Хроматин как бионаносистемаНИР

.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Hi-C библиотеки из каждого клеточного типа были подготовлены в двух независимых повторностях с использованием эндонуклеазы рестрикции MboI и секвенированы на платформе Illumina HiSeq по 70 млн парных ридов на образец. Полученные данные были выровнены на референсный геном дрозофилы (dm3), итеративно корректированы и бинированы по 20 т.п.н. Коэффициент корреляции Пирсона для биологических повторов был порядка 0.87, поэтому для дальнейшего анализа данные реплик были слиты в единый пул. На первом этапе анализа полученных данных мы осуществили поиск ТАДов с использованием алгоритма Greendale. Было картировано порядка 650 ТАДов размером от 60 до 460 т.п.н., покрывающих около 66% генома, что согласуется с ранее полученными данными по культивируемым клеточным линиям. Порядка 50% ТАДов имеют идентичные позиции в сперматоцитах, сперматогониях и соматических клетках S2, консервативность позиций ТАДов между сперматоцитами и сперматогониями – около 75%. Как интегральный параметр, характеризующий степень плотности укладки хроматина в масштабе генома, мы рассчитывали среднюю частоту контактов регионов генома, расположенных на заданном расстоянии друг от друга (скейлинг). Анализ скейл-плотов показывает, что в герминальных клетках, по сравнению с соматической клеточной линией S2, обогащены контакты на малых и средних расстояниях (около 10-50 т.п.н.), и обеднены дальние контакты (на расстояниях больше 100 т.п.н.). Кроме того, наклон кривой в герминальных клетках больше, чем в S2. Это говорит о большей компактности ТАДов в герминальных клетках, чем в соматических, что согласуется с тем, что в сперматогониях (и в большей степени в сперматоцитах) начинаются процессы репрессии транскрипции и конденсации хроматина, предшествующие формированию зрелых ядер сперматозоидов. Ранее было показано, что участки генома дрозофилы, содержащие неактивные гены и привлекаемые в приламинарный репрессионный компартмент ядра в соматических клетках (ламин-ассоциированные домены, ЛАДы), как правило расположены внутри ТАДов. Мы использовали ранее опубликованные результаты картирования ЛАДов в сперматогониях методом DamID с тем, чтобы проверить их расположение относительно топологических доменов. Для этого мы рассчитали обогащение сигнала DamID внутри ТАДов и интер-ТАДов, используя z-score в качестве меры обогащения. Как и ожидалось, в сперматогониях лам¬ин-ассоциированные домены также оказались локализованы преимущественно в ТАДах. Мы провели статистический анализ уровня транскрипции ССГ в семенниках личинок III возраста по опубликованным данным (Chintapalli et al. 2007). Скрипичные диаграммы показывают высокую гетерогенность ССГ (являющихся тканеспецифичными генами) по уровню транскрипции. Распределение ССГ между ТАДами и интер-ТАДами в целом оказалось неожиданным. Из результатов многих работ, выполненных как на млекопитающих, так и на дрозофиле, следует, что активные гены располагаются главным образом в интер-ТАДах, а неактивные – внутри топологических доменов. Большинство ССГ в герминальных клетках располагаются в ТАДах (72%), при этом нет никакой зависимости между уровнем транскрипции данного семенник-специфичного гена и расположением его в ТАДе или интер-ТАДе: и активно экспрессирующиеся ССГ, и практически молчащие как правило расположены внутри топологических доменов. Мы предполагаем, что, поскольку ССГ обычно короткие и располагаются одиночно, транскрибируемая область хроматина, ими образуемая, не достаточна для возникновения на этом месте границы домена и превращению её в интер-ТАД, возникающий обычно там, где высока плотность активно транскрибируемых генов.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Работа в 2017 году была посвящена изучению пространственной организации генома Dictyostelium. Dictyostelium discoideum – миксомицет, чередующий в своём жизненном цикле одноклеточную и многоклеточную стадии. Был проведён HiC-эксперимент по картированию топологии генома свободноживущих клеток Dictyostelium, выполнен биоинформатический анализ данных, и предложена 3D-модель организации генома Dictyostelium. Мы также отработали систему дифференцировки и до завершения текущего календарного года планируем провести HiC-анализ топологии генома преспоровых и соматических клеток. На первом этапе работы нами были отработаны условия культивирования Dictyostelium на бактериальном газоне E. coli (штамм DH5α) на SM-агаре. Этот метод оказался оптимальным для выведения культуры из замороженного в жидком азоте стока. В пилотных экспериментах мы использовали панель агаризованных сред (SM-агар, SM/2-агар, Maltose-HL5-агар) из перечня, рекомендованного ресурсом dictyBase.org. Наилучшие показатели роста были зафиксированы именно на среде SM-агар, где Dictyostelium демонстрировал заметный рост (формирование «бляшек» - участков