Разработка высокоселективных сепарационных материалов для контроля содержания биологически активных веществ в объектах со сложными матрицамиНИР

Development of highly selective separation materials for controlling the contents of biologically active compounds in the samples with complex matrices

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 октября 2018 г.-30 сентября 2019 г. Разработка высокоселективных сепарационных материалов для контроля содержания биологически активных веществ в объектах со сложными матрицами
Результаты этапа: Первый год выполнения проекта был посвящен разработке новых подходов для повышения селективности сепарационных материалов для ионной и гидрофильной хроматографии, а также изучению влияния структуры получаемых функциональных слоев на хроматографические свойства сорбентов, выявлению оптимальных структур и определению областей практического применения сорбентов с наилучшими характеристиками. 1-2) Были разработаны новые силикагелевые сорбенты для прямого определения аминокислот с различной толщиной функционального слоя и различными заместителями в функциональном слое: диольными, цвиттерионными, мономерными и полимерными аминами. Было изучено удерживание аминокислот на полученных сорбентах, подобраны оптимальные условия разделения и определения аминокислот на всех новых сорбентах, в том числе тип и содержание органического растворителя в подвижной фазе; тип, кислотность и концентрация буферного раствора с учетом его растворимости в водно-органической среде; фон пробы, содержащей аминокислоты, с учетом их оптимального разрешения, чувствительности определения и растворимости в элюенте; условия изократического или градиентного элюирования. А) Сорбенты с моно- и полиаминами в функциональном слое, в том числе сшитыми или кватернизованными: В качестве реагентов для создания поверхностного функционального аминослоя использовали этилендиамин (ЭДА), диэтилентриамин (ДЭТА), а также разветвленный полиэтиленимин (ПЭИ). Синтезированы и изучены 6 сорбентов для гидрофильной хроматографии с различной структурой аминированного функционального слоя: с мономерным (сорбент с пространственно удалёнными от матрицы первичными и вторичными аминогруппами – Б-ЭДА, с третичными, вторичными и первичными – Б-ДЭТА) и полимерным (Б-ПЭИ) функциональным аминослоем с соотношением матрица: полимер 1:0,6 и 1:0,01, в том числе с последующим модифицированием разветвленного функционального слоя ПЭИ глицидолом (Б-ПЭИ-Гл) и 1,4-БДДГЭ (Б-ПЭИ-Б) в случае 1:0,6ПЭИ. Использование глицидола приводит к дополнительной гидрофилизации поверхностного функционального слоя, а бифункционального эфира 1,4-БДДГЭ гидрофилизует, но в то же время позволяет получить менее гидратированный слой за счет сшивания поверхностных аминогрупп и их экранирования гидрофобным фрагментом. Модифицирование функционального слоя ПЭИ также позволяет избежать возможного образования оснований Шиффа с карбонильными соединениями благодаря замещению первичных аминогрупп на поверхности неподвижной фазы. При выборе оптимального состава подвижной фазы содержание фосфатного буферного раствора в подвижной фазе варьировали от 10 до 25 об. %. Причиной выбора фосфатного буферного раствора является отсутствие поглощения при длине волны 210 нм, применяемой для УФ-детектирования, что обеспечивает стабильность базовой линии. Сорбент Б-ЭДА существенно менее гидрофильный по сравнению с другими аминофазами, времена удерживания аналитов малы, поэтому он неперспективен для прямого определения аминокислот. Сорбент Б-ПЭИ показал более высокую эффективность (до 13000 тт/м) и селективность разделения смеси аминокислот: возможно разделение 8 аминокислот (фенилаланин, метионин, пролин, тирозин, аспарагин, серин, аланин, аспарагиновая кислота). На остальных неподвижных фазах удалось разделить меньшее количество аминокислот. Оптимальный состав подвижной фазы для сорбентов Б-ПЭИ, Б-ПЭИ-ГЛ и Б-ПЭИ-Б составил 85:15, об. % ацетонитрил: вода. При повышении содержания водной составляющей ухудшается разрешение слабоудерживаемых аминокислот, а при понижении водной доли наблюдается размывание пиков и снижение эффективности. На сорбенте Б-ДЭТА возможно разделить лишь 6 аминокислот, при увеличении содержания буферного раствора в подвижной фазе хроматографические пики пары аминокислот фенилаланин/метионин не разрешаются. Таким образом, для эффективного и селективного разделения аминокислот показана необходимость создания полимерного аминированного функционального слоя ПЭИ, ковалентно прикрепленного к силикагелевой матрице; дальнейшая его кватернизация или сшивка не требуется. А уменьшение толщины функционального слоя ПЭИ до 1:0,01 позволило повысить эффективность по аминокислотам до 40000 тт/м. Для анализа основных аминокислот: гистидин, аргинин, лизин – оптимальное содержание буферного раствора в подвижной фазе составило 25%, так как существенно возрастало их удерживание из-за большей гидрофильности (log P (His) = -3,22; log P (Lys) = -3,0; log P (Arg) = -4.0. Для разделения этих аминокислот сорбент Б-ПЭИ-ГЛ, модифицированный глицидолом, продемонстрировал лучшее разрешение и симметрию пиков (коэффициенты ассиметрии 0,8-1,1). Б) Диольные сорбенты: Синтезированы два сорбента для гидрофильной хроматографии на основе силикагеля с диольными функциональными группами. Для этого проведено ковалентное модифицирование 3-аминопропилсиликагеля диглицидиловым эфиром резорцина (РДГЭ) и 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром (1,4‑БДДГЭ), в результате получены новые сорбенты с поверхностными диольными функциональными группами, различающиеся гидрофобностью спейсера. В качестве оптимальных условий разделения установлены следующие: состав подвижной фазы – 12% 1мМ фосфатный буферный раствор, pH 6,5 / 88% ацетонитрила; скорость – 1,0 мл/мин; размер колонки 3×100 мм; УФ-детектирование при λ=210 нм. Сорбент с более гидрофильным спейсером продемонстрировал более высокую эффективность (до 30000 тт/м), селективность и экспрессность при разделении модельной смеси 7 аминокислот: время разделения составило менее 7 мин. В) Цвиттер-ионные сорбенты: Синтезированы новые цвиттер-ионные сорбенты путем ковалентного модифицирования аминопропилсиликагеля глицином и аминоэтансульфоновой кислотой (таурином), закрепленными с помощью линкера 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира. В качестве подвижной фазы для разделения аминокислот использовали смесь ацетонитрила и фосфатного буферного раствора. Долю водной фазы варьировали от 10 до 20%. В ходе работы установили, что оптимальные эффективность и селективность разделения при приемлемых временах удерживания достигаются при содержании 12 – 15% водной фазы. Дальнейшее снижение доли водной фазы в элюенте нерационально, поскольку при этом значительно увеличиваются времена удерживания аминокислот и происходит заметное уширение пиков. В ходе работы использовали буферный раствор с концентрацией 1 мМ, которую выбрали по причине ограниченной растворимости в элюенте с большой долей органического растворителя. При выборе оптимальных условий разделения варьировали pH фосфатного буферного раствора. В ходе эксперимента установили, что изменение pH в пределах от 6,5 до 3 существенно не влияет на время удерживания большинства аминокислот, что подтверждает описанный в литературе факт образования внутренних солей группами цвиттер-иона при малой ионной силе раствора и является признаком преобладания распределительного механизма удерживания. Таким образом, в данных условиях использовать различную силу кислот глицина и таурина в структуре сорбента для управления селективностью разделения не представляется возможным. В случае аспарагиновой и глутаминовой кислот удерживание значительно усиливается в кислой среде, что является следствием изменения их ионного статуса за счет протонирования карбоксильных групп аминокислоты (pKa3 (Glu) = 4,25; pKa3 (Asp) = 3,65). Дальнейшее разделение проводили в щадящей для силикагелевой матрицы нейтральной среде – использовали буферный раствор с рН 6,5. С учетом полученных результатов выбрали следующий состав подвижной фазы для разделения смеси аминокислот: ацетонитрил – фосфатный буферный раствор с концентрацией 1 мМ и значением pH 6,5 (соотношение 88:12 по объему). Установлено, что использование глицина в функциональном слое способствует более сильному удерживанию, а также более эффективному (до 20000 тт/м) и селективному разделению 8 аминокислот (лейцина, изолейцина, метионина, валина, тирозина, аспарагина, глицина и аланина) по сравнению с сорбентом, содержащим таурин. На обоих сорбентах наблюдали хорошую симметрию пиков аналитов. Время анализа составило 23 минуты. Важным свойством глицинового сорбента является возможность разделения лейцина и изолейцина, что в ряде случаев необходимо при анализе реальных объектов, однако является сложной аналитической задачей в гидрофильной хроматографии. С использованием полученной колонки, заполненной сорбентом, модифицированным глицином, разделение лейцина и изолейцина осуществляется менее чем за 4,5 мин. Установлено также, что для обеспечения симметричной формы пиков аналитов и воспроизводимости хроматограмм, а также обеспечения растворимости аминокислот в подвижной фазе содержание водной доли в фоне пробы не должно превышать таковое в элюенте. Таким образом, среди синтезированных неподвижных фаз сорбент с цвиттер-ионными группами на основе глицина обеспечил лучшую селективность по аминокислотам, позволив разделить большее число слабоудерживаемых кислот. При этом наибольшую эффективность по аминокислотам обеспечил сорбент с тонким полимерным функциональным слоем полиэтиленимина. 3) Была разработана стадия пробоподготовки для различных объектов анализа с учетом условий гидрофильного разделения. Для целей селективного и воспроизводимого гидрофильного разделения содержание воды в пробе после пробоподготовки не должно превышать таковое в подвижной фазе. При этом необходимо учитывать растворимость полярных аналитов в водно-органических элюентах с высокой долей ацетонитрила. Поэтому для всех классов полярных аналитов требуется разбавление пробы, а высокая эффективность сорбентов обеспечивает их чувствительное определение. Для определения сахаров в сладких, в том числе газированных напитках пробоподготовка включала стадии дегазации объекта на ультразвуковой ванне, отбора 2 мл пробы и разбавления водой в 10 раз, очистки пробы с помощью твердофазной экстракции последовательно на картриджах Chromabond C18 (силикагель, модифицированный октадецильными группами, объем – 3 мл, масса адсорбента – 500 мг, «Macherey-Nagel», Германия) и Chromabond HR-P (высокопористый сополимер полистирола-дивинилбензола, 3 мл/500 мг, «Macherey-Nagel», Германия). Непосредственно перед использованием картриджи промывали 2 мл ацетонитрила и 4 мл воды. После очистки добавляли ацетонитрил в соотношении, соответствующем составу подвижной фазы. В процессе пробоподготовки БАД при определении витаминов таблетку измельчали, с использованием ультразвуковой ванны в течение 15 мин растворяли в 50 мл воды, содержащей 1% ортофосфорной кислоты, а затем добавляли 50 мл ацетонитрила. После этого проводили центрифугирование водно-органической вытяжки, фильтрование от нерастворенных компонентов и разбавление аликвоты до соотношения водной и органической фаз, соответствующего составу элюента на начальной стадии градиента. В ходе пробоподготовки измельчали капсулу препарата спортивного питания, содержащего аминокислоты, в течение 20 мин с использованием ультразвуковой ванны растворяли в 200 мл воды, после чего добавляли 50 мл ацетонитрила и фильтровали от нерастворенных компонентов на пористом стеклянном фильтре. Из полученного фильтрата отбирали аликвоту и разбавляли до соотношения водной и органической фаз, соответствующего составу элюента. 