Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.НИР

Directional differentiation of mammalian cells in vitro

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа:
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: При исследовании возможности нейральной дифференцировки клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) человека под действием bFGFбыли проведены работы на клетках линии клеток ARPE-19. В результате анализа ПЦР в реальном времени было выявлено, что через 24 часа инкубирования в среде с bFGF в клетках существенно усиливается экспрессия KLF4. Через 48 часов при сохранении увеличения экспрессии KLF4 наблюдается снижение уровня экспрессии специфических маркеров дифференцировки РПЭ – Pax6, MITF, OTX2. Наивысший уровень экспрессии KLF4наблюдался через 72 часа инкубирования с bFGF. Затем, через 120 часов культивирования он резко снижался, что сопровождалось возвратом экспрессии Pax6, MITF, OTX2 к исходному уровню и троекратному росту экспрессии TUBB3. Полученные данные свидетельствуют о начале процесса дифференцировки клеток внейрональном направлении. Эти данные подтверждаются иммуноцитохимическим окрашиванием и морфологическими изменениями. Так, клетки поменяли свою морфлогию, они стали более вытянутыми, у них появились нейроноподобные отростки. Такие клетки давали положительное окрашивание на TUBB3 и не давали окрашивание на Cx43 (ключевой белок щелевых контактов). Клетки в контроле, наоборот, давали окрашивание на Cx43 и не окрашивались антителами к TUBB3.Таким образом, TUBB3 может быть использован как маркер для репрограммирования клеток РПЭ человека в нейральном направлении. Отработана оптимальная модель диабета на лабораторных животных для последующей оценки влияния трансплантации клеток на регенерацию островков Лангерганса поджелудочной железы мышей. Индукцию экспериментального диабета проводили с помощью химического агента. Мышей, половозрелых самцов линии C57Bl6 в возрасте 6-8 недель, весом 20-22 г, содержали в стандартных условиях с 12 часовым ритмом освещенность/темнота. Мышам после 12-16 часов голодания ежедневно в течение 5 дней подряд вводили внутрибрюшинно с химического агента. Контрольной группе животных вводили 0,1 М растворителя в том же объеме. Для предотвращения гипогликемии, параллельно инъекциям агента животных поили 10% глюкозой на протяжении 5-ти дней. Через 1 неделю после последнего введения, в течение 8 недель каждые три дня, у животных проверяли наличие сахара и кетонов в моче с помощью тест полосок (Кетоглюк-1, Россия), а затем измеряли содержание сахара в крови при помощи стандартных глюкометров (OneTouchSelectSimple (LifeScan, США) и Contour TS (Bayer, Германия)). Было показано, что при указанном способе введения испытуемого агента диабет развивается не менее чем у 30% животных (обычно около 50%). Диабет стабилен в течение не менее 4 недель. Этого достаточно для проведения исследований, связанных с трансплантацией клеток экспериментальным животным. Выживаемость животных со стабильной гипергликемией составила около 30% за период наблюдения (4 недели). Концентрация глюкозы в крови животных составила в среднем 27 мМ на начало наблюдений, и 22,1 мМ к концу эксперимента (через 4 недели). Таким образом, данный метод выбран как оптимальный для индукции экспериментального диабета с целью оценки влияния трансплантации клеток на регенерацию островков Лангерганса поджелудочной железы мышей. В ходе работы была отработана методика выделения везикулярных частиц иПСК, полученных из дермальных фибробластов кожи человека. Данная методика основана на последовательном центрифугировании и ультрацентрифугировании ростовой среды, полученной в ходе культивирования данных клеток. Выявлены сроки культивирования иПСК для получения оптимального количества везикулярных частиц. При использовании витального мембранного красителя CellMask™ Deep Red Plasma membrane Stain удалось визуализировать везикулярные частицы на поверхности мембраны клеток. Был показан градиент выделения везикулярных частиц иПСК с максимумом в перикариальной области клеток. Далее была отработана методика количественного и качественного определения везикулярных частиц при использовании анализатора наночастиц Nanosight NS500. Показано, что преимущественный размер частиц находится в размерном диапазоне экзосом. Для стандартизации последующих манипуляций с микровезикулами был отработан метод количественного определения массы везикул по тотальному белку (метод Бредфорда). Отрабатывается метод молекулярно-генетического анализа микровезикул на наличие основных маркеров плюрипотентности и модели in vitro для оценки физиологической роли везикулярных частиц. - Используя поверхностный маркер SSEA1 первичных половых клеток, удалось получить чистую культуру ППК методом сортинга. Провели три технических повторов, в которых достоверно показано, что SSEA1-положительные клетки составляют примерно 86% культуры. После получения чистой линии ППК удалось культивировать в течение нескольких пассажей, что дало возможность провести следующий этап дифференцировки в сторону гаплоидных клеток -показано наличие маркера инициации мейоза STRA8 в колокализации с поздним маркером ППК VASA.