бактериального газона, на которых Dictyostelium активно размножается, используя бактерий в качестве пищевого ресурса) уже на вторые сутки культивирования. Количество зон роста на SM-агаре также превышало таковое на других средах: 10-15 зон роста на 100 тыс. апплицированных клеток Dictyostelium через двое суток после посева против 2-3 на такое же количество клеток при культивировании на SM/2-агаре и Maltose-HL5-агаре. На втором этапе работы нам было необходимо отработать условия культивирования Dictyostelium в большом объёме безбактериальной жидкой среды для того, чтобы иметь возможность единовременно получить большое количество клеток (108-109) для основных HiC-экспериментов. Нами были опробованы среды с различным содержанием солей (гидро- и дигидрофосфатов натрия и калия), стандартных бактотриптонов и простых углеводов (глюкозы и мальтозы), однако ни один из вариантов среды не позволял получить стабильный рост Dictyostelium. Оптимальная среда была получена путём модификации среды HL5 c использованием высокопитательных смесей пептонов и переваров мяса с повышенным содержанием олигопептидов (Tryptose, LABM #MC008; Proteose Peptone A, LABM #MC011) с добавлением витаминного коктейля RPMI (Sigma #R7256). На полученной среде при стандартной температуре культивирования 22оС характерное время удвоения популяции клеток Dictyostelium составляет 24 часа. Перед проведением экспериментов по дифференцировке Dictyostelium мы выполнили HiC-эксперимент на популяции недифференцированных свободноживущих клеток, культивируемых в описанной выше модифицированной среде HL5 (HL5m). Изначально мы планировали использовать протокол HiC из лаборатории Д. Деккера, включающий стадии биотинилирования концов рестриктных фрагментов перед их религированием и последующей иммобилизации биотинилированных продуктов лигирования на магнитных шариках со стрептовидином. Однако впоследствии мы отказались от этого подхода в пользу альтернативной стратегии, предложенной в лаборатории Дж. Кавалли. Данная экспериментальная стратегия более проста в исполнении, поскольку не содержит этапа биотинилирования ДНК: после расщепления хроматина эндонуклеазой рестрикции (для повышения разрешения анализа, мы использовали частощепящую эндонуклеазы рестрикции MboI, сайт GATC) и лигирования «липких» концов ДНК полученная 3С-библиотека фрагментируется ультразвуком на короткие фрагменты (порядка 200-1000 п.н.), которые после репарации концов ДНК и лигирования адаптеров Illumina секвенируются парными ридами. Мы внесли ряд изменений в данную методику с тем, чтобы оптимизировать её именно для работы с Dictyostelium. В частности, мы изменили режим обработки ядер ионным детергентом (SDS) на этапе перед расщеплением хроматина эндонуклеазой рестрикции, поскольку в пилотных экспериментах столкнулись со значительной деградацией ДНК в образце эндогенными нуклеазами. Увеличение количества SDS в буфере на этапе, предшествующем рестрикции, до 1% позволило решить эту проблему. Мы провели HiC-эксперимент в двух независимых биологических повторах и на данный момент располагаем картой пространственной структуры хроматина свободноживущих клеток Dictyostelium, построенной с различными разрешениями, начиная с разрешения 5 т.п.н., которое по порядку величины совпадает со средним размером гена Dictyostelium (1,75 т.п.н.), что существенно для анализа топологии генома на высоком уровне детализации. Нами была отработана система дифференцировки Dictyostelium. Мы использовали два классических подхода: дифференцировка на нитроцеллюлозе и на КК2-агаре. Суть обоих подходов заключается в том, что вегетирующие (свободноживущие) клетки, находящиеся в лаг-фазе роста (плотность культуры в жидкой среде 2 – 4 млн/мл), помещаются в среду без пищевого субстрата (т.н. development buffer, DB – низкосолевой фосфатный буфер с магнием и кальцием) на твёрдую поверхность, после чего следует инкубация при 22оС в темноте в течение 18 – 24 часов. В случае дифференцировки на нитроцеллюлозе поверхностью служат нитроцеллюлозные фильтры, смоченные в DB; при дифференцировке на КК2-агаре клетки помещаются на поверхность свежего бактоагара, приготовленного на калий-фосфатном буфере. Дифференцировка на нитроцеллюлозе по неизвестным причинам прерывалась на стадии первичных клеточных агрегатов (streaming), поэтому мы остановились на способе дифференцировке на поверхности KK2-агара. Мы установили, что в создаваемых нами условиях наилучшие результаты достигаются при апплицировании 60 – 100 млн вегетирующих клеток на поверхность агара в стандартной 100-мм чашке Петри. Через 18 – 19 часов после старта дифференцировки наблюдается массовое и достаточно синхронное появление стадии «мексиканской шляпы» (Mexican hat), предшествующей формированию зрелых плодовых тел, которое происходит примерно на 23-м часу дифференцировки. На стадии «мексиканской шляпы» в составе зачатков плодовых тел