4-5) Были разработаны подходы для получения высокоселективных анионообменных сепарационных материалов на основе полимерных матриц для определения органических кислот в различных объектах. Для повышения селективности к одно- и двухзарядным органическим кислотам впервые предложено использования ди- и триаминов различной структуры и степени замещенности при формировании гиперразветвленных слоев, а также введения цвиттерионных заместителей в функциональные слои таких материалов. Достоинством подхода является возможность дополнительно регулировать селективность сорбентов за счет выбора кватернизующего агента различной структуры из класса эпоксидов и алкилгалогенидов для используемых аминов, что дает большую вариативность структуры функционального слоя. Данный этап работы включал выбор условий синтеза, структуры амина в каждом цикле модифицирования, кватернизующего агента и положения конкретного типа амина в функциональном слое, а также установление зависимостей удерживания органических кислот от этих параметров и выбор температурного режима. Были изучены хроматографические свойства новых сепарационных материалов для определения органических кислот в изократическом и градиентном режиме с использованием карбонатных и гидроксидных подвижных фаз. Был выявлен преимущественно ионообменный механизм удерживания органических кислот на полученных фазах, а также проведена сравнительная оценка селективности и эффективности полученных материалов для выявления зависимостей этих параметров от структурных особенностей функционального слоя. Была также изучена зависимость удерживания органических кислот от температуры. При получении сорбентов для формирования гиперразветвленного слоя проводили 5 циклов модифицирования, включающих алкилирование 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром и аминирование амином. Варьирование структуры слоя осуществляли за счет варьирования амина в первом или в 5-м циклах модифицирования, остальные циклы проводили с использованием метиламина. А) Сорбенты с цвиттерионными фрагментами в структуре слоя Для введения во внутреннюю часть функционального слоя цвиттерионных фаргментов использовали одноосновные аминокислоты - глицин и β-аланин, а также дикарбоновые аспарагиновую и более гидрофобную глутаминовую кислоты – в первом цикле модифицирования. Использование двухосновных кислот позволило увеличить общее число карбоксильных групп в функциональном слое. Было установлено, что гидрофильность в парах моно- и дикарбоновых аминокислот не оказывает серьезного влияния на разделение органических кислот, тогда как увеличение числа карбоксильных групп в структуре гиперразветвленного слоя при использовании дикарбоновых аминокислот в синтезе обеспечивает заметные преимущества. Так, анионообменники AspM4 и GluM4 впервые позволили разделить до базовой линии гликолевую, уксусную, молочную и муравьиную кислоты в режиме ИХ, тогда как в настоящий момент с этой задачей не справляются даже наиболее селективные коммерческие колонки. Это показало, что число карбоксильных групп в структуре аминокислоты, используемой во внутренней части функционального слоя, является ключевым фактором, влияющим на разделение перечисленных органических кислот. Дополнительным преимуществом анионообменников GluM4 и AspM4 стала возможность разделения пропионовой кислоты, хлорита и хлорида до базовой линии, чего было невозможно достичь на сорбентах AlaM4 и GlyM4. Было установлено, что рост температуры приводит к увеличению времен удерживания всех анионов на всех синтезированных анионообменниках. Было отмечено значительное улучшение разрешения нескольких пар одноосновных органических кислот (в частности, уксусной и молочной) на колонке AspM4 размером 250 × 4 мм при повышении температуры с 30 до 50 °С, что также наблюдали и для анионообменника GluM4. Для сорбентов с монокарбоновыми аминокислотами AlaM4 и GlyM4 повышение температуры приводило к ухудшению разрешения молочной и муравьиной кислот вплоть до их совместного элюирования. В связи с этим повышение температуры представлялось выгодным для улучшения разрешения однозарядных органических кислот только на гиперразветвленных анионообменниках с дикарбоновыми аминокислотами во внутренней части функционального слоя. Введение отрицательно заряженных фрагментов в структуру гиперразветвленного слоя обеспечило значительное повышение разделяющей способности гиперразветвленных анионообменников, что позволило разделять многокомпонентные смесей анионов в градиентном режиме элюирования. Б) Сорбенты с различными моноаминами во внешней части гиперразветвленного слоя В качестве еще одного эффективного способа управления селективностью гиперразветвленных сорбентов было предложено варьировать структуру амина, используемого в последнем цикле модифицирования и определяющего строение внешней части гиперразветвленного слоя. При таком подходе гидратация функционального слоя должна зависеть не только от гидрофильности конкретного амина во внешнем слое, но и от его структурных особенностей, таких как число заместителей у атома азота, строение этих заместителей, а также общее число атомов азота в структуре амина. Для оценки влияния первичных и вторичных аминов во внешней части гиперразветвленного слоя на разделение органических кислот сравнивали хроматографические свойства анионообменников M4-EA и M4-DEA, имеющих одинаковую гидрофильность функционального слоя, превышающую гидрофильность сорбента М5. Было отмечено значительное улучшение разрешения пиков органических кислот при использовании вторичного амина во внешней части функционального слоя по сравнению с первичным. Таким образом, вторичные мономерные амины оказались более перспективными реагентами для проведения заключительного цикла модифицирования гиперразветвленных сорбентов. Анионообменник, полученный с использованием вторичного диэтаноламина (ДЭА), позволил разделить 7 одноосновных органических кислот, и единственной парой, которую не удалось разделить, были глюконовая и хинная кислоты. При повышении температуры на сорбентах М4-ЕА и М4-DEA наблюдали улучшение разрешения для пар кислот глюконовая/хинная, шикимовая/гликолевая, уксусная/молочная и муравьиная/галактуроновая. Однако низкое значение тангенса угла наклона зависимости Вант-Гоффа (lnk’ – 1/T) для муравьиной кислоты по сравнению с молочной (650 и 990, соответственно) приводило к ухудшению разрешения этих кислот, что было особенно критично для анионообменника M4-DEA. Это свидетельствовало о том, что повышение температуры не является целесообразным при использовании сорбента М4-DEA для анализа объектов, в которых требуется определение этих кислот при совместном присутствии. Благодаря повышенной селективности по отношению к одноосновным органическим кислотам, анионообменник M4-DEА оказался наиболее перспективным вариантом для разделения многокомпонентной смеси органических кислот и неорганических анионов. На данном сорбенте впервые стало возможным одновременное определение неорганических анионов и расширенного набора органических кислот, которые представляют повышенный интерес при контроле качества фруктовых соков, пюре, виноматериалов, вина и других напитков и алкогольной продукции и не могут на сегодняшний день быть разделены с помощью наиболее селективных коммерческих анионообменников для ИХ. В) Сорбенты с различными диаминами во внешней части гиперразветвленного слоя В данной работе было впервые предложено использовать некватернизованные диамины с первичными и вторичными аминогруппами во внешней части гиперразветвленного слоя для управления селективностью анионообменников. Из выбранных для синтеза диаминов этилендиамин (ЭДА) содержал только первичные, а бис(гидроксиэтил)этилендиамин (БГЭЭДА) – только вторичные аминогруппы, вследствие чего их присоединение к оксирановому кольцу могло происходить лишь одним способом. В то же время присоединение (2-аминоэтил)аминоэтанола (AЭAЭ), имеющего несимметричную структуру, могло происходить как через первичный, так и через вторичный атом азота в его структуре с образованием вторичных и третичных аминогрупп, соответственно. Хорошая воспроизводимость хроматографических свойств анионообменника М4-АЕАЕ позволила предположить, что соотношение образующихся вторичных и третичных аминогрупп во внешней части функционального слоя остается постоянным. Было установлено, что увеличение гидрофильности диамина во внешней части функционального слоя от ЭДА до БГЭЭДА приводит к значительному снижению селективности для пар фторид/хинная, гликолевая/уксусная и уксусная/молочная кислоты. Наиболее значительное влияние диамина выражалось в изменении порядка элюирования лактата, формиата и галактуроната, а также в снижении относительного удерживания пропионовой кислоты. Для всех гиперразветвленных анионообменников вне зависимости от структуры гиперразветвленного слоя наибольший сдвиг относительного удерживания (то есть самые высокие значения тангенсов угла наклона зависимостей Вант-Гоффа) при повышении температуры происходил для галактуроновой и молочной кислот, а наименьший – для муравьиной, что могло влиять на порядок элюирования для тройки молочная/муравьиная/галактуроновая кислоты. На основании этих данных был сделан вывод, что необходимость повышения температуры до 50 ºC в основном определяется порядком элюирования и разрешением этих кислот при начальной температуре 30 ºC. Анионообменники с диаминами во внешнем части гиперразветвленного слоя демонстрировали лучшую разделительную способность по отношению к двухосновным органическим кислотам по сравнению с сорбентами, содержащими аминокислоты во внутренней части слоя (AspM4 и GluM4) или мономерные амины во внешней части (M4-EA и M4-DEA), а также практически не уступали им с точки зрения разделения одноосновных органических кислот. Так, на сорбенте М4-АЕАЕ удалось разделить в общей сложности 25 органических кислот и неорганических анионов при работе в градиентном режиме элюирования. Это подтвердило большой потенциал подхода, предполагающего использование диаминов для формирования внешней части гиперразветвленного слоя, для достижения хорошего разрешения аналитов, представляющих повышенный интерес при анализе реальных образцов в различных областях – в первую очередь, в пищевой промышленности и индустрии напитков. 6) Были синтезированы и изучены сорбенты с различными заместителями у атома азота для разделения и определения водорастворимых витаминов и углеводов. Были установлены условия удерживания и разделения этих классов веществ в режиме ГИХ на сорбентах с различной структурой функционального слоя: с разветвленным, кватернизованным и сшитым полимерными слоем, диольными, амино- и цвиттерионными фрагментами в структуре неподвижной фазы. А) Разделение сахаров на новых сорбентах: Для изучения хроматографических параметров синтезированных неподвижных фаз использовали модельную смесь сахаров (рибоза, глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, лактоза). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и деионизованной воды. Детектирование осуществляли с помощью рефрактометрического детектора. Содержание воды в подвижной фазе варьировали от 10 до 15 об.%. Диольные сорбенты и Б-ЭДА не обеспечили достаточное удерживание, селективность, эффективность и форму пиков сахаров, потому не перспективны для определения этого класса аналитов. Среди аминофаз в случае более гидрофильного сорбента Б ПЭИ ГЛ оптимальное соотношение CH3CN: H2O, позволяющее разделить модельную смесь пяти сахаров менее чем за 8 мин, составило 85:15, об. %. Для менее гидрофильных сорбентов Б-ДЭТА и Б-ПЭИ необходимо уменьшение водной доли в элюенте для разрешения всех компонентов смеси: 88:12, об. % CH3CN: H2O. При повышении содержания водной составляющей ухудшается разрешение фруктозы и глюкозы, а при понижении – размывание пиков и уменьшение эффективности. Для более гидрофобного Б ЭДА разделение проводили при содержаниях воды 10 и 7 %. Такой мономерный слой ЭДА, а также менее гидратированный сшитый функциональный слой в случае сорбента, модифицированного 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром, не обеспечивают приемлемого удерживания сахаров (рис.2, Г, Д), неселективны и неэффективны при разделении полярных аналитов по распределительному механизму. Как было видно из полученных хроматограмм, сорбенты Б-ДЭТА, Б-ПЭИ и Б-ПЭИ-ГЛ имеют симметричную форму пиков (коэффициенты асимметрии составляют 0,7–1,3) и обеспечивают хорошее разрешение пиков сахаров. Самую высокую эффективность разделения сахаров (до 10000 тт/м) продемонстрировал сорбент, модифицированный глицидолом, благодаря гидрофилизации функционального слоя, которая способствует созданию большей толщины приповерхностного водного слоя. Согласно литературным данным, механизм удерживания для сахаров – распределительный, тем самым богатый водный слой на сорбенте Б-ПЭИ-ГЛ способствует лучшему удерживанию и разделению сахаров. Среди цвиттер-ионных неподвижных фаз сорбент, модифицированный таурином, продемонстрировал схожую с аминофазами селективность и эффективность. Использование глицина в функциональном слое сорбента привело к значительному повышению эффективности (до 30000 тт/м) по сахарам и позволило разделить 7 углеводов (рамнозу, ксилозу, фруктозу, глюкозу, сахарозу, лактозу, раффинозу) за 16 минут при использовании в качестве подвижной фазы смеси CH3CN: H2O 90:10, об. %. Таким образом, цвиттер-ионный сорбент, содержащий глицин в функциональном слое, оказался предпочтительным для определения сахаров. Б) Разделение витаминов на новых сорбентах: В работе изучали селективность полученных сорбентов к разделению водорастворимых витаминов: тиамина (B1), рибофлавина (B2), никотиновой кислоты и никотинамида (B3), пиридоксина (B6), цианокобаламина (B12) и аскорбиновой кислоты (C). На основании литературных данных в качестве подвижной фазы решили использовать смесь ацетонитрила с водным ацетатно-аммонийным буферным раствором, поскольку ацетаты хорошо растворимы в водно-органических смесях и позволяют создавать высокую ионную силу в таких растворах. Возможность варьирования ионной силы подвижной фазы в широком диапазоне важна для селективного разделения водорастворимых витаминов, различающихся по физико-химическим свойствам и обладающих разным ионным статусом в условиях хроматографирования. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора на длине волны 270 нм. При выборе оптимальных условий разделения витаминов варьировали pH буферного раствора, его концентрацию и долю водного компонента в подвижной фазе. Выбранные условия разделения смеси витаминов - использование в качестве элюента смеси CH3CN – 100 мМ ацетат аммония с рН 5,2 - 6,2 и различными программами градиентного элюирования, определяющимися природой сорбента. Изучены хроматографические свойства полученных аминированных сорбентов на примере водорастворимых витаминов (никотинамида, B1, B2, B6, B12, C и никотиновой кислоты). Лучшую эффективность (до 20000 тт/м) и симметрию пиков продемонстрировал сорбент, модифифицированный глицидолом. Лучшее разрешение пиков слабоудерживаемых пиков наблюдается на сорбенте с разветвленным слоем полиэтиленимина. Диольный сорбент с более гидрофобным спейсером РДГЭ продемонстрировал меньшую эффективность (10000 тт/м по сравнению с 20000 тт/м для 1,4-БДДГЭ), но лучшие селективность и экспрессность при разделении модельной смеси 7 водорастворимых витаминов, время анализа составило 6 мин. Эффективность цвиттер-ионного сорбента, модифицированного таурином, в два раза превысила таковую для сорбента с глицином, и составила до 20000 тт/м. При этом времена анализов модельных смесей витаминов составили 8 и 13 минут на сорбентах Б-ГЛ и Б-АСК соответственно. Таким образом, для определения водорастворимых витаминов наилучшим сочетанием высокой эффективности, селективности, симметрии пиков, условий элюирования и экспрессности обладает диольный сорбент с 1,4-БДДГЭ. Цвиттер-ионный сорбент с таурином также перспективен для разделения этого класса аналитов. 7) Изучены механизмы удерживания на всех колонках с полученными сорбентами путем варьирования доли водного компонента в подвижной фазе. В качестве модельных веществ использовали цианокобаламин, никотиновую и аскорбиновую кислоты. Вклад электростатического механизма оценивали по тангенсу угла наклона билогарифмических зависимостей факторов удерживания модельных витаминов от концентрации буферного раствора, которую варьировали от 10 до 100 мМ. Установлен адсорбционный механизм удерживания для модельных витаминов на диольных сорбентах Б и Р с существенным вкладом ионообменных взаимодействий для никотиновой и аскорбиновой кислот, который более выражен в случае гидрофобного спейсера РДГЭ. В случае кислотных витаминов на цвиттер-ионных сорбентах при высоких концентрациях водной фазы зависимость перестает быть линейной, и удерживание слабо меняется с увеличением ее доли. Большие величины тангенсов углов наклона (-0,6) полученных билогарифмических зависимостей указывают на существенный вклад электростатических взаимодействий в удерживание этих соединений в режиме гидрофильной хроматографии. Для цианокобаламина установлен адсорбционный механизм удерживания без вклада электростатических взаимодействий. Показано, что создание полимерного аминированного слоя приводит к увеличению вклада электростатических взаимодействий в удерживание кислотных аналитов по сравнению с введением мономерным аминов, а его сшивание – практически к устранению вклада распределительного механизма и других типов взаимодействий, обеспечивая преимущественно ионообменный механизм удерживания. Для незаряженных и цвиттер-ионных соединений гидрофилизация слоя полиамина приводит к удерживанию по распределительному механизму. В случае цвиттер-ионных сорбентов установлен смешанный механизм удерживания нейтральных аналитов – сахаров. На основании полученных данных о хроматографических свойствах сорбентов определены следующие области их практического применения: определение полярных незаряженных веществ, например, углеводов в алкогольных и безалкогольных напитках (вина, коньяки, ликеры, фруктовые соки, газированные воды, чайные напитки); соединений цвиттер-ионного и кислотного характера, а также нейтральных (например, водорастворимых витаминов, аминокислот, сахаров) в различных объектах фармацевтической и пищевой промышленности (лекарственных препаратах, перфузионных растворах, БАД, препаратах спортивного питания).