Дальнейшая дифференцировка в сторону мейозного деления invitro полученных ППК продолжается разрабатываться. Подбираются условия и ростовые факторы, индукторы для оптимальной дифференцировки.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: При исследовании механизмов регуляции регенерации нейральной сетчатки из пигментного эпителия глаза наблюдали действие кондиционированной среды (КС) регенератов сетчатки тритона на клетки пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) человека. Исследованы действия 50% и 25% концентраций кондиционированной среды. Выявлено, что КС вызывают дедифференцировку клеток ПЭС: клетки теряют маркер эпителиальных клеток Сх43, в них повышается экспрессия маркеров плюрипотентности Oct4, KLF4. Наряду с дедифференцировкой, некоторые клетки проявляют признаки дифференцировки в нейральном направлении - наблюдается положительное окрашивание отдельных клеток на, повышается экспрессия TUBB3, выявленная методом ПЦР в реальном времени. Продолжено изучение свойств везикулярных частиц индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека. Модифицированна методика выделения везикулярных частиц, основанная на многоступенчатом центрифугировании кондиционированной среды, полученной в ходе культивирования ИПСК, и последующем ультрацентрифугировании супернатанта, что позволяет получать стабильные концентрации везикул 1.7х1011- 2.0х1011 частиц/мл. Используя метод количественного ПЦР анализа в реальном времени, было проведено сопоставление ряда характеристических маркеров в ИПСК и полученных от них везикулярных частицах. Показано, что при наличии данных маркеров в самих ИПСК, в везикулярных частицах ИПСК выявляются только Lin28 и пороговые значения Sox2. С целью изучения возможного онкогенного потенциала ИПСК, было проведено сопоставление пула онкогенных микро-РНК как в самих ИПСК, так и в везикулах ИПСК. Методом количественного ПЦР анализа в реальном времени показано, что если в самих ИПСК присутствуют такие онкогенных микроРНК, как miR151a-5p, miR486a-5p, miR221-3p, miR21a-5p, то в везикулярных частицах определена только одна микро-РНК - miR221-3p. В качестве модели, на которой возможно оценить функциональный потенциал везикулярных частиц ИПСК человека, были выбраны остановившиеся в развитии ранние зародыши человека (данная часть работы была проведена на базе одной из клиник ЭКО с соблюдением всех требований соблюдения биоэтических норм). Первые эксперименты по добавлению везикулярных частиц ИПСК к среде инкубации остановившихся в развитии (остановка более 1 суток) предимплантационных бластоцист человека и зародышей более ранних стадий (4-х, 8-и клеточные эмбрионы) показали, что только в одном случае из 4 (при остановке развития на 4-х кл.стадии) было получено возобновление дробления (через сутки инкубации в среде, содержащей везикулы ИПСК, зародыш состоял из 5 клеток). На данном этапе работы статистически достоверные данные об эффектах действия везикулярных частиц ИПСК не получены. Разработанный протокол дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в первичные половые клетки приводит к появлению в культуре 85% клеток, положительных по поверхностному маркеру первичных половых клеток SSEA1. Нам удалось получить чистую линию первичных половых клеток. Далее эти же отсортированные по наличию SSEA1 клетки были индуцированы к вступлению в мейоз воздействием ретиноевой кислоты, чтобы проверить полноту дифференцировки. После воздействия ретиноевой кислоты в клетках была показана экспрессия маркеров мейоза, таких как STRA8, SCP1, SCP3, DMC1 и др. Было проведено специальное окрашивание на белок синептонемального комплекса SCP3 в сфероидах, которые были раннее сформированы из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и клеток, дифференцированных в первичные половые. Было показано, что в ядрах дифференцированных клеток наблюдается точечная окраска на SCP3 .