уже присутствуют соматические и преспоровые клетки, поэтому именно эта стадия обычно используется, если исследование предполагает разделение двух клеточных типов. На данный момент нами отработан способ химической дезинтеграции клеточных агрегатов с использованием смеси хелатирующего агента (20 мМ EDTA), агента, восстанавливающего дисульфидные связи (12 мМ DTT), и протеазы (50 мкг/мл протеиназы К или 0,1% трипсина). На стадии оптимизации условий находится процесс разделения преспоровых и соматических клеток в непрерывном градиенте перколла. Мы выполнили два независимых биологических повтора HiC на свободноживущих клетках Dictyostelium discoideum (штамм AX4). HiC-библиотеки из каждого эксперимента были секвенированы парными ридами на Illumina HiSeq (около 100 млн парных ридов на библиотеку). Поскольку коэффициент корреляции двух образцов был 0,99, полногеномная карта пространственных контактов (хитмэп) была построена по данным, полученным после объединения двух биологических реплик, что позволило увеличить количество уникально картированных ридов, использованных для построения карты. В результате были построены карты пространственных контактов с разрешениями 5, 10 и 20 т.п.н. Первое наблюдение, которое следует из визуального анализа хитмэпа, заключается в том, что у Dictyostelium хромосомные территории выражены заметно слабее, чем у высших эукариот, особенно у млекопитающих. Возможно, это связано с тем, что геном Dictyostelium на два порядка меньше, чем, например, у человека, при том, что объем ядра клетки Dictyostelium и ядра клетки человека совпадают по порядку величины. Таким образом, можно предположить, что при прочих равных условиях, хроматин Dictyostelium имеет бóльшую подвижность, что выражается в меньшей степени компактизации его интерфазных хромосом по сравнению с хромосомами млекопитающих. Из анализа хитмэпа также следует, что 3’-конец хромосомы V и 5’-концы всех остальных пяти хромосом контактируют друг с другом и находятся в одном микрокомпартменте ядра, что подтверждает данные, ранее полученные с использованием техники флуоресцентной гибридизации in situ с зондами к повторам класса DIRS, расположенным на концах хромосом. Следует отметить, что неизвестно, где именно на хромосомах Dictyostelium расположены центромерные участки. Коллектив авторов, впервые опубликовавших полный сиквенс генома Dictyostelium discoideum и выполнивших его подробный биоинформатический анализ, придерживается мнения, что именно упомянутые выше элементы DIRS выполняют в Dictyostelium функцию центромер, что делает хромосомы этого организма телоцентрическими и позволяет интерпретировать кластеризацию концов хромосом как контакты их центромерных участков. В целом, схожая организация интерфазных хромосом характерна и для других исследованных эукариот. Так, в Schizosaccharomyces pombe наблюдается кластеризация теломер и центромер всех хромосом, а в Saccharomyces cerevisiae и Arabidopsis thaliana только центромеры хромосом кластеризуются друг с другом в пространстве ядра. Однако, ещё один участок кластеризации повторов DIRS в Dictyostelium располагается на 3`-конце протяжённой дупликации на хромосоме II, и по нашим данным он пространственно сближен с DIRS-содержащими концами остальных хромосом. Таким образом, возможно, хромосома II располагает двумя функциональными центромерными участками. Альтернативное объяснение этого факта заключается в том, что DIRS-обогащённые участки хромосом кластеризуются в одном микрокомпартменте ядра, что является частью механизма их стабильной репрессии, к примеру, с участием РНК-интерференции. Анализ пространственных контактов внутри хромосом алгоритмом Armatus не позволил на настоящий момент зафиксировать наличие у Dictyostelium регулярно расположенных топологически ассоциированных доменов (ТАДов), ранее обнаруженных на хромосомах человека, мыши, дрозофилы и делящихся дрожжей, и интерпретируемых как структурные единицы интерфазного хроматина. На данном этапе анализа мы не можем исключить возможность формирования в геноме Dictyostelium небольших глобул (размером 20 – 100 т.п.н.), присутствующих на всем протяжении хромосом. В некоторых местах генома границы между глобулами видны довольно отчетливо; другие, как правило, более длинные, фрагменты генома демонстрируют значительно более однородную организацию, тяготеющую, однако, к сворачиванию в протяженные компактные хроматиновые структуры без выраженных границ и с неясной внутренней структурой. Визуальный анализ хитмэпа однозначно свидетельствует в пользу отсутствия в Dictyostelium т.