2 1 октября 2019 г.-31 декабря 2020 г. Разработка высокоселективных сепарационных материалов для контроля содержания биологически активных веществ в объектах со сложными матрицами
Результаты этапа: Второй год выполнения проекта включал усовершенствование хроматографических свойств сорбентов, полученных на первом этапе, на основании выявленных тенденций в удерживании целевых классов аналитов, а также оценку стабильности, воспроизводимости синтеза и практическое применение полученных материалов в анализе реальных объектов. 1) Проведена оценка возможности использования гиперразветвленных функциональных слоев для получения сорбентов для ГИХ. Разработаны подходы для закрепления таких слоев на поверхности силикагелевых матриц и выбрана оптимальная структуры слоя для разделения каждого класса биологически активных соединений. Получены новые гиперразветвленные функциональные слои на поверхности силикагея путем ковалентного модифицирования. Полученные сорбенты обозначены: SiO2-Б-ПЭИ-ГЛ, SiO2-2Б-ПЭИ-ГЛ, SiO2-3Б-ПЭИ-ГЛ. Сравнение эффективности сорбентов показало, что наибольшей эффективностью обладают сорбенты SiO2-Б-ПЭИ-ГЛ и SiO2-3Б-ПЭИ-ГЛ, обеспечивающие от 15 000 до 40 000 тт/м по водорастворимым витаминам, а также хорошую симметрию пиков: As 0,8-1,2. Сорбент SiO2-Б-ПЭИ-ГЛ демонстрирует меньшие коэффициенты удерживания и стабильность базовой линии, что позволяет проводить анализ смеси витаминов за меньшее время – 14 минут при использовании градиентного элюирования составом: от 8% 50мМ ацетатно-аммонийный буферный раствор, pH 5.8 (А) – 92% ацетонитрил (Б), до 25% А с 4 по 5 минуту анализа, 25% А - до 15-ой минуты, скорость потока 0,67 мл/мин, спектрофотометрическое детектирование при λпогл. = 270нм (рис.1). Селективность для слабоудерживаемых витаминов (никотинамид, пиридоксин, тиамин, рибофлавин) уменьшается при увеличении степени разветвленности функционального слоя, что может быть вызвано пространственным удалением от поверхности силикагелевой матрицы. Селективность по кислотным витаминам в случае аскорбиновой и никотиновой кислот увеличивается, что может быть связано с увеличением количества анионообменных центров в случае гиперразветвленного сорбента SiO2-3Б-ПЭИ-ГЛ. При этом отмечено ухудшение вида хроматограммы с увеличением длины спейсера 1,4-БДДГЭ, что может быть вызвано нестабильностью и подвижностью слоя полиэтиленимина при прикреплении его к сильно разветвлённому спейсеру, а также увеличением количества сшивок в структуре функционального слоя. Проведенные тесты Танака для гидрофильных неподвижных фаз показали высокую гидрофильность, одинаковую метиленовую, гидроксильную, конфигурационную селективность и основный характер полученных сорбентов, а также большие значения анионообменной селективности. Таким образом, предложенная структура функционального слоя позволяет экранировать отрицательный заряд силикагелевой матрицы и обеспечить достаточную гидрофилизацию поверхности, поэтому является перспективной для получения гидрофильных сорбентов на основе гидрофобных матриц, таких как ПС-ДВБ. 2) Проведена оценка возможности использования полимерных и иных типов матриц для сорбентов для ГИХ с целью повышения их стабильности и расширения рабочего диапазона рН (вплоть до 0-14). Данный этап предполагает выбор условий эксплуатации сорбентов при определении каждого класса аналитов. Для оценки возможности использования полимерных матриц для создания сорбентов для ГИХ использован подход для формирования наиболее гидрофильного функционального слоя из разработанных (Б-ПЭИ-ГЛ). Синтезирован пробный сорбент для гидрофильной хроматографии на основе гидрофобной матрицы ПС-ДВБ: ПС-ДВБ-Б-ПЭИ-ГЛ. Использование подвижной фазы, установленной как оптимальной для разделения витаминов на сорбентах с силикагелевой основой, обеспечило слишком малые факторы удерживания и недостаточное разделение водорастворимых витаминов. Поэтому выбирали условия разделения, pH варьировали в диапазоне от 3 до 7, использовали аммонийно-ацетатный и аммонийно-формиатный буферные растворы с концентрацией 100мМ, для обеспечения высокой ионной силы подвижной фазы. Полное разделение четырёх слабоудерживаемых витаминов достигалось при pH 3 и 7. Однако при сравнении эффективности выбор был сделан в пользу аммонийно-формиатного буферного раствора с pH 3.0, так как именно в таких условиях пиридоксин (В6) элюировался наиболее эффективно, и улучшалось разрешение пиков. Для нейтральных и цвиттер-ионных полярных аналитов оптимальные составы подвижных фаз были аналогичны таковым для сорбентов на основе силикагеля: 15% вода // 85% ацетонитрил - для углеводов (скорость потока - 1.0 мл/мин, рефрактометрическое детектирование); 18% 10мМ фосфатный буф. р-р, pH 6.5 // ацетонитрил, скорость потока - 1.0 мл/мин, УФ-детектирование при λ=210 нм – для аминокислот. Показано, что выбранная структура гиперразветвленного слоя обеспечивает хорошую гидрофилизацию и достаточное экранирование гидрофобной матрицы ПС-ДВБ, благодаря чему возможно разделение 5 модельных сахаров (рибоза, фруктоза, глюкоза, сахароза, мальтоза), 6 аминокислот (фенилаланин, метионин, тирозин, аспарагин, аланин, серин) и 7 витаминов с хорошей симметрией пиков (As 0,8-1,3) и эффективностью до 15 000 тт/м. Тесты Танака для гидрофильных сорбентов показали несколько меньшую по сравнению с прототипом на силикагеле, но тем не менее высокую гидрофильность сорбента ПС-ДВБ-Б-ПЭИ-ГЛ (фактор удерживания уридина kU 2,18 и 2,60, соответственно), одинаковую метиленовую, гидроксильную, конфигурационную селективность и основность, а большие значения анионообменной селективности для сорбента на основе ПС-ДВБ могут быть вызваны гидрофобным характером модельного аниона, используемого в тесте. Хроматограмма водорастворимых витаминов на сорбенте ПС-ДВБ-Б-ПЭИ-ГЛ представлена на рис. 2. Таким образом, на полимерной гидрофобной матрице получен гидрофильный сорбент, достоинствами которого являются устойчвость всем диапазоне рН 0-14 и высокая селективность, обеспечивается хорошая форма пиков полярных веществ и порядок удерживания полярных нейтральных аналитов, сообветствующий режиму гидрофильной хроматографии. Такой сорбент может быть использован для селективного разделения и определения широкого круга полярных соединений, в том числе в кислых и щелочных средах. Предложенный способ синтеза является перспективным подходом для дальнейшего модифицирования полимерных матриц, развития в направлении создания более гидрофильных слоев благодаря экранированию гидрофобной матрицы и последующей дополнительной гидрофилизации внешнего функционального слоя полиэтиленимина. 