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: Для выявления механизмов де- и трансдифференцировки высокоспециализированных клеток изучали влияние сред, кондиционированных регенератами сетчатки тритонов, паракринно активирующих естественное репрограммирование соматических клеток низших позвоночных, на морфологические и молекулярные изменения клеток ретинального пигментного эпителия человека in vitro. Отмечено изменение морфологии клеток линии пигментного эпителия ARPE-19, сопровождающееся увеличением их размеров и снижением пролиферативной активности. Методом кПЦР показано снижение экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентности OCT4 и NANOG, маркера нейральных стволовых клеток NES, маркера нейроэпителия и РПЭ OTX2, регулятора пролиферативного ответа KLF4 и маркеров дифференцировки РПЭ (BMP4, KRT18) при увеличении мРНК маркера нейробластов TUBB3, специфического регулятора клеточного цикла CCND1 и маркера белка внеклеточного матрикса COL1A1. Иммуноцитохимически выявлено снижение интенсивности окрашивания клеток на коннексин 43 (белок щелевых контактов) при увеличении такового на цитокератин 8 (специфичного для дифференцированного РПЭ) и βIII-тубулин (пан-нейрональный маркер) и изменение распределения β-катенина (ключевого участника канонического Wnt-сигнального пути) по сравнению с контролем. Таким образом, кратковременное воздействие КС регенератов сетчатки тритона активировало в клетках ARPE-19 процессы нейральной дифференцировки и способствовало поддержанию эпителиальной. Проведен анализ современных представлений о механизмах самообновления стволовых клеток и поддержания их плюрипотентного статуса. Проведена работа по оптимизации стратегии количественного ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии генов, ответственных за плюрипотентность и характерных микроРНК. В частности, предложены гены, нормирующие экспрессию генов плюрипотентности при использовании ПЦР-анализ. С целью изучения межклеточной коммуникации и механизмов, обеспечивающих паракринную регуляцию, были охарактеризованы внеклеточные везикулы эмбриональных стволовых клеток человека линии hES-MK05. Показано, что средняя концентрация везикулярных частиц при стандартных условиях культивирования ЭСК человека линии hES-MK05 составляет 4,6х1011 частиц/мл. Размерный диапазон частиц лежит в пределах от 30 до 380 нм, с максимальной концентрацией данных частиц в области 40-140 нм, что соответствует фракции экзосом и мелких везикул. При сравнении с внеклеточными везикулами индуцированных плюрипотентных клеток человека (клеток со вторичной плюрипотентностью) впервые показано, что фракция везикулярных частиц ЭСК человека линии hES-MK05 содержит большее количество мелких микровезикул, в отличие от фракции везикулярных частиц иПСК. При сравнении профиля основных характеристических белков (маркерных) плюрипотентности методом количественного ПЦР-анализа в реальном времени показано наличие маркеров плюрипотентности (Oct4, Sox2, Nanog, LIN28) как в самих ЭСК человека линии hES-MK05, так и в их везикулярных частицах, что отличает их от везикулярных частиц иПСК, содержащих лишь следовые количества некоторых маркеров (Sox2 и LIN28). При исследовании возможности половой диффференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток показано, что полученные in vitro мейоциты окрашиваются на маркеры мейоза STRA8 и SCP3. Используя метод давленных препаратов, обнаружили , что SCP3 точечно окрашивает ядро и обнаруживается в цитоплазме мейоз- индуцированных клеток, причем последнее не свойственно для этого маркера. Кроме