н. дальних контактов – пространственных взаимодействий элементов генома, разделенных большим расстоянием на молекуле ДНК. Таким контактам на картах пространственной структуры соответствуют зоны высокой интенсивности сигнала, расположенные вдали от диагонали карты. Как правило, такие контакты формируются между транскрипционными энхансерами и подконтрольными им промоторами, либо между функционально связанными коэкспрессируемыми генами. Отсутствие дальних контактов в геноме свободноживущих клеток Dictyostelium, судя по всему, свидетельствует о том, что (1) у этого организма энхансеры – если они имеются в большом количестве, как у других изученных эукариот – всегда располагаются поблизости от регулируемых ими промоторов (как у дрожжей, у которых, тем не менее, имеются дальние контакты между функционально связанными генами), и/или (2) коэкспрессируемые гены в Dictyostelium как правило расположены в одном геномном локусе, на небольшом расстоянии друг от друга вдоль цепи ДНК (релевантно и предположение, что коэкспрессия в Dictyostelium не требует образования пространственных комплексов коэкспрессируемых генов). В результате проведенного анализа была предложена принципиальная 3D-модель организации генома Dictyostelium в свободноживущих амебоидных клетках. Согласно этой модели, интерфазный хроматин Dictyostelium достаточно свободно располагается в ядре и имеет заметно меньшую степень компактизации, чем хроматин высших животных. Хотя вопрос о топологических доменах в геноме Dictyostelium пока остаётся открытым, на основе полученных данных мы можем утверждать, что на всём протяжении хромосом формируются умеренно конденсированные хроматиновые структуры, в некоторых местах генома интерпретируемые как топологически обособленные глобулярные домены. Важно отметить, что протяжённые участки хроматина Dictyostelium не демонстрируют тенденции к взаимодействию друг с другом в масштабе целой хромосомы, как это имеет место в клетках человека и мыши (т.н. А- и В-компартменты, образуемые взаимодействиями топологических доменов), и поэтому каждая отдельно взятая хромосома как целое представляется довольно неструктурированной. DIRS-обогащённые регионы хромосом располагаются в одном микрокомпартменте ядра, что является на данный момент единственным зафиксированным пространственным взаимодействием in trans.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Мы работали на нейрональных клетках личиночного происхождения линии BG3-c2. 5 млн клеток фиксировали 1% формальдегидом в буфере PBS, после чего лизировали в буфере с неионными детергентами, выделенные ядра пермеабилизировали SDS, хроматин обрабатывали эндонуклеазой рестрикции в течение ночи, после чего фрагменты хроматина лигировали с использованием стандартной Т4 ДНК-лигазы. После этапа лигирования ядра отмывали в буфере PBS, осадок замораживали в жидком азоте и хранили на -80С. Затем ядра изолировали в лунки 96-луночного планшета с использованием клеточного сортера. Этот этап процедуры занял довольно значительное время. Мы столкнулись с тем, что клеточный сортер потребовал крайне тщательной калибровки перед началом изоляции клеток, поскольку после стандартной процедуры калибровки подавляющее большинство ядер попадало не на дно лунки, а на её стенки. Такие ядра оказываются недоступны для последующих манипуляций. Успешно изолированные индивидуальные ядра были подвергнуты процедуре полногеномной изотермической амплификации (ПГА) ДНК с использованием полимеразы phi29, работающей по принципу «катящегося кольца» (набор реагентов Illustra GenomiPhi V2, GE Healthcare). Следует отметить, что данный подход к проведению Hi-C в единичных клетках был разработан нами совместно с коллегами из Австрии и США и использован в картировании топологии генома в ооцитах и зиготах мыши, результаты работы опубликованы в прошлом году в журнале Nature (Flyamer et al. 2017). В лунках, где ПГА прошла успешно, было получено от одного до пяти микрограмм ДНК. В общей сложности мы провели реакцию ПГА на 384 индивидуальных ядрах, при этом успешно реакция прошла на материале из 194 ядер. После ПГА ДНК фрагментировали ультразвуком до размера порядка 100-500 п.н., готовили библиотеки по стандартному протоколу для геномных библиотек Illumina и секвенировали на платформе Illumina HiSeq 2000 с использованием 10-20 млн парных ридов на образец. К настоящему моменты секвенировано 102 библиотек и проведена их биоинформатическая обработка совместно с сотрудниками группы М.С. Гельфанда. Для обработки данных использовали пакет Distiller, в настоящее время активно разрабатываемый и внедряемый лабораторией Леонида Мирного (MIT, США). Данное программное обеспечение позволяет анализировать рид целиком (в отличие от стандартного подхода к обработке данных Hi-C, где используется итеративное картирование ридов). Обработка данных в Distiller включает следующие принципиальные этапы: 1. Картирование ридов на референсный геном. 2. Фильтрация не уникальных картирований. 3. Фильтрация ридов из очень коротких (<50 п.н.) и очень длинных (> 10 т.п.н.) рестриктных фрагментов. 4. Фильтрация пар ридов, в которых оба рида картируются на один и тот же рестриктный фрагмент. 