3) Из всего массива полученных сепарационных материалов по итогам тестирования выбраны сорбенты с наилучшими хроматографическими свойствами для решения конкретных задач по определению веществ ионной и гидрофильной природы. Проведена оценка воспроизводимости синтеза таких сорбентов. Среди разработанных анионообменников с гиперразветвленным функциональным слоем для решения наиболее сложных аналитических задач выбраны наилучшие сорбенты с модифицированной внутренней частью слоя (Gly-M4) и внешней частью слоя (M4-DEA). Для оценки воспроизводимости синтеза наиболее перспективные анионообменники Gly-M4, полученный в результате первого цикла модифицирования с глицином и последующих четырех с метиламином, и M4-DEA, полученный после четырех циклов модифицирования с метиламином и пятого с диэтаноламином, были синтезированы в пяти повторностях. Показано, что для сорбентов Gly-M4 и M4-DEA относительное стандартное отклонение исправленных времен удерживания для фторида, формиата, ацетата и хлорида не превышает 7 и 8 %, соответственно, что является свидетельством достаточно высокой воспроизводимости синтеза, несмотря на большое количество стадий. Таким образом, данная схема синтеза может быть успешно использована для получения анионообменников с воспроизводимыми свойствами. Оценка воспроизводимости сорбентов для ГИХ проведена на примере сорбентов с цвиттер-ионными фрагментами, в качестве аналитов для оценки воспроизводимости времен удерживания использовали сахара и водорастворимые витамины. Для сорбентов с цвиттер-ионным функциональным слоем, содержащим глицин и аспарагиновую кислоту, синтез осуществляли 5 раз, времена удерживания сахаров и водорастворимых витаминов при этом различались на 5-8% с сохранением селективности разделения модельных смесей аналитов, эффективность – в пределах 10-15%. Для гидрофильных сорбентов, содержащих полимерный функциональный слой ПЭИ, времена удерживания сахаров и водорастворимых витаминов при этом различались на 6-10% с сохранением селективности разделения модельных смесей аналитов, эффективность – в пределах 10-20%. Следует отметить, что эффективность в значительной степени зависит от качества упаковки колонки, поэтому данный разброс может быть существенно уменьшен в дальнейшем при оптимизации условий упаковки колонок для каждого конкретного типа сорбентов. Незначительный разброс времен удерживания свидетельствует о возможности успешно использовать предложенные подходы к синтезу для получения новых сорбентов для ГИХ с воспроизводимыми свойствами. 4) Осуществлены работы по выбору условий эксплуатации для всех типов разработанных сорбентов (состав водно-органической смеси; тип, кислотность и концентрация буферного раствора с учетом его растворимости в водно-органической среде; фон пробы с учетом их оптимального разделения, растворимости в элюенте и необходимой чувствительности определения; условия изократического или градиентного элюирования) и одновременного детектирования целого класса веществ. В режиме ИХ: Проведена работа по подбору условий градиентного элюирования для разделения максимального числа компонентов на анионообменнике M4-DEA. Слабоудерживаемые органические кислоты элюировались на начальном участке при концентрации КОН 4 мМ, после чего производили плавный подъем концентрации до 20 мМ за 30 мин. Данные условия элюирования обеспечивали оптимальное разделение сульфат-иона и двухзарядных органических кислот (яблочной, янтарной, винной, щавелевой), которые содержатся в разнообразных напитках. Для элюирования трехзарядных анионов (фосфат, цитрат, изоцитрат) за приемлемое время необходимо было дальнейшее увеличение концентрации элюента до 40 мМ, при этом оно не должно было быть резким для возможности разделения данных аналитов и нитрат-иона. Подобранные условия элюирования (рис. 3) обеспечили разделение смеси из 23 неорганических анионов и органических кислот за 125 мин, однако стоит отметь, что данные условия подобраны для демонстрации максимальных возможностей колонки и подходят для скринингового анализа образцов неизвестного состава. В случае рутинного анализа одного вида образцов, не содержащих весь набор компонентов модельной смеси, условия могут быть скорректированы для уменьшения времени анализа в 1,5-2 раза. В режиме ГИХ: С помощью изменения состава подвижных фаз можно варьировать селективность по полярным веществам на одной и той же неподвижной фазе. Среди полученных сорбентов лучшие факторы удерживания и селективность по нейтральным полярным аналитам – сахарам – в режиме гидрофильной хроматографии продемонстрировал цвиттер-ионный сорбент Б-А, содержащий аспарагиновую кислоту. При составе подвижной фазы с составом вода: ацетонитрил 10:90 об.% разделение 6 сахаров (рамнозы, ксилозы, фруктозы, глюкозы, сахарозы и лактозы) осуществлялось за 14 мин, время анализа может быть сокращено почти в 2 раза при увеличении доли воды в элюенте до 15 об.