того, показано, что мейоцит-подобные клетки окрашиваются на поздние маркеры первичных половых клеток (VASA и DAZL). Проанализировав транскриптом ИПСК, первичных половых клеток и мейоцитов выявили кардинальное изменение в характере экспрессии генов, свойственные каждой исследуемой группе. Генная онтология показала, что повышена экспрессия генов, связанных с пролиферацией, миграцией, развитием гонады женского типа и тд... В рамках исследования возможностей разработки тканевых моделей для регенеративной биомедицины исследовали тканевую модель живого эквивалента кожи in vitro. Методом методом проточной цитометрии выявлена тенденция к увеличению процента кератиноцитов с фенотипом стволовых CD71-/intβ4+ после криохранения. Методом rtPCR показано снижение экспрессии генов интегрина α6 и интегрина β1 в культуре кератиноцитов на 1 сутки послеразморозки и увеличение экспрессии гена интегрина α6 к 7 суткам. Методом CFE(colony forming efficiency)установлено, что количество голоклонов/мероклонов/ параклонов после заморозки (0,59%/1%/2,2%) значительно превышает их количество до заморозки (0,04%/0,18%/1,3%).
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: Продолжено исследование пронейральной дифференцировки клеток ретинального эпителия человека (ARPE-19) in vitro под влиянием влияния кондиционированных сред регенератов сетчаток тритона (КС). кПЦР показал снижение экспрессии OTX2 и BMP4 (маркеров клеток ретинального эпителия уже через 24 ч после воздействия КС наряду с ослаблением межклеточных контактов, что свидетельствовало о частичной потере эпителиальной дифференцировки. Стимуляция клеток к нейральной дифференцировке отмечена повышением уровня экспрессии генов TUBB3, NES, PAX6 и усилением иммуноокрашивания на белок βIII-тубулин на фоне понижения экспрессии BMP2 и BMP4. Однако затем, ввиду краткосрочного воздействия КС, наблюдалось снижение транскрипции нейрональных маркеров (TUBB3, NES, PAX6) и увеличение транскрипции маркеров РПЭ (OTX2, MITF), что, вероятно, связано с возвратом клеток к исходной дифференцировке. Путем дифференцировки индуцированных плюрипотентных клеток (ИПСК) человека после индукции ретиноевой кислотой (РК) в подобранных условиях культивирования получены женские примордиальные половые клетки (чППК), в которых определяется экспрессия белков VASA (маркера поздних ППК) и STRA8 (маркера начала мейоза), что указывает на созревание чППК. Транскриптомный анализ показал также активацию генов-маркеров мейоза (SCP2/3, REC8, MSX1/2, MAEL, DUSP18). Однако, несмотря на точечную окраску белка SCP3 - маркера синаптонемного комплекса и гомологичной рекомбинации, ранних синаптонемных комплексов не обнаружено. При исследовании влияния криоконсервирования на компартмент стволовых клеток эпидермиса человека в рамках разработки живого эквивалента кожи проведено иммунофенотипирование культуры кератиноцитов человека до и после криохранения. После разморозки культура на 75-98% состояла из клеток базального слоя, положительных по субъединице интегрина α6. Прослежена динамика изменение уровня экспрессии генов интегринов α6 методом rtPCR, количества самих белков методом Western-Blot, а также иммуногистохимически количества клеток с фенотипом стволовых (CD71-/integrinα6+) до и после криохранения (1, 3 и 7 сутки после разморозки). Показано, что на 7 сутки после выхода из криохранения, когда в культуре предположительно произошло восстановление кинетического баланса, она успешно субкультивируется, переходя в состояние экспансии и образуя большое количество всех типов клонов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".