5. Поиск химерных пар ридов. Химерной парой называется такая пара ридов, в которой либо оба рида целиком картируются в разные рестриктные фрагменты, либо по крайней мере один из ридов проходит через точку лигирования рестриктных фрагментов, определяемую по наличию сайта распознавания рестриктазы, использованной на этапе Hi-C проведения процедуры. Затем с использованием всего пула химерных пар ридов происходит аннотация партнёров по контактам для каждого рестриктного фрагмента. Поскольку мы используем диплоидные клетки, то для каждого рестриктного фрагмента теоретически может быть до 4 разных партнёров по контактам. Принимая во внимание то обстоятельство, что культивируемые клетки могут спонтанно менять плоидность, мы определили порог в 8 уникальных партнёров по контактам для каждого рестриктного фрагмента. Все рестриктные фрагменты с бОльшим количеством уникальных партнёров были отфильтрованы. Артефактные взаимодействия могут возникать в процессе полногеномной амплификации, поскольку известно, что полимераза phi29 способна осуществлять смену матрицы, тем самым строя искусственные «мостики» между разными молекулами в растворе и увеличивая наблюдаемое разнообразие уникальных продуктов лигирования каждого рестриктного фрагмента. 24 из 102 секвенированных библиотек из ядер, успешно прошедших процедуру ПГА, содержат более 10 тыс. уникальных контактов на геном. Это позволяет строить карты Hi-C с разрешением 10 т.п.н., что является вполне приемлемым для использования в процедуре Hi-Dam. Интересно, что судя по результатам даунсэмплинга, мы детектировали не все контакты в полученных библиотеках, и увеличение глубины секвенирования примерно вдвое должно повысить разнообразие детектированных пространственных взаимодействий в библиотеках из единичных ядер. Необходимо отметить, что само по себе получение карт пространственной организации хроматина в единичных клетках дрозофилы является серьёзным достижением, поскольку до сих пор данные такого рода в литературе отсутствуют. Хотя эти данные требуют глубокого биоинформатического анализа, который мы намерены провести в ближайшем будущем, уже сейчас можно сказать, что топологически-ассоциированные домены хроматина чётко различимы в индивидуальных клетках. На первом этапе проведённого биоинформатического анализа мы картировали ТАДы с использованием алгоритма Armatus в популяционных данных, в данных из единичных клеток, и в данных, полученных объединением ридов из индивидуальных клеток (пул). Полученные результаты свидетельствуют о том, что позиции ТАДов в индивидуальных клетках в высокой степени консервативны, и порядка 60% популяционных ТАДов могут быть обнаружены в одной отдельно взятой индивидуальной клетке. Затем мы провели анализ эпигенетических характеристик границ ТАДов, обнаруженных более чем в 50% клеток (т.н. конститутивных границ), и границ, встречающихся более редко (вариабельные границы). Оказалось, что конститутивные границы демонстрируют значительное обогащение метками активного хроматина (транскрипция, РНКП2, H3K27ac), в то время как вариабельные границы характеризуются гораздо более низкой представленностью активных меток. Таким образом, можно сделать вывод, что активные участки генома являются наиболее предпочтительными местами возникновения границ ТАДов. Эти данные подтверждают опубликованную нами ранее модель, в которой мы на основе анализа популяционных Hi-C карт дрозофилы делаем вывод, что именно активный хроматин является движущей силой возникновения границ ТАДов. На следующем этапе анализа мы аннотировали контакты поликомб-содержащих ТАДов в индивидуальных клетках. Главным результатом этого анализа является то, что дальние контакты таких ТАДов являются высоко вариабельными в клеточной популяции: в каждой индивидуальной клетке набор таких парных взаимодействий оказался разным. Это отражается вариабельность и стохастичность природы формирования поликомб-телец в клетках дрозофилы.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: В экспериментах по определению топологии генома на фоне химического ингибирования активности гистонацетилтрансферазных и гистондеацетилазных комплексов продемонстрировано, что ТАДы разных эпигенетических классов в этих условиях реагируют по-разному: подавление активности гистондеацетилаз трихостатином приводит к декомпактизации активных ТАДов и увеличению плотности доменов, содержащих репрессированный хроматин; обработка клеток куркумином, подавляющим активность мажорной гистонацетилтрансферазы р300 (СВР), напротив, приводит к декомпатизации неактивных районов генома. Мы связываем полученные результаты с изменениями уровня ацетилирования гистонов преимущественно в границах ТАДов на фоне обработки клеток трихостатином А и куркурмином. Эксперименты, направленные на раскрытие роли ацетилирования гистонов в установлении и поддержании трёхмерной структуры интерфазного хроматина дрозофилы были выполнены на культивируемых