% с сохранением разрешения пиков сахаров. Установлено, что при переходе к таким водно-органическим подвижным фазам после работы с буферными растворами требуется промывание колонок с сорбентами элюентом, содержащим только воду и ацетонитрил в требуемом объемном соотношении, в течение 3 ч со скоростью 1 мл/мин. Эффективность сорбента Б-А по сахарам составила до 30000 тт/м и сопоставима с таковой для сорбента Б-Гл, содержащего глицин. Для разделения аминокислот на разработанных сорбентах в режиме гидрофильной хроматографии с УФ-детектированием требуется использование элюентов, содержащих фосфатный буферный раствор. Поскольку растворимость фосфатов в водно-органических смесях ограничена, необходимо использовать небольшие концентрации в составе подвижных фаз: не более 2 мМ при содержании воды 10%, не более 10 мМ при 15-18% воды, не более 20 мМ при 20-25% воды в элюенте. Увеличение доли воды в элюенте, а также уменьшение рН буферного раствора приводят в обоих случаях к уменьшению времен удерживания аминокислот и ухудшению селективности. Лучшая селективность разделения аминокислот на полученных сорбентах достигается при использовании фосфатных буферных растворов с рН 6.5 в изократическом режиме элюирования и 15% водной составляющей на наиболее гидрофильном и селективном по аминокислотам сорбенте Б-ПЭИ (возможно разделение 8 аминокислот), 12 % - на цвиттер-ионных сорбентах Б-А и Б-Гл (7 и 8 аминокислот, соответственно). Для определения водорастворимых витаминов и антибиотиков требуются подвижные фазы, содержащие ацетатно-аммонийный буферный раствор. Увеличение доли водного буферного раствора приводит к уменьшению времен удерживания витаминов и селективности. Уменьшение доли воды и концентрации буферного раствора в элюенте приводит к увеличению факторов удерживания кислотных витаминов: аскорбиновой и никотиновой кислот, - что вызывает увеличение времени анализа. Оптимальные времена удерживания и лучшая селективность достигается при содержании 100 мМ буферного раствора в элюенте и градиентом режиме элюирования с увеличением доли водной составляющей в подвижной фазе. Оптимальным с точки зрения селективности разделения аналитов является рН 5,8-6,2 в случае сорбентов на основе силикагеля и рН 3,0 для сорбента на основе ПС-ДВБ. Фон пробы с учетом оптимального разделения, растворимости в элюенте и необходимой чувствительности определения должен совпадать с начальным составом подвижной фазы по содержанию воды как более сильного элюента в гидрофильном режиме разделения. В этом случае обеспечивается достаточная растворимость полярных аналитов и равномерное движение их зон вдоль колонки с сорбентом, благодаря чему не происходит размывания или раздвоения пиков на хроматограмме, сохраняется максимальная эффективность и достаточное разрешение пиков веществ внутри одного класса в составе модельной смеси. Поэтому растворы проб модельных сахаров, а также напитков разбавляли таким образом, чтобы обеспечить фон 10% воды, 90% ацетонитрила. В случае аминокислот – 12% воды, 88% ацетонитрила, для витаминов – 8% воды, 92 % ацетонитрила. Для гликопептидных антибиотиков выбирали условия растворения в водно-органических смесях: для полного растворения требуется сначала растворить антибиотик в деионизованной воде, затем к раствору добавить ацетонитрил до соотношения вода: ацетонитрил 40:60 об.%. Лучшие хроматограммы разделения смесей полярных веществ приведены на рисунках: рис. 1 - для водорастворимых витаминов (SiO2-Б-ПЭИ-ГЛ), рис.3-5 - для антибиотика эремомицина, сахаров и аминокислот, соответственно. 5) Проведено изучение стабильности всех полученных новых сепарационных материалов (для ИХ и ГИХ) в оптимальных условиях эксплуатации при разделении модельных смесей и анализе реальных образцов. Осуществлено изучение стабильности анионообменников Gly-M4 и M4-DEA, предназначенных для анализа реальных объектов. Поскольку подобранные условия градиентного элюирования включали в себя участки как с низким, так и с высоким уровнем концентрации КОН, стабильность при разделении модельных смесей была изучена при двух уровнях концентраций: 5 и 80 мМ КОН. Стабильность оценивали путем непрерывного пропускания элюента через колонку и ежедневного фиксирования исправленных времен удерживания анионов, а также эффективностей их пиков. После пропускания 30 л 5 мМ КОН и 80 мМ КОН наблюдалось некоторое снижение времен удерживания как поляризумеых, так и неполяризуемых анионов на обеих колонках. Для анионообменника Gly-M4 данное снижение составило 3% при концентрации 5 мМ и 5% при концентрации 80 мМ, при этом для сорбента M4-DEA данные значения были несколько выше – 6 и 8%, соответственно. Такое снижение времен удерживания объясняется естественным снижением емкости колонок в процессе эксплуатации, что характеризует и коммерческие анионообменники. Более высокую стабильность сорбента Gly-M4 обусловливает наличие отрицательно заряженных карбоксильных групп аминокислоты у поверхности матрицы, что ограничивает проникновение гидроксид-ионов во внутреннюю часть ионообменного слоя, и, следовательно, уменьшает вероятность его смывания. Таким образом, с точки зрения стабильности анионообменник Gly-M4 превосходит сорбент M4-DEA. При анализе модельных смесей эффективность и селективность обоих сорбентов не изменялась с течением времени, в связи с чем было принято решение об изучении стабильности колонок при анализе реальных объектов. Так после анализа реальных объектов в течение месяца замечено некоторое снижение эффективности, что привело к снижению разрешения между пиками некоторых анионов. Это, вероятно, является следствием загрязнения колонок компонентами пробы, которые не были удалены на стадии пробоподготовки, например, гидрофильными соединениями или ионами металлов. Данная проблема может быть легко устранена при использовании защитных колонок, а также при регенерации колонки 1М раствором щелочи или соляной кислоты. Сорбенты для ГИХ изучали в оптимальных условиях, подобранных для разделения конкретного класса аналитов. Было показано, что разработанные сорбенты сохраняют постоянство хроматографических характеристик в течение не менее 3 месяцