но оставляли за собой длинные «хвосты», сохраняющие прочную связь с субстратом (Vega et al., 2011). Для фибробластов результат ингибирования ROCK при инкубации с Y-27632 выражается в формирования клетками острых, быстро убегающих вперёд филоподий, оканчивающихся ФК, при этом ФК в теле, где исчезает фосфорилированный миозин, не встречаются (Totsukawa et al., 2004). Общий эффект инкубации клеток с Y-27632 выражается в том, что клетки приобретают характерную звездчатую форму. Наиболее распространенным и общепринятым на сегодняшний день является мнение о стабилизирующем эффекте работы ROCK в клетках. Такую формулировку можно уточнить, поясняя «стабилизацию» как нормальное течение последовательно сменяющих друг друга стадий клеточного движения: контролируемая полимеризация актина, перетягивание мембраны на нижнюю сторону клетки, формирование новых ФК, параллельно идущая сборка стресс-фибрилл, осуществление актин-миозиного взаимодействия, подтягивание тела клетки вслед за убегающим вперед ведущим краем. Однако стоит отметить, что зоной активности ROCK считается тело клетки, хотя фосфорилированный миозин также встречается и на ведущем клеточном крае (Matsumura et al., 1998). Это говорит о существовании комплексной системы регуляции миозина в разных зонах клетки. За фосфорилирование легкой цепи миозина по тому же положению Ser19 на периферии клетки отвечает MLCK киназа (Kassianidou, 2017). И ROCK, и MLCK обеспечивают фосфорилирование миозина, поддержание контрактильности клеток и их нормальной миграции, однако эффект, сопровождающий искусственное снижение активности MLCK, прямо противоположен эффекту специфического ингибирования ROCK. При ингибировании MLCK происходит снижение количества фосфорилированного миозина на периферии клетки, содержащие винкулин ФК в этой зоне исчезают, в то время как ФК в теле клетки увеличиваются в размерах. Сами клетки становятся заметно более распластанными. Широкие протрузии формируются более спонтанно, они растягивают клетки одновременно в разные стороны. В совокупности это приводит к снижению эффективности миграции фибробластов и даже к изменению характера движения клеток. Клеточный край утрачивает свою неровность, становится гладким. Регистрируемые на кимограммах незначительные изменения плотности мембраны говорят, что она не активна, и рост протрузий не происходит (Totsukawa et al., 2004). В более поздних работах на клетках MEF (Pasapera et al., 2010) описывается исчезновение ФК на периферии клетки под действием ингибитора ROCK киназы Y-27632. При этом общее ингибирование миозина II блеббистатином приводит к уменьшению размера ФК в теле клеток. В этой же статье утверждается, что изменение размера контактов и их локализации можно описывать только для ФК, меченых винкулином, и именно этот белок (его количество и локализация в области ФК) наиболее зависит от активации миозина II. Таким образом, схему каскада регуляции динамики ФК можно представить следующим образом: приведенные в активное состояние малые ГТФазы Rac и RhoA действуют на динамику ФК двунаправленно - напрямую на рециклирование белкового комплекса ФК, например, за счет изменения текучести мембраны (FAK, Src), или через управление актомиозиновым сокращением, причём, как со стороны как актина, так и со стороны миозина (ROCK). Регуляция миозина осуществляется не только эффекторами, вовлеченными в каскад, идущий от малой ГТФазы RhoA, но также и автономными киназами (MLCK). Вероятно, разнообразие и противоречивость эффектов, наблюдаемых при ингибировании киназ, указывает на то, что регуляторная функция каскада миозина II в динамике ФК в действительности может быть более сложной и более комплексной, чем это известно на сегодняшний день. Цель исследования: анализ роли компонентов цитоскелета и регулирующих его факторов в пространственно-временной организации подвижных клеток во время прикрепления, распластывания, поляризации и движения. При реализации исследования были поставлены следующие задачи: 1. Описать поведение фокальных контактов в условиях подавления динамической нестабильности микротрубочек 2. Описать динамические параметры микротрубочек нецентросомального происхождения в клетках с мезенхимальным типом подвижности 3. Проанализировать роль динамики микротрубочек на различных этапах распластывания фибробластов 4. Описать взаимодействие систем актинового цитоскелета и фокальных контактов в клетках с мезенхимальным типом подвижности, проанализировать регуляцию этих взаимодействий через сигнальные каскады фосфорилирования легкой цепи миозина II. 5. Исследовать влияние киназ, регулирующих фосфорилирование миозина II на динамику ФК в опухолевых клетках Основная часть Этап 1 Для решения задачи 1 моделью в настоящем исследовании послужили распластывающиеся фибробласты 3Т3, в которых были визуализированы фокальные контакты при помощи флуоресцентно меченого белка винкулина. Для подавления динамической нестабильности плюс-концов микротрубочек использовали раствор 100нМ нокодазола и 50 нМ таксола. Для описания динамики фокальных контактов были выбраны такие их параметры, как площадь, время существования и средняя интенсивность флуоресценции. Для анализа фокальных контактов в контрольной группе было исследовано 45 контактов в клетках, трансфецированных плазмидой, кодирующей белок фокальных контактов винкулин, конъюгированный с красным флуоресцентным белком RFP. Видеонаблюдения производились в течение 60 минут от начала распластывания, с интервалом между кадрами в 1 минуту. В процессе распластывания клеток подавляющее большинство фокальных контактов появлялись и исчезали в области ламеллы на расстоянии не больше 5 мкм от края клетки. За момент возникновения контакта был принят первый кадр, где интенсивность флуоресценции контакта превышала фон. Моментом исчезновения считался последний кадр, в котором интенсивность контакта все еще отличалась от фона. Статистическую значимость различий между группами описывали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, для множественных сравнений использовали критерий Краскела- Уоллиса, уровень значимости критериев был равен 0.05. В контрольных клетках в момент возникновения на краю клетки контакт имеет среднюю площадь 1.15±0.12мкм2. Во время роста максимальная площадь, достигаемая контактами на краю распластывающихся фибробластов, варьирует от 0.65 до 8.11 мкм2, средняя максимальная площадь составила 2.59±0.25мкм2. Площадь контакта в момент исчезновения составляет 0.69±0.06мкм2. Таким образом, площадь, на которой контакт визуализируется в момент возникновения, в среднем в 1,7 раз больше площади в момент исчезновения контакта (р=0.0065). Для дальнейшего анализа контакты разделили на 2 группы по максимальной площади, согласно классификации, принятой в литературе (Zamir, Geiger, 2001). К первой группе были отнесены мелкие контакты, площадь которых составляет менее 3 мкм2 (33 из 45), вторая группа – крупные контакты с площадью 3 и больше мкм2. Мелкие контакты возникают со средней площадью 0.85±0.09 мкм2, достигают максимальной площади в 1.74±0.12 мкм2, и площадь в момент исчезновения составляет 0.55±0.04 мкм2. Крупные контакты возникают со средней площадью 1.97±0.30 мкм2, их максимальная площадь составляет 4.91±0.44 мкм2, площадь в момент исчезновения – 1.09±0.12 мкм2. В момент появления площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 2.3 раза (различие достоверно - р=0.0006). В момент исчезновения площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 2 раза, (различие достоверно, р<0.0001). Таким образом, за время жизни ФК увеличивают свою площадь в 2-2.5 раза. Как в начальной точке, так и в точке с максимальной площадью существуют группы мелких и крупных фокальных контактов. Такое разделение на две группы было принято за основу для дальнейшего анализа. Средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) отражает плотность молекул белка в фокальном контакте. СИФ мелких контактов в момент возникновения – 1.80±0.24 ед.