эмбриональных гемоцитах линии Schneider-2 (S2). Клетки S2, растущие на стандартной среде (Thermo Scientific), в разных сериях экспериментов были обработаны следующими агентами: (а) трихостатином-А (ТХА), который является ингибитором гистондеацетилаз (HDAC) широко спектра (10 мкМ в течение суток); (б) куркумином, ингибирующим гистонацетилтрансферазы (HAT), главным образом мажорный комплекс p300 (10 мкМ в течение суток). Контрольные клетки обрабатывали DMSO. Выживаемость клеток контролировали посредством окраски трипановым синим и в стандартном МТТ-тесте. Материал отбраковывали, если в опыте выживаемость клеток была ниже 95-93% (нормальные показатели для контрольных образцов). Из экспериментальных и контрольных клеток отбирали аликвоты и посредством Вестер-блоттинга с антителами против ацетилированных форм гистонов оценивали эффективность ингибирования гистонацетилтрансферазынх и гистондеацетилазных комплексов. Контрольные и опытные образцы клеток использовали для картирования топологии хроматина методом Hi-C с последующим глубоким секвенированием полученных библиотек на платформе Illumina HiSeq 2000. Данный метод на сегодняшний день является наиболее популярной и распространённой техникой для определения пространственной структуры генома. Библиотеки Hi-C готовили по опубликованному протоколу, ранее оптимизированному нами для работы с культивируемыми клетками дрозофилы. Клетки фиксировали в буфере PBS с добавлением 1% формальдегида 10 мин при комнатной температуре. Затем выделяли ядра, фрагментировали хроматин эндонуклеазой рестрикции HindIII (NEB), застраивали концы ДНК с использованием фрагмента Клёнова (NEB) и биотинилированного CTP (Invitrogen), и лигировали с помощью Т4-лигазы (Fermentas). Продукты лигирования очищали с помощью магнитных шариков, конъюгированных со стрептавидином (Invitrogen). Качество библиотек контролировали с использованием прибора Bioanalyzer, библиотеки секвенировали с использованием 35-40 млн парных ридов на образец. Процессинг данных, включая выравнивание ридов на референсный геном дрозофилы (dm3) осуществляли с использованием пакета hiclib. Риды, прошедшие все этапы фильтрации (неуникальные картирования; пары ридов из одного и того же рестриктного фрагмента; пары ридов из очень длинных (> 10 т.п.н.) и очень коротких (< 50 п.н.) рестриктных фрагментов), были использованы для построения итеративно-корректированных полногеномных матриц контактов, визуализируемых в виде тепловых карт. ТАДы в полученных данных были картированы с использованием программного обеспечения Armatus. Плотность укладки хроматина в ТАДах оценивали как сумму всех контактов, детектированных внутри данного ТАДа. К настоящему моменту все библиотеки из опытных и контрольных образцов секвенированы, риды выровнены на референсный геном (dm3) и проведена биоинформатическая обработка данных. Все эксперименты были проведены в двух полностью независимых биологических повторностях, которые были процессированы раздельно вплоть до получения геномных библиотек. На первом этапе анализа данных экспериментов, проведённых в условиях ингибирования активности гистонацетилтрансферазных и гистондеацетилазных комплексов, мы провели поиск ТАДов. Результаты картирования показывают, что обработка ТХА и куркумином не приводит к статистически значимым изменениям положения ТАДов в масштабе всего генома: опытные и контрольные образцы на демонстрируют 80-85% гомологии в положении границ ТАДов, что находится в пределах погрешности эксперимента, определяемой по степени гомологии биологических повторностей контрольных экспериментов. Однако, мы обнаружили, что данные обработки приводят к тому, что изменяется относительная плотность ТАДов. Более того, результаты Hi-C анализа говорят о том, что увеличение и уменьшение плотности характерно для разных эпигенетических классов ТАДов, определяемых по содержанию разных типов хроматина, ранее аннотированных по результатам кластерного анализа результатов множественных ChIP-seq экспериментов с антителами против гистоновых модификаций и хроматин-ассоциированных негистоновых белков. Абсолютное большинство ТАДов становятся более плотными в условиях ингибирования активности комплексов HDAC: 65% ТАДов увеличивают свою плотность, 24% - понижают, и только 11% не изменяют плотность. Эпигенетический анализ ТАДов показывает, что ТАДы с высоким содержанием серого типа хроматина (репрессированные гены) и низким содержанием активных цветов – красного, маркирующего активные промоторы, и бурого, характерного для тел экспрессирующихся генов и для активных регуляторных элементов увеличивают свою плотность. Указанные активные цвета, напротив, демонстрируют повышенное содержание в ТАДах, чья плотность уменьшается при ингибировании активности HDAC. Интересно, что наблюдается надёжная зависимость степени изменения компактности ТАДа от содержания в нём того или иного типа