фл./мкм2, в момент времени, когда они достигают максимальной площади – 0.84±0.07ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 2.33±0.19 ед.фл./мкм2, СИФ крупных контактов в момент возникновения – 0.78±0.18 ед.фл./мкм2, в точке с максимальной площадью – 0.27±0.03 ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 1.18±0.17 ед.фл./мкм2, при этом СИФ крупных контактов в момент их появления меньше в 1.5 раза, чем в момент исчезновения и больше, чем в точке с максимальной площадью в 2.9 раз. СИФ мелких контактов больше, чем СИФ крупных контактов в момент появления в 2.1 раза, в точке с максимальной площадью – в 3.1 раза, в момент исчезновения – в 2 раза, кроме того, для любой группы контактов минимальная СИФ коррелирует со временем стабильного существования контакта. В условиях стабилизации микротрубочек площадь как крупных, так и мелких контактов статистически не отличается от контрольных значений. В момент возникновения контакт имеет среднюю площадь 0.88±0.09 мкм2. Средняя максимальная площадь ФК составляет в клетках со стабилизированными МТ составляет 1.71 ±0.12 мкм2. Средняя площадь в момент исчезновения контакта составила 0.62±0.07мкм2. Так же, как и в случае контрольных клеток, мы разделили контакты на 2 группы, причем соотношение количества крупных и мелких контактов статистически не отличалось от контроля. Мелкие контакты возникают со средней площадью 0.76±0.07 мкм2, максимальная площадь их составляет 1.59±0.15 мкм2, площадь в момент исчезновения – 0.50±0.03 мкм2. Крупные контакты возникают со средней площадью 1.43±0.33 мкм2, максимальная площадь составляет 5.08±0.82 мкм2, площадь в момент исчезновения – 1.18±0.27 мкм2. В момент появления площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 1.9 раза (р=0.0006). В момент исчезновения площадь крупных контактов больше площади мелких контактов в 2.3 раза (р<0.0001). В условиях стабилизации микротрубочек СИФ мелких контактов в момент возникновения составляет 1.77±0.14 ед.фл./мкм2, в точке с максимальной площадью – 0.97±0.09 ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 2,46±0,18 ед.фл./мкм2, СИФ в момент возникновения меньше, чем в момент исчезновения в 1.4 раза. СИФ крупных контактов в момент возникновения составляет 0.99±0.20 ед.фл./мкм2, максимальная – 0.28±0.04 ед.фл./мкм2, в момент исчезновения – 1.35±0.33 ед.фл./мкм2, при этом СИФ крупных контактов в момент появления и в момент исчезновения статистически не отличается. Таким образом, при стабилизации микротрубочек крупные контакты, так же, как и в контроле, появляются и исчезают с изначально большей площадью, чем мелкие, при этом площадь крупных контактов растет и уменьшается быстрее, чем площадь мелких. В крупных контактах содержится больше флуоресцентного белка (винкулина), чем в мелких, как в момент появления, так и в когда контакт достигает максимальной площади, и в момент исчезновения. Кроме того, в крупных контактах концентрация флуоресцентного белка на единицу площади меньше, чем в мелких контактах, как в момент появления, так и в момент достижения максимальной площади, и в момент исчезновения. Единственный параметр, по которому отличаются контрольная и опытная выборки – продолжительность стадии стабильного существования ФК. В нормальных распластывающихся клетках фокальные контакты, визуализированные при помощи винкулина, возникают на границе ламеллиподия-ламелла и существуют в среднем 15.27±1.06 минут, а под воздействием нокодазола и таксола в концентрациях, стабилизирующих микротрубочки, время жизни винкулиновых контактов возрастает до 21.07±1.71 минут. Таким образом, на данном этапе работы стало возможным сделать следующие выводы: 1) площадь и яркость контакта в момент его возникновения всегда больше, чем в момент исчезновения; 2) площадь и яркость контакта растет с той же скоростью, что и уменьшается 3) скорость сборки и разборки крупных контактов всегда выше, чем мелких ФК 4) общее количество винкулина в крупных ФК всегда больше чем в мелких ФК, однако, в мелких ФК плотность винкулина всегда выше, чем в крупных ФК 5) при подавлении динамической нестабильности микротрубочек увеличивается время жизни ФК. Этап 2 Для решения задачи 2 мы описали поведение микротрубочек (МТ) нецентросомального происхождения, поведение которых обусловлено особенностями локальных участков цитоплазмы. Анализ параметров роста центросомальных МТ В первой части работы мы проанализировали 4800 треков плюс-концов микротрубочек в 89 фибробластах 3Т3 с постоянной экспрессией плюс-концевого белка МТ EB3, конъюгированного с флуоресцентным белком EB3. Средняя длина трека составила 5.7±5.5 мкм (диапазон от 1.2 до 59.1 мкм), средняя продолжительность роста для всех треков составила 17.3±16.1 с (диапазон от 6 до 72 с), скорость роста составила 21.5±19 мкм/мин (диапазон от 3.3 до 29.5 мкм/мин). Из 4800 МТ только 158 росли более 40 с, и только для 169 длина трека составила более 10 мкм, что значительно меньше радиуса клетки. Основное количество таких клеток начиналось в цитоплазме или у края клетки, но не у центросомы. Согласно предыдущим исследованиям, нецентросомальные МТ в цитоплазме могут быть разделены на МТ внутренней зоны цитоплазмы (рост которых начинается на расстоянии не менее 5 мкм от центросомы) и МТ на краю клетки (рост которых начинается на расстоянии не более 2 мкм от края клетки). Отдельно мы проанализировали треки МТ, идущие от центросомы. В клетках с постоянной экспрессией EB3-RFP центросома может быть определена как яркий кластер комет в центре клетки, диаметром порядка 1.5 мкм в объеме (расчёт по четырем последовательным оптическим срезам). Интегральная яркость в этой области составила 7.3±3.4 одиночных комет (по сравнению с 2.6±1.2 комет для области такого же размера в цитоплазме). Для объемной реконструкции были отсняты 124 z-стека с инкрементом в 0.5 мкм по оси z. Анализ таких z-стеков показал, что центросома в активном состоянии присутствовала лишь в 68 клетках из 124, тогда как в 56 она не функционировала как ЦОМТ. Клетки с активной и неактивной центросомой не отличались по своей площади и форме. В клетках с активной центросомой было описано 1560 МТ центросомального происхождения. Средняя длина треков таких МТ составила 5.3±2.7 мкм. Из 1560 МТ только 562 росли в течение более 12 с, 74 МТ продолжали расти в течение 15-40 с, и только для 5 МТ продолжительность периодов роста составила более 40 с. Для треков длиной более 1 мкм скорость роста составила 18.0±7.0 мкм в минуту. Анализ MIP (проекций по максимальной интенсивности) показал, что от центросомы до края клетки растет очень небольшое количество МТ, таким образом, большинство МТ, растущих от центросомы, не достигает края клетки. Описание основных субпопуляций МТ нецентросомального происхождения Продолжительность периодов роста для свободных МТ, растущих около края клетки, составила 22.6±1.3с, средняя длина треков составила 6.9±0.1 мкм, а средняя скорость роста составила 24.7±1.3 мкм/мин. Для свободных МТ во внутренней цитоплазме все характеристики распределений статистически не отличались от МТ, растущих у края клетки. Так, для таких МТ средняя длина трека составила 6.2±0.1 мкм, средняя продолжительность периодов роста составила 15.8±0.3 с, скорость роста составила 23.9±0.6 мкм/мин. Для анализа пространственного распределения нецентросомальных МТ мы также построили проекции по максимальной интенсивности. Треки таких МТ либо росли прямо, либо слегка изгибались, причем большинство изогнутых МТ располагались вблизи края клетки. Качественный анализ таких изображений показал, что наибольшая плотность растущих МТ наблюдается около краев клетки, где происходит постоянное выдвижение и ретракция ламеллы. Такой край мы называли «активным» с точки зрения количества растущих МТ и общей организации ламеллы. Для оценки количества МТ, растущих в разных зонах клетки, мы измерили плотность распределения плюс-концов для 300 комет в 7 клетках с постоянной экспрессией EB3-RFP. Для этого на кадрах были выделены одинаковые площади около центросомы (на расстоянии 2-4 мкм, не включая яркий кластер комет в самой центросоме), во внутренней цитоплазме, на активном крае клетки и на ее стабильном крае. Распределение плюс-концов комет оказалось неравномерным для активного и стабильного края. Наибольшая плотность плюс-концов наблюдалась на активном крае клетки (на расстоянии не более 2 мкм от плазматической мембраны) - 0.37±0.05 комет на 1 мкм2, что статистически не отличалось от значения плотности комет вблизи центросомы. Вблизи стабильного края клетки плотность комет значительно уменьшилась и составила (0.17±0.05 комет на площадь в 1 мкм2). Плотность комет остается примерно одинаковой на расстоянии до 20 мкм от центра клетки, после чего начинает линейно возрастать в направлении края клетки. Таким образом, центросомальные МТ составляют небольшую часть всех МТ цитоплазмы, поэтому на следующем этапе работы была выдвинута гипотеза о существовании цитоплазматических кластеров роста МТ. Для того чтобы обнаружить такие кластеры, цитоплазма каждой клетки была поделена на зоны диаметром 2 мкм. Для последующего анализа были выбраны зоны, соответствующие следующим критериям: 1) в этих зона присутствовали изгибающиеся МТ и 2) число треков, начинающихся в таких зонах, было больше, чем в среднем в цитоплазме (3 и более событий в минуту). В результате мы обнаружили 113 таких зон в 89 клетках. Среднее число МТ, начинающих свой рост в таких зонах, составило 6.2±0.9 событий в минуту, что в 3 раза больше, чем в среднем по цитоплазме (2.0±0.7 событий в минуту на такой же площади). В предыдущих исследованиях на эпителиальных клетках было показано, что такие цитоплазматические кластеры роста МТ могут быть ассоциированы с аппаратом Гольджи. Окраска клеток антителами к белку K58 (специфическому компоненту аппарата Гольджи) показала, что в фибробластах 3Т3 он локализован преимущественно в перинуклеарной области, ориентирован по направлению к ведущему краю клетки и имеет средний размер 6.3±2.0 мкм2 (N=10), тогда как цитоплазматические кластеры роста МТ располагались преимущественно около края клетки (на расстоянии 5.6±2.5 мкм от плазматической мембраны) и имели размер не более 2 мкм2. Таким образом, в фибробластах кластеры роста цитоплазматических МТ не совпадают с аппаратом Гольджи. Цитоплазматические кластеры роста МТ были найдены в клетках как с активной, так и с неактивной центросомой. Количество таких кластеров на клетку варьировало от 1 до 3 (1 кластер был найден в 41 клетке, 2 кластера - в 21 клетке и 3 кластера в 10 клетках), то есть каждая клетка содержала хотя бы один такой кластер. Клетки с одним и двумя цитоплазматическими кластерами роста МТ не отличались друг от друга по площади и параметрам формы. Параметры роста МТ (скорость роста и продолжительность фазы роста) в клетках с одним кластером были немного выше по сравнению с динамическими параметрами МТ для клеток с двумя кластерами. Для выяснения роли цитоплазматических нецентросомальных МТ в организации системы МТ в фибробластах 3Т3, в таких клетках была отслежена пространственная организация сети МТ в процессе восстановления после их полной деполимеризации. Для этого клетки 3Т3, трансфецированные плазмидой, кодирующей GFP-тубулин, в течение 1 часа инкубировали в присутствии высоких дозами нокодазола (4 мкМ), после чего отмывали ингибитор, и фиксировали клетки через 1 минуту в течение первых 5 минут, и затем через 1 час после отмывки от ингибитора. В клетках, трансфецированных GFP- тубулином, МТ начинали расти во всех зонах цитоплазмы через 2 минуты после удаления нокодазола. В таких клетках были отчетливо видны кластеры коротких радиально растущих МТ. Эти кластеры локализовались преимущественно около ядра и представляли собой активную центросому (в 270 клетках из 350). В остальных 80 клетках рост МТ начинался диффузно во всех зонах цитоплазмы. Для того чтобы более детально охарактеризовать динамику роста МТ после отмывки от нокодазола, были отсняты фильмы для 30 клеток со стабильной экспрессией EB3-RFP с теми же условиями эксперимента. В присутствии нокодазола в цитоплазме клеток полностью отсутствовали кометы, однако в некоторых клетках по-прежнему присутствовала активная центросома, визуализируемая как яркий кластер комет в центре клетки. Яркость такого кластера составила 3.9±0.4 EB3-RFP комет (по сравнению с 7.3±3.4 в контроле). Первые кометы появились в цитоплазме клеток через 2 минуты после удаления нокодазола. Хотя активная центросома присутствовала в 28 из 30 отснятых клеток, основная масса МТ начинала расти от нецентросомальных кластеров роста в цитоплазме клетки, причем рост происходил преимущественно вдоль краев клетки. Частота событий роста новых МТ в первые минуты после удаления нокодазола составила 421±114 событий в минуту, что в 1.5 раза меньше, чем в контроле. Через час после удаления нокодазола частота событий роста новых МТ приблизилась к нормальным значениям и составила 674±174 событий в минуту. Продолжительность периодов роста МТ также возросла с 11.3±3.2 с через 5 минут до 15.0±5.2 с через час после удаления нокодазола. Проверка гипотезы о регуляции фокальных контактов динамичными микротрубочками в клетках с мезенхимальным типом подвижности Для 520 контактов в 22 клетках были измерены следующие характеристики: время жизни, площадь, и интегральная интенсивность флуоресценции (характеристика, отражающее общее количество маркерного белка в ФК). В контрольных клетках среднее время жизни ФК составило 27.5±8.5 минут, из которых 19.3±3.9 минуты составила стадия стабильного существования контакта. Средняя площадь ФК составила 2.2±0.6 мкм2. Средняя интегральная интенсивность флуоресценции в стабильных ФК (измеренная в кадре с максимальной площадью ФК) составила 2.14±0.15 ед.фл./мкм2. Для оценки влияния динамичных МТ на параметры ФК была выведена линия фибробластов 3Т3 со сниженной экспрессией EB3 в результате нокдауна гена EB3 с помощью shРНК. Методами ПЦР в реальном времени и вестерн-блотинга было показано, что уровень экспрессии мРНК и белка EB3 в таких клетках снижен как минимум на два порядка. Динамика и морфология ФК в клетках 3Т3 со сниженной экспрессией белка EB3 (всего проанализировано 152 контакта в 10 клетках) отличается от контроля. После нокдауна ЕВ-3 ФК локализуются в околоядерной области, а клетки практически не формируют ламеллоподий. Средняя площадь ФК в таких клетках была в 1.5 раза больше, чем в контроле, и составила 3.7±0.8 мкм2. Среднее время жизни таких контактов увеличилось по сравнению с контролем и составило 36.0±12.8 минут. В то же время значения интегральной интенсивности ФК в клетках со сниженной экспрессией EB3 статистически не отличались от контроля. Таким образом, на данном этапе работы стало возможно сделать следующие выводы: 1) Центросома как ЦОМТ неактивна примерно в 50% популяции фибробластов 3Т3. 2) В интерфазных фибробластах центросома формирует относительно короткие МТ, вклад которых в общую организацию сети МТ в цитоплазме невелик (не более 5%). 3) Микротрубочки нецентросомальнго происхождения растут в основном вдоль краев клетки, причем плотность растущих плюс-концов МТ максимальна на активном крае клетки. 4) Нецентросомальные МТ могут расти от цитоплазматических локусов роста, находящихся на расстоянии не более чем 5 мкм от края клетки 5) Рост МТ de novo при восстановлении сети интерфазных МТ начинается одновременно на центросоме и в нескольких зонах цитоплазмы клетки. 6) В клетках с подавленной экспрессией плюс-концевого белка МТ EB3 повышается среднее время жизни и площадь фокальных контактов, кроме того, значительное количество ФК начинает локализоваться в теле клетки. Этап 3 Для решения задачи 3 были исследованы нарушения морфологии и динамики распластывания клеток при стабилизации и деполимеризации микротрубочек в эмбриональных фибробластах мыши (клетки MEF). Морфология и кинетика распластывания клеток MEF (мышиные эмбриональные фибробласты) на стекле была сходной с таковой для фибробластов Vero (описана в Творогова, Воробьев, 2012). Как и в случае фибробластов Vero, клетки прикреплялись к субстрату и начинали формировать ламеллу в течение 10.2±2.8 минут после прикрепления. От момента прикрепления и до начала выдвижения ламеллы клетки формировали маленькие быстро исчезающие блебсы. После этого начиналась фаза быстрого распластывания, которое происходило изотропно (с выдвижением ровной округлой ламеллы по периметру большей части клетки) или анизотропно (с выдвижением нескольких неровных ламелл). Во время фазы быстрого распластывания за первые 10 минут площадь клеток MEF увеличилась в 3.15±0.48 раз (по сравнению с 4.46±0.44 раз для клеток Vero). Скорость распластывания в первые 10 минут составила 146.1±2.9 мкм2/мин, за следующие 10 минут упала в 5 раз, и к концу 20-й минуты суммарное увеличение площади для клеток MEF составило 3.88±0.51 раза (по сравнению с 5.07±0.44 раз для клеток Vero). После 20 минут распластывание резко замедлялось, и клетки приобретали неправильную форму. Средняя скорость распластывания в период с 21 по 60 минуту составила 8.29±1.49 мкм2/мин, и к концу первого часа клетки увеличили свою площадь в 4.88±0.57 раз относительно начальных значений. К концу первого часа распластывания все клетки сформировали стабильные края, и некоторые начали движение по субстрату. Фаза медленного распластывания продолжалась в течение трех часов, и к концу третьего часа средний коэффициент увеличения площади для клеток MEF составил 6.35±0.53 раза При полной деполимеризации микротрубочек (МТ) в присутствии 4 мкМ нокодазола клетки оставались округлыми и не формировали ламелл в течение длительного времени с момента прикрепления (среднее время для клеток MEF составило 72±48 минут). В течение этого времени в клетках происходил интенсивный блеббинг без образования ламеллиподий. Некоторые клетки не смогли начать распластывание в течение всех 6 часов наблюдения. Распластывание начиналось с формирования маленькой ламеллы, однако блеббинг не прекращался и продолжался в течение 1-3 часа после начала распластывания. Распластывание клеток с деполимеризованными МТ всегда происходило анизотропно, и в некоторых случаях было обратимым (все образовавшиеся ламеллы втягивались, и клетка вновь приобретала округлую форму). В течение первых 10 минут среднее увеличение площади составило 2.08±0.09 раза. К концу первого часа клетки увеличили площадь в 2.61±0.19 раза, и к концу третьего часа площадь клеток MEF с деполимеризованными МТ увеличилась в 3.84±0.13 раза относительно начальных значений (что в среднем в два раза ниже, чем в контроле). Клетки с деполимеризованными МТ оставались неполяризованными даже через три часа после начала распластывания и не приобретали вытянутую форму (фактор элонгации EF через 3 часа составил 1.17±0.02 по сравнению с 1.64±0.10 для контрольных клеток). Таким образом, полная деполимеризация МТ приводит к удлинению фазы блеббинга, замедлению быстрой фазы распластывания, обратимости процесса распластывания и общему замедлению распластывания в часовой шкале времени. Учитывая, что часть наблюдаемых эффектов может быть связана не с исчезновением МТ, а с замедлением их динамики, мы оценили кинетику распластывания клеток MEF при частичном подавлении динамики МТ сочетанием низких доз нокодазола и таксола (100 нМ и 50 нМ соответственно). Как и в случае деполимеризованных МТ, в клетках после прикрепления образуются многочисленные блебсы, блеббинг клеток не прекращается в течение 1-3 часов после прикрепления. В случае частичного подавления динамики МТ распластывание клеток также происходит преимущественно анизотропно. В отличие от клеток с деполимеризованными МТ, клетки со стабилизированными МТ вытягивались к концу третьего часа (фактор элонгации составлял 1.68±0.03) и образовывали ламеллу, сходную по морфологии с ламеллой контрольных клеток. Клетки со стабилизированными МТ распластывались быстрее, чем клетки с деполимеризованными МТ, но медленнее, чем в контроле. Через 20 минут площадь клеток со стабилизированными МТ увеличилась в 2.64±0.23 раза, через час площадь клеток увеличилась в 3.45±0.26 раза, и через три часа клетки увеличили свою площадь в 4.29±0.36 раза относительно контрольных значений. В сумме подавление динамики МТ приводит к удлинению фазы блеббинга, замедлению быстрой фазы распластывания и замедлению распластывания в часовой шкале. Отличие в поведении клеток со стабилизированными МТ от клеток с деполимеризованными МТ заключается в морфологии ламеллы, величине блебсов и способности клеток к элонгации. Считается, что распластывание клеток в основном регулируется через сокращение актомиозинового комплекса, так как в процессе прикрепления и распластывания на субстрате клетки развивают значительное механическое усилие. Для изучения влияния актомиозинового сокращения на различные фазы распластывания мы использовали ингибиторы каскада фосфорилирования легкой цепи миозина II Y27632 (ингибирует Rho – ассоциированную киназу ROCK) и блеббистатин (ингибирует АТФ-азную активность миозина II). Влияние ингибиторов на процесс распластывания оценивали на клетках MEF и 3T3. Основное отличие от контроля при ингибировании миозина заключалось в отсутствии клеток с изотропным распластыванием. С самого начала распластывания клетки формировали длинные протрузии в нескольких направлениях, они приобретали изрезанные края и звездчатую форму с многочисленными удлинёнными протрузиями. Кинетика распластывания клеток в присутствии обоих ингибиторов миозина не отличалась от контроля в течение первых 20 минут после начала распластывания. После прикрепления фибробласты 3Т3 не образовывали блеббсов и начинали формировать ламеллу через 10.5±4.2 минут (Y-27632) или через 7.5±4.5 минут после прикрепления (блеббистатин). В течение первых 10 минут в присутствии блеббистатина клетки увеличили площадь в 3.89±0.34 раз, в конце первого часа площадь увеличилась в 6.39±0.24 раз, и через три часа после начала распластывания увеличение площади для клеток 3Т3 составило 6.47±0.28 относительно контрольных значений. В присутствии Y-27632 кинетика распластывания клеток 3Т3 была аналогичной. Эти значения чуть меньше, чем для контрольных клеток в целой популяции, но совпадают со значениями для кинетики анизотропно распластывающихся клеток. Скорость распластывания для клеток 3Т3 в присутствии блеббистатина в течение первых 10 минут составила 54.9±6.86 мкм2/мин, 7.10±1.63 мкм2/мин в интервале 21-60 минут и снизилась до 0.21±0.40 мкм2/мин в интервале 61-180 минут. В присутствии Y-27632 начальная скорость распластывания составила 39.04±4.94 мкм2/мин, что несколько ниже контрольных значений. В дальнейшем скорость распластывания фибробластов 3Т3 в присутствии Y-27632 