хроматина. Так, чем больше в ТАДе бурого хроматина, тем сильнее падает плотность укладки при обработке ТХА (Pearson’s r = -0.49, p = 1.11e-9), и чем выше содержание серого хроматина, тем сильнее в этом случае растёт плотность ТАДа (Pearson’s r = 0.59, p = 4.17e-13). Обработка куркумином, напротив, приводит к декомпактизации неактивных ТАДов. Мы предположили, что изменения плотности ТАДов могут быть связаны с изменениями уровня ацетилирования: согласно нашей модели формирования ТАДов в геноме дрозофилы, ацетилирование гистонов должно снижать плотность укладки хроматина из-за супрессии межнуклеосомных контактов, что должно приводить к декомпактизации ТАДов. Если такое предположение верно, что в условиях ингибирования активности HDAC (и, соответственно, смещения «баланса сил» в пользу комплексов гистонацетилтрансфераз) ацетилирование должно преимущественно расти в активном хроматине, что объясняло бы падение плотности ТАДов, содержащих какие-то заметные его количества (отметим, что ТАДы, снизившие свою плотность при ингибировании активности HDAC, содержат порядка 8% красного и порядка 15% бурого хроматина). Далее, мы проанализировали уровень контактов между разными ТАДами на фоне ингибирования активности HDAC. Для оценки этого параметра можно воспользоваться несколькими разными подходами, такими как аннотация компартментов хроматина, подсчёт доли ридов библиотеки, отвечающих контактам ТАДов друг с другом, и подсчёт индекса инсуляции. Мы использовали два последних подхода, поскольку (по нашему опыту) успех и точность процедуры аннотации компартментов в хроматине дрозофилы с помощью анализа главных компонент очень сильно зависит от глубины секвенирования библиотек и не всегда даёт удовлетворительные результаты. На первом этапе мы вычислили общий уровень контактов между всеми ТАДами в геноме. Для этого все детектированные контакты в опытных и контрольных образцах мы разделили на 5 групп: контакты внутри ТАДов (Т), внутри интер-ТАДов (I), контакты между разными ТАДами (ТТ), между разными интер-ТАДами (II), и между интер-ТАДами и ТАДами (IT). Количество контактов в группе ТТ падает и при обработке ТХА. Гораздо более выраженный эффект можно наблюдать при подсчёте индекса инсуляции (ИИ). ИИ вычисляется как отношение суммы контактов внутри соседних ТАДов к количеству контактов между ними. Чем выше величина ИИ, тем меньше контактов соседние ТАДы образуют друг с другом. Таким образом, ИИ может рассматриваться как величина, характеризующая силу границы между ТАДами: чем выше ИИ, тем сильнее данная граница разделяет два ТАДа, расположенные слева и справа от неё. Мы вычислили ИИ для всех соседних пар ТАДов в контроле и опыте, и обнаружили, что при обработке ТХА, величины ИИ растут, что выражается в отклонении облака точек вправо вниз. Таким образом, можно заключить, что ингибирование активности комплексов гистондеацетилаз приводит к тому, что ТАДы становятся более обособлены друг от друга как в составе пар соседствующих доменов, так и в масштабе всего генома. Эти данные согласуются с общей компактизацией подавляющего большинства ТАДов при ингибировании активности HDAC, как мы показали в предыдущем разделе. Действительно, если хроматиновая глобула становится более компактной, то ясно, что она при этом должна формировать меньше контактов с соседними глобулами. Таким образом, мы показали, что изменение уровня ацетилирования гистонов напрямую отражается на относительной плотности укладки хроматина в ТАДах разных эпигенетических классов.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Согласно плану, мы проанализировали топологию генома диктиостелиума по ходу дифференцировки. Опираясь на ранее опубликованные данные о динамике изменения морфологии клеточных агрегатов и профиля экспрессии, мы выбрали второй, пятый и восьмой часы дифференцировки. На втором часу начинается миграция клеток по поверхности дифференцировочной среды, на пятом часу наблюдается появление харакетерного петлевого рисунка, образованного клеточными популяциями, стекающимися к местам формирования многоклеточных зачатков плодовых тел, на восьмом часу наблюдается образование первых таких зачатков. Hi-С библиотеки были получены с использованием того же протокола, который мы применяли при работе со свободноживущими клетками диктиостелиума, эксперимент был выполнен в двух независимых биологических повторах. Анализ карт высокого разрешения (2 т.п.