снизилась до 5.97±0.84 мкм2/мин в интервале 21-60 минут и до 1.24±0.34 мкм2/мин в интервале от 61 до 180 минут. Кинетика распластывания фибробластов MEF в присутствии ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина была аналогична таковой для клеток 3Т3, и не отличалась от контрольных значений. Через 20 минут после начала распластывания клетки MEF увеличили площадь в 3.36±0.21 раза в присутствии блеббистатина (в 4.01±0.27 раза в присутствии Y-27632). Через 180 минут относительное увеличение площади клеток MEF в присутствии блеббистатина составило 5.42±0.24 и 5.72±0.45 в присутствии Y-27632. Таким образом, ингибирование фосфорилирования легкой цепи миозина II не приводит к замедлению распластывания фибробластов в часовой шкале, однако значительно меняет морфологию клеток. Далее мы предположили, что динамичные микротрубочки могут влиять на процесс распластывания через ингибирование каскада легкой цепи миозина. Тогда в клетках с нарушенной системой микротрубочек в присутствии ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина должна восстанавливаться кинетика процесса распластывания, близкая к контрольным клеткам. Для проверки этой гипотезы мы описали кинетику и морфологию процесса распластывания для клеток MEF и 3Т3 в присутствии ингибиторов МТ и ингибиторов фосфорилирования легкой цепи миозина. Добавление блебистатина к клеткам с деполимеризованными МТ не оказало эффекта на морфологию клеток, тогда как добавление Y-27632 привело к восстановлению формы клеток в часовой шкале. Через три часа после начала распластывания клетки с деполимеризованными МТ в присутствии блеббистатина оставались практически округлыми (EF=1.37±0.12), однако край клеток был сильно изрезан (значение циркулярности составило 0.34±0.19), тогда как в присутствии Y-27632 клетки с деполимеризованными МТ вытягивались (EF=1.64±0.22), а их край был практически ровным (значение циркулярности составило 0.62±0.19). И в том, и в другом случае в клетках не возникал блеббинг, а общая морфология клеток совпадала с морфологией клеток в присутствии только нокодазола: распластывание начиналось с формирования маленьких псевдоподий и формирования нескольких узких ламелл. В присутствии блеббистатина в клетках с деполимеризованными МТ восстанавливалась кинетика быстрой фазы распластывания: в первые 10 минут скорость распластывания составила 57.98±6.67 мкм2/мин, и снизилась до 2.43±1.29 мкм2/мин через 20 минут. Кинетика распластывания клеток с деполимеризованными МТ в присутствии Y-27632 была практически линейной: в первые 10 минут скорость распластывания составила 15.72±3.36 мкм2/мин (что, тем не менее, в два раза выше, чем в клетках в присутствии только нокодазола) и снизилась до 8.06±1.00 мкм2/мин через 20 минут. Клетки со стабилизированными МТ в присутствии ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина начинали распластывание с формирования нескольких длинных ламелл. Добавление блеббистатина к клеткам со стабилизированными МТ восстанавливало нормальную кинетику быстрой фазы распластывания: в течение первых 10 минут средняя скорость распластывания составила 56.54±7.62 мкм2/мин, в следующие 10 минут упала до 19.56±4.92 мкм2/мин, дальнейшее распластывание проходило так же, как и в контроле. Через 20 минут после прикрепления средняя площадь клеток увеличилась в 4.25±0.36 раз, через час она возросла в 5.53±0.33 раз, и в течение 3 часов площадь клеток увеличилась в 6.67±0.29 раз относительно начальных значений. Добавление Y-27632 к клеткам со стабилизированными МТ также восстанавливало кинетику быстрой фазы распластывания. В первые 10 минут средняя скорость распластывания составила 30.84±4.95 мкм2/мин, в следующие 10 минут она упала до 18.82±2.7 мкм2/мин, за этот отрезок относительная средняя площадь клеток увеличилась в 3.53±0.27 раз. В интервале 21-60 минут средняя скорость распластывания составила 8.47±1.22 мкм2/мин, и через час средняя площадь клеток увеличилась в 5.23±0.33 раз. Через час после прикрепления клеток скорость распластывания упала до 1.98±0.43 мкм2/мин, и через три часа средняя площадь клеток возросла в 6.39±0.28 раз по сравнению с начальными значениями. Те же эффекты мы наблюдали для клеток MEF со стабилизированными МТ в присутствии ингибиторов фосфорилирования миозина. Так же, как и для клеток 3Т3, добавление ингибиторов фосфорилирования миозина восстанавливало нормальную кинетику распластывания для клеток со стабилизированными МТ, и эффект восстановления кинетики распластывания был более выражен в случае блеббистатина, чем в случае применения Y-27632. Таким образом, мы показали, что добавление ингибиторов каскада фосфорилирования легкой цепи миозина к клеткам со стабилизированными МТ восстанавливает нормальную кинетику распластывания за счёт снижения активности актмиозинового аппарата клетки. Так как процесс распластывания в значительной мере зависит от баланса между протрузиями, создаваемыми клеткой за счет полимеризации актина, и ретракциями, индуцируемыми активностью миозина II, мы проанализировали отличия в организации сети актиновых филаментов в клетках 3Т3 с нормальной и разрушенной системой МТ на разных временных точках после начала распластывания. В клетках с изотропным распластыванием актиновые пучки не формировались в течение 10 минут после прикрепления. Через 10-20 минут после начала распластывания в некоторых клетках возникали тонкие пучки актиновых филаментов (актиновые арки), идущие параллельно краю клетки, а миозин был распределен равномерно по всей ламелле. В интервале 21-60 минут актиновые арки постепенно замещались толстыми пучками стресс-фибрилл. Через 60 минут после начала распластывания в клетках сформировались стресс-фибриллы с регулярно расположенными на них молекулами миозина. Стабилизация или деполимеризация МТ стимулировала образование толстых актиновых пучков и формирование стресс-фибрилл: через 20 минут после начала распластывания во всех клетках были сформированы толстые стресс-фибриллы с молекулами миозина, декорирующими актиновые филаменты. Однако во всех клетках отсутствовала сформированная ламелла. Через час после начала распластывания в клетках со стабилизированными МТ формировались короткие пучки актиновых филаментов по всему телу клетки, в клетках с деполимеризованными МТ практически исчезла сеть актиновых филаментов. На поздних стадиях распластывания (через три часа) в клетках с нарушенной системой МТ основная часть актиновых пучков находилась в теле клетке, тогда как в контрольных клетках пучки актина практически отсутствовали в теле клетки. Инкубация клеток с блеббистатином и Y-27632 препятствовала формированию толстых пучков актиновых филаментов и реорганизации актинового цитоскелета: через 20 минут после начала распластывания в клетках появлялось небольшое количество тонких актиновых пучков, через час и через три часа пучки актиновых филаментов сохранялись, однако не происходило формирования стресс-фибрилл. Учитывая, что ингибиторы каскада фосфорилирования легкой цепи миозина II восстанавливали кинетику распластывания в клетках со стабилизированными МТ, мы предположили, что динамичные МТ могут влиять на статус фосфорилирования легкой цепи миозина II (MLCII). Для проверки данного предположения мы окрасили антителами к MLCII фиксированные препараты клеток 3Т3 с нормальной системой МТ, со стабилизированными или деполимеризованноми МТ через 5 минут и через 20 минут после начала распластывания. Через 5 минут после начала распластывания в клетках с нарушенной системой МТ визуализировалось кольцо из молекул фосфорилированного миозина вблизи от края клетки, тогда как в контрольных клетках кластеры фосфорилированного миозина были локализованы