н.) показал что позиции подавляющего большинства петель не меняются по ходу дифференцировки. Ранее, на основании анализа транскриптома свободноживущих клеток, мы показали, что уровень экспрессии генов внутри петель заметно выше, чем в их основаниях и межпетлевых участках, из чего мы сделали вывод, что петли являются своего рода «транскрипционными доменами», на которые разделён геном диктиостелиума. Наряду с получением карт топологии хроматина, мы проанализировали транскрипционный профиль генома на трёх стадиях дифференцировки методом polyA(+) RNA-seq. Кластерный анализ реплик показывает, что по ходу дифференцировки профиль экспрессии генов значительно изменяется, и эти изменения особенно заметны между нулевым (свободноживущие клетки) и восьмым часом дифференцировки (как и ожидалось, исходя из опубликованных ранее данных). Интересно, что распределение генов, не изменяющих свою экспрессию (гены «домашнего хозяйства», или housekeeping genes, HK), и генов, регулируемых по ходу дифференцировки (дифференциально экспрессирующихся, DE), значительно различается относительно оснований петель. Если гены «домашнего хозяйства» главным образом сосредоточены во внутренних областях петель, то дифференциально экспрессирующиеся гены распределены достаточно равномерно (за исключением генов, дифференциально экспрессирующихся на восьмом часу относительно свободноживущих клеток: эта группа генов тяготеет к основаниям петель). Вероятно, постоянство позиций петель по ходу дифференцировки может быть связано с тем, что внутри них заключены гены, которые должны транскрибироваться на одном уровне на всех проанализированных стадиях дифференцировки). На следующем этапе мы проанализировали направления генов вокруг оснований петель. Для этого мы рассчитывали так называемый индекс конвергентности (convergence score): чем выше значение этого индекса в геномном бине, тем больше в этом бине генов, ориентированных «голова к голове», то есть, расположенных конвергентно. Мы использовал несколько разметок петель, полученных вручную и с помощью автоматических алгоритмов поиска. Во всех случаях мы обнаружили, что основания петель являются участками генома, значительно обогащёнными конвергентным генами. Функциональный смысл этого явления не вполне ясен, однако, принимая во внимание, что (1) РНК-полимераза способна «толкать» перед собой когезиновое кольцо, и (2) во всех исследованных модельных системах именно когезин является ключевых петлеобразующим фактором, можно предположить, что конвергентная транскрипция в основаниях петель способствует локализации в них когезина, что может быть необходимым условием для формирования петель между этими участками генома. Для подтверждения гипотезы о роли когезина в формировании петель в хроматине диктиостелиума, мы использовали методы симуляции фолдинга хроматина на основе модели экструзии петель (loop extrusion). Данная модель предполагает, что когезин, будучи связан с ДНК, протягивает её (экструдирует) с образованием петель между участками, на которых этот процесс затруднён или останавливается (в геномах млекопитающих это сайты связывания белка CTCF). В наших симуляциях нам удалось воспроизвести паттерн петель, по своим характеристикам близких к тем, которые наблюдаются в экспериментальных данных: эти петли слабо инсулируют свою внутреннюю область от хромосомного окружения, они обладают слабой иерархичностью, а их основания расположены в пределах небольших контактных доменов. В нашей модели в качестве фактора, останавливающего экструзию, была заложена движущаяся РНК-полимераза, что соотносится с недавно опубликованными данными для геномов бактерий. Таким образом, косвенно, наши наблюдения говорят о том, что петлевая структура в хроматине диктиостелиума возникает в результате взаимодействия экструдирующего хроматиновую нить когезина и элонгирующей РНК-полимеразы. Кроме перечисленного выше, мы так же проанализировали масштабную структуру интерфазных хромосом диктиостелиума, а именно предприняли поиск компартментов. Хотя характерного паттерна «шахматной доски» нам обнаружить не удалось, тем не менее видно, что отдельные протяжённые фрагменты хромосом образуют компартментоподобную структуру. Однако на данный момент нам не удалось выяснить, чем именно это обусловлено; с определённостью можно сказать только, что эти компартменты не коррелируют с профилем экспрессии, как это наблюдается в клетках млекопитающих и дрозофилы. Согласно плану на этот год, мы должны были выполнить полногеномное профилирование распределения эпигенетической метки H3K27ac в хроматине диктиостелиума методом ChIP-seq с целью поиска потенциальных энхансерных элементов. Хотя наши предварительные данные (результаты вестерн-блоттинга) говорили о том, что имеющиеся у нас в наличии антитела распознают H3K27ac, качественного профиля ChIP-seq получить не удалось. Поэтому мы использовали метод ATAC-seq для картирования открытых участков хроматина; такие участки, расположенные вне пределов промоторных областей, как правило соответствуют регуляторным элементам. Профили ATAC-seq были получены для свободноживущих клеток, а также для пятого и восьмого часа дифференцировки; в настоящий момент эти данные анализируются на предмет поиска в пиках сигнала мотивов связывания транскрипционных факторов с использованием базы данных JASPAR.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".