диффузно по всему телу клетки. Таким образом, мы описали морфологию актиновых филаментов в клетках с нарушенной системой МТ в процессе распластывания, и показали, что динамичные МТ напрямую влияют на статус фосфорилирования легкой цепи миозина II, а значит, и на процесс актомиозинового сокращения на ранних стадиях распластывания. На основании результатов этапа стало возможным предложить следующую модель распластывания клеток: после начального прикрепления клетки сохраняют округлую форму и начинают формировать блеббсы вследствие активации актомиозинового сокращения в кортикальном слое цитоплазмы (фаза Р0). В конце этой фазы натяжение в кортикальном акто-миозиновом слое уменьшается, и начинается активная полимеризация актиновых филаментов для увеличения площади клетки на субстрате. В этот временной период динамические МТ вызывают релаксацию миозина, что в сочетании с полимеризацией кортикального актина приводит к быстрому росту площади клетки (фаза Р1). Через некоторое время происходит активация миозина II, приводит к началу медленной фазы распластывания (фаза Р2). Этап 4 Для решения задачи 4 клетки линии 3Т3 (эмбриональные фибробласты мыши) трансфецировали плазмидой, кодирующей ген белка винкулина, слитый с красным флуоресцентгным белком RFP и проводили цейтраферную съемку в течение 8 часов, интервал между кадарами составил 5 минут. На полученных последовательностях изображений анализировали морфологические и динамические параметры ФК (площадь и время жизни соответственно). Площадь фокальных контактов рассчитывалась автоматически в программе ImageJ после выделения контуров в ручном режиме. Статистическую обработку производили в программе GraphPad Prizm 5 по критерию Манна-Уитни. Большая часть фокальных контактов (порядка 80%) в клетках сосредоточена на периферии (не далее, чем 10 мкм от края плазматической мембраны). Для статичного кадра медиана количества ФК, существующих на краю клетки, равна 44 (32-56, N=10), тогда как в теле клетки она равна 4 (0-18, N=10). Формирование ФК в клетках 3Т3 происходит фронтом по краю активной ламеллы. Рост ФК происходит в направлении от клеточного края, при этом ФК приобретают продолговатую форму. В теле клетки формирование ФК носит спонтанный характер и является независимым от краевой подвижности клетки процессом, в теле чаще встречаются ФК округлой формы. Жизненный цикл всех ФК можно разделить на следующие стадии: стадия сборки (время, когда площадь контакта увеличивается), стадия стабильного существования (время, когда площадь контакта максимальна и практически не меняется) и стадия разборки (время, когда площадь контакта уменьшается). Медианная площадь ФК в клетках 3Т3 составляет 0.62 мкм2 (диапазон 0.07-5.2 мкм2, выборка 75 контактов в 5 клетках), медианное время жизни в контрольных клетках 3Т3 составило 33.5 минуты (диапазон 6-164 минуты, 60 контактов в 6 клетках) При инкубации клеток с 10 мкМ ингибитора киназы ROCK (Y-27632) увеличивается время жизни ФК. В присутствии Y-27632 медиана времени жизни ФК возрастает до 49 минут (диапазон 13-121 минуты, 50 контактов в 5 клетках), то есть контакты становятся более стабильными. В присутствии ингибитора киназы MLCK (10 мкМ ML-7) продолжительность времени жизни ФК также возрастает, в этом случае медиана составляет 59 минут (диапазон 18-271 минуты, 50 контактов в 5 клетках). Ингибирование фосфорилирования миозина приводило не только к увеличению времени жизни ФК, но и к уменьшению их площади. В условиях подавления активности киназы ROCK (10 мкМ Y-27632) медиана площади фокальных контактов в клетках 3Т3 уменьшается в 2 раза (до 0.31 мкм2 относительно контрольного значения 0.62 мкм2), различия статистически значимы (p<0.0001). В условиях ингибирования киназы MLCK медианная площадь фокальных контактов в фибробластах линии 3Т3 в присутствии 10 мкМ ML-7 составляет 0.26 мкм2 (диапазон 0.07-2.25 мкм2, N=287), различия от контроля также оказались статистически значимыми (p<0.0001). Кроме того, при инкубации клеток с ML-7 мы наблюдали появление большого количества ФК в теле клетки. Актомиозиновое сокращение и возникающее вследствие этого в клетке натяжение влияет на поведение ФК. Следовательно, можно предполагать, что ингибирование фосфорилирования миозина, приводящее к уменьшению этого натяжения, также будет влиять на поведение ФК. Мы проанализировали морфологию клеток и структуру актинового цитоскелета на фиксированных препаратах клеток, окрашенных фаллоидином через 30, 60 и 120 минут инкубации, качественный эффект для обоих ингибиторов миозина II наблюдался уже в первой контрольной точке (30 минут). Актиновый цитоскелет в контрольных клетках представлен сетью коротких актиновых фибрилл, распределенных как по периферии, так и в теле клетки, толстыми пучками стресс фибрилл и кортикальным актином, стабильные края содержат актиновые арки. В целом, удалось проследить градацию действия ингибиторов на структуры актинового цитоскелета: наиболее чувствительны к ингибированию миозина стресс фибриллы, после чего происходит разборка актина кортикальной зоны, затем в клетках разбираются тонкие пучки актиновых филаментов, наиболее устойчивы к действию ингибиторов оказываются актиновые арки на стабильных краях клетки. При инкубации с Y-27632 клетки приобретают характерную «звездчатую» форму. Площадь клеток сначала возрастает на 36% по сравнению с контрольными значениями (2838 мкм2 против 2083 мкм2), после чего наблюдается линейное снижение площади, занимаемой клеткой, и спустя 120 минут инкубации с ингибитором различие составляет 10% (2291 мкм2 против 2083 мкм2), однако различие статистически недостоверно (р>0.05). Фактор элонгации снижается до 1.61 (по сравнению с 1.78 в контроле). Сеть кортикальных фибрилл разрежена, стресс фибриллы полностью разбираются или, в единичных случаях, тонкие пучки сохраняются по периферии клетки (после часа инкубации даже тонкие стресс-фибриллы в клетках отсутствуют). На стабильных краях клетки сохраняются тонкие актиновые арки, заметно увеличение числа стабильных (вогнутых) краёв. Под действием ML-7 клетки сильнее распластываются и формируют широкую зону активной ламеллы. В течение первого часа инкубации площадь клеток относительно контроля возрастает на 60% (медиана 3310 мкм2 против 2083 мкм2 в контроле), после чего наблюдается незначительное снижение площади. Клетки становятся более округлыми (фактор элонгации снижается до 1.51 по сравнению с 1.78 в контроле). Изменения актинового цитоскелета в случае инкубации с ML-7 такие же, как при инкубации с Y-27632, однако разборка стресс-фибрилл наблюдается только после 2 часов инкубации (спустя полчаса инкубации стресс фибриллы сохраняются как в контрольных клетках). На данном этапе работы стало возможным сделать следующие выводы: • снижение количества фосфорилированного миозина как при ингибировании киназы MLCK, так и при ингибировании вышестоящей (upstream) киназы ROCK приводит к стабилизации фокальных контактов и их частичной разборке в клетках 3Т3. • в клетках 3Т3 частичное ингибирование миозина II при помощи ингибирования киназы ROCK приводит к значительной перестройке актинового цитоскелета и перераспределению миозина II. При этом 30-ти минутное ингибирование киназы MLCK через 30 минут к видимым изменениям не приводит. Этап 5 Для решения задачи 5 и изучения регуляции ФК в опухолевых клетках в качестве модельных клеточных линий были выбраны линия клеток остеосаркомы U2OS и линия А549 (аденокарценома базального эпителия лёгких). Анализировали площадь и среднюю интенсивность флуоресценции ФК в норме, при подавлении миозин II-фосфорилирущих киназ ROCK и MLCK. Ингибиторы вносили в процессе видеосъемки, одни и те же ФК анализировали до и после воздействия. Параметры ФК при ингибировании киназы ROCK в клетках U2OS Площадь ФК до воздействия 10 мкМ Y27632 составляет – 1.1мкм2 (0.2 – 9.06, n=231). При подавлении активности киназы ROCK уменьшается число ФК, площадь ФК также уменьшается в 2.4 раза до 0.45 мкм2 (0.13 – 1.21, n=59) (критерий Манна-Уитни, р<0.05). Средняя интенсивность флуоресценции ФК в клетках U2OS до воздействия 10 мкМ Y27632 составляет – 3085 усл.ед.фл. (304.7 – 10751, n=231). При ингибировании киназы ROCK яркость ФК сильно снижается и через 30 минут составляет – 1565 усл.ед.фл. (178.43.24 – 7413, n=197) (критерий Манна-Уитни, р<0.05). Параметры ФК при ингибировании киназы MLCK в клетках U2OS До воздействия 10 мкМ ML-7 медианная площадь ФК составляет 0.96 мкм2 (0.16 – 8.48, n=323). После 30 минут инкубации с ингибитором медианное значение площади составлет 1.1 мкм2 (0.2 – 10.25, n=265), что от контрольного отличается недостоверно. При 60 минутной инкубации с 10 мкМ ML-7 площадь ФК уменьшается до 0.75мкм2 (0.2 – 4.06, n=313) (различие достоверно, критерий Манна-Уитни, р<0.05) Средняя интенсивность флуоресценции ФК в клетках U2OS до воздействия составляет 4185 усл.ед.фл. (502.37 – 15468, n=323). После 30 минут инкубации с 10 мкМ ML-7 значение СИФ составляет – 3973 усл.ед.фл. (50.37 – 15468, n=265), что от контроля статистически не отличается. Однако, даже 60 минутное воздействие ингибитора киназы легких цепей миозина не приводит к снижению СИФ. Через 60 минут показатель СИФ – 4292 усл.ед.фл. (780.8 – 9645, n=313) Таким образом, релаксация актомиозинового сокращения как при ингибировании киназы ROCK, так и MLCK приводит к уменьшению числа и площади ФК в клетках U2OS, а также к снижению общего количества белка-маркера в ФК в случае ингибирования киназы ROCK. Параметры актинового цитоскелета при ингибировании киназ ROCK и MLCK в клетках U2OS В контрольных клетках остеосаркомы человека U2OS актиновые микрофиламенты образуют крупные вентральные фибриллы в теле клетки, тонкие дорзальные фибриллы, направленные перпендикулярно активному краю клетки и поперечные дуги, которые располагаются параллельно активному краю клетки. Фосфорилированный миозин II в виде кластеров ассоциирован со всеми структурами актинового цитоскелета. При частичном ингибировании миозина II, путем подавления активности киназы ROCK, поперечные дуги и дорзальные фибриллы разбираются. Остаются более тонкие по сравнению с контролем вентральные стресс фибриллы в теле клетки. Фосфорилированный миозин присутствует в клетках в небольшом количестве, однако диффузно распределен в цитоплазме. Несмотря на присутствие полимерного актина, фосфорилированный миозин с ним не связан. При частичном ингибировании миозина II путем подавления активности киназы MLCK поперечные дуги, дорзальные и вентральные фибриллы визуально от контроля не отличаются. Фосфорилированный миозин II образует кластеры, которые ассоциированы с полимерными структурами актина, что визуально не отличается от нормы. Таким образом, в клетках остеосаркомы U2OS при частичном ингибировании миозина II за счет подавления активности киназы ROCK наблюдается перестраивание актинового цитоскелета и фосфорилированной формы миозина II. Ингибирование MLCK через 30 минут к видимым изменениям не приводит. Параметры ФК в клетках культуры А549 Клетки культуры A549 (аденокарценома базального эпителия легких) в контроле хорошо распластаны, имеют неровный край и несколько разнонаправленных широких протрузий. Актиновый цитоскелет представлен сетью коротких актиновых фибрилл, распределенных как по периферии, так и в теле клетки, пучками стресс фибрилл и кортикальным актином. Основная часть ФК локализуется на периферии клетки на расстоянии 2-4 мкм от ведущего края. В теле клетки (на расстоянии более 10 мкм от ведущего края) ФК формируются гораздо реже. В 18 клетках суммарное число ФК на краю составило 391 по сравнению с 104 в теле клетки, среднее отношение числа ФК на краю и в теле клетки составило 4:1. Время жизни ФК на краю удалось рассчитать для двух маркерных белков ФК: винкулина (врменная трансфекция плазмидой, содержащей ген викулин-RFP) и талина (трансдукция бакуловирусом). Медианное время жизни для винкулиновых контактов в 10 клетках составило 50 минут (разброс 10-235 мин, N=100), для талиновых - 63 минуты (6-274 мин, N=100). Полученные данные демонстрируют общую динамику ФК для обоих белков, отсутствие цитотоксического эффекта вектора и, следовательно, правомерность использования обоих белков в качестве маркеров ФК. Медиана времени жизни для ФК в 10 клетках в теле составила 30 минут (10-200 мин, N=50). Медианная площадь для винкулиновых ФК в 10 клетках на краю составила 1.71 мкм2 (0.51-5.98, N=50), для талиновых 0.66 мкм2 (0.19-2.18, N=100). Для винкулиновых контактов в теле – 0.83 мкм2 (0.268 – 2.41, N=50). При этом формирование ФК в теле происходит «волнами», то есть популяция ФК контактов наблюдается на отдельных кадрах, но ее существование не стабильно на протяжении всего времени съемки. Параметры ФК и актинового цитоскелета при ингибировании киназ ROCK и MLCK в клетках A549 Для клеток культуры A549 был проведен следующий вариант ингибиторного анализа: Y-27632 в концентрации 10 мкМ использовали качестве ингибитора ROCK, и ML-7 в концентрации 10 мкМ использовали в качестве ингибитора MLCK. Анализ фиксированных препаратов проводили после инкубации клеток в среде с ингибитором на протяжении 30, 60 и 120 минут. Качественный эффект наблюдался уже в первой временной точке. Действие Y-27632 проявляется в приобретении клетками характерной «звездчатой» формы и релаксацией актинового цитоскелета. Сеть кортикальных фибрилл разрежена, стресс фибриллы полностью разбираются или, в единичных случаях, тонкие пучки сохраняются по периферии клетки (после часа инкубации даже тонкие стресс-фибриллы в клетках отсутствуют). На стабильных краях клетки сохраняются тонкие актиновые арки. Под действием ML-7 клетки сильнее распластаны и формируют одну широкую зону активной ламеллы. На актиновый цитоскелет ML-7 влияет аналогично Y-27632, однако полная разборка стресс-фибрилл происходит только после 2 часов инкубации. Фокальные контакты в теле клеток под Y-27632 не формируются, на краю ФК становятся более стабильными по сравнению с контролем. Медианное время жизни составило 72.5 минут (15-180 мин, N=50). Медианная площадь – 1.21 мкм2 (0.5 – 2.62, N=50). Эффект ML-7 также проявлялся в увеличении времени жизни и уменьшении площади ФК, причем, как на краю, так и в теле клетки (в отличие от эффекта Y-27632, ФК в теле клеток при инкубации в среде с ML-7 формируются). Медианное время жизни составило 70 минут (15-270, N=50) для ФК на краю и 35 минут (4-140, N=50) - в теле клетки. Медианы для площадей составили 1.26 мкм2 (0.37-2.6, N=50) и 0.71 мкм2 (0.198-1.16, N=50) соответственно. Таким образом, при ингибировании как киназы ROCK, так и киназы MLCK ФК на краю клетки становятся меньше и содержат меньше маркерного белка, но живут дольше, чем в контроле. При этом в теле клетки эффект ингибирования киназ отличается: в случае ингибирования ROCK контакты в теле клетки исчезают вовсе, а в случае ингибирования киназы MLCK время жизни фокальных контактов не изменяется, а площадь и интегральная интенсивность флуоресценции меняется незначительно. По результатам этапа стало возможным сделать следующие выводы: • При использовании в качестве маркеров ФК различных белков (талина и винкулина) у ФК достоверно отличаются медианы площади и времени жизни, то есть параметры ФК зависят от выбора маркерного белка. • При ингибировании киназы ROCK в клетках А549 и клетках U2OS на краю клетки происходит увеличение времени жизни ФК, при этом уменьшается их площадь и интегральная интенсивность флуоресценции, а ФК в теле клетки исчезают. • При ингибировании киназы MLCK на краю клетки возрастает время жизни ФК, при этом снижается их интегральная интенсивность флуоресценции, а площадь ФК значимо не изменяется, при этом в теле клетки ФК уменьшаются, но не исчезают, для обоих клеточных линий • в клетках остеосаркомы U2OS при частичном ингибировании миозина II за счет подавления активности киназы ROCK наблюдается перестраивание актинового цитоскелета и фосфорилированной формы миозина II. Ингибирование MLCK через 30 минут к видимым изменениям не приводит. Заключение В данной работе были исследованы динамические и морфологические параметры ФК в клетках мезенхимального происхождения – фибробластах 3Т3 и клетках остеосаркомы U2OS , и клетках аденокарциномы А549 при ингибировании миозина путем подавления миозин II –фосфорилирующих киназ ROCK и MLCK. Ингибирование как киназы ROCK, так и MLCK в клетках 3Т3 приводит к уменьшению числа клеточных контактов на краю клетки, но не отражается на времени жизни. Можно предположить, что при ингибировании киназы ROCK за фосфорилирование легких цепей миозина отвечает MLCK, в следствие чего генерируется акто-миозиновое сокращение и динамика ФК не нарушается. И, наоборот, при ингибировании киназы MLCK работа актомиозинового комплекса и созревание ФК происходит за счет активности киназы ROCK. При этом, в клетках U2OS время жизни паксилиновых ФК при ингибировании киназы ROCK уменьшается (Stricker et. al., 2019). Созревание фокальных контактов связано с механическим натяжением, возникающим на акто-миозиновых фибриллах. Подавление сократительной способности при помощи блеббистатина, который, связываясь с миозином, запрещает его фосфорилирование (Kovács et. al., 2004) в клетках 3Т3 приводит к уменьшению площади фокальных контактов в 1.5 раза уже после 30 минут воздействия. Фокальные контакты в клетках U2OS реагируют на ингибирование фосфорилирования миозина так же, площадь фокальных контактов снижается в 1.3 раза. При этом, в обеих клеточных линиях часть контактов на краю клетки под воздействием блеббистатина исчезает. Подобный эффект блеббистатина на ФК описан для фибробластов 3Т3 (Beningo et. al., 2006), клеток остеосаркомы U2OS (Aratyn-Schaus Y, Gardel, 2010), в мышиных эмбриональных фибробластах (Pasapera et. аl., 2010), для звездчатых клеток печени (Liu et. al., 2010). Полученные данные в совокупности с данными литературы позволяют сделать вывод об универсальности механизмов процесса. В работе Тotsukawa и др. было показано, что киназы ROCK и MLCK регулируют формирование ФК в разных частях клетки. Так, при подавлении активности киназы ROCK при помощи Y62327 фокальные контакты исчезают в теле клетки, а при ингибировании киназы MLCK контакты разбираются на периферии (Totsukawa et. аl., 2004). Подавление активности ROCK киназы в клетках 3Т3 и U2OS приводит к уменьшению площади контактов на краю клетки в 2.4 раза в обоих случаях, уже после 30 минут воздействия. При таком существенном падении площади средняя интенсивность флуоресценции не изменяется. Под воздействием ингибитора киназы легких цепей миозина снижение площади контактов наблюдается только через час. Можно предположить, что разница во времени воздействия ингибиторов киназ связана с тем, что киназа ROCK имеет несколько мишеней. С одной стороны, киназа ROCK способна напрямую фосфорилировать легкие цепи миозина, а с другой, за счет фосфорилирования ингибировать миозиновую фосфатазу. В то же время киназа ROCK участвует в поддержании полимерной структуры актина, регулируя систему LIM-киназа/кофилин. Получается, что при ингибировании киназы ROCK легкие цепи миозина способна фосфорилировать киназа MLCK, но ей противодействует активно работающая фосфатаза лёгких цепей миозина и разбираются пучки ктиновых филаментов. Таким образом, несмотря на исчезновение сократимых элементов и механического напряжения, в клетках 3Т3 и U2OS происходит образование и рост ФК. Кроме того, даже без актомиозиного комплекса клетки продолжают формировать ламеллу, и продолжать движение, хоть и ненаправленное (Moore et. al., 2011). Из литературы известно, что актиновые элементы, такие, как дорзальные фибриллы, связаны с ФК, но не ассоциированы фосфорилированным миозином, а значит не сократимы (Hotulainen and Lappalainen, 2006; Millan et al., 2010; Schaefer et al., 2008). Возможно, что возникающие в релаксированной клетке ФК связываются именно с этими фибриллами, и, таким образом происходит компенсаторная реакция на воздействие ингибитора, что позволяет клетке частично сохранить свои функции. По результатам всей работы можно сделать следующие краткие выводы: На первом этапе работы было показано, что микротрубочки участвуют в регуляции динамики фокальных контактов, подавление динамической нестабильности МТ приводит к увеличению времени жизни стабильных ФК. Во второй части работы было показано, что в фибробластах линии 3Т3 динамичные микротрубочки регулируют поведение ФК – их площадь, время жизни, и локализацию. В частности, при стабилизации микротрубочек ингибиторами или при подавлении экспрессии плюс-концевого белка EB3 увеличивается площадь и время жизни фокальных контактов, при этом большое количество фокальных контактов появляется в теле клетки. На основании результатов третьего этапа стало возможным предложить следующую модель распластывания клеток: после прикрепления клетки сохраняют форму и начинают формировать блеббсы вследствие активации актомиозинового сокращения в кортикальном слое цитоплазмы (фаза Р0). В конце этой фазы натяжение в кортикальном слое умешьшается, и начинается активная полимеризация актиновых филаментов для увеличения площади клетки на субстрате. В этот временной период динамические МТ опосредуют релаксацию миозина, что в сочетании с полимеризацией кортикального актина приводит к быстрому росту площади клетки (фаза Р1). После истощения пула неполимеризованного актина начинается процесс формирования пучков актиновых филаментов, что, в сочетании с активацией миозина II, приводит к началу медленной фазы распластывания (фаза Р2). Основное внимание на четвертом этапе работы было уделено проверке гипотезы о различии эффектов, происходящих в разных зонах клетки, при инактивации ROCK и MLCK- миозин II фосфорилирующих киназ. Инкубация клеток в среде с ингибитором ROCK проявляется в стабилизации (увеличении продолжительности существования), уменьшении площади и снижении интенсивности флуоресценции ФК на краю клетки, при полной разборке ФК в теле клетки. Ингибирование MLCK киназы также приводит к увеличению продолжительности жизни ФК. На пятом этапе работы было показано, что ингибирование киназы ROCK в клетках А549 и клетках U2OS на краю клетки приводит к увеличению времени жизни ФК, при этом уменьшается их площадь и интегральная интенсивность флуоресценции, и ФК в теле клетки исчезают. При ингибировании киназы MLCK возрастает время жизни ФК на краю клетки, при этом снижается их интегральная интенсивность флуоресценции, а площадь ФК значимо не изменяется. В теле клетки в случае ингибирования ROCK контакты в теле клетки исчезают вовсе, а в случае ингибирования киназы MLCK время жизни фокальных контактов не изменяется, а площадь и интегральная интенсивность флуоресценции меняется незначительно для обоих клеточных линий Таким образом, в финальной части исследования на клеточном уровне было показано, что полное и частичное ингибирование миозина II определяет динамику ФК на краю клетки, однако молекулярные механизмы этого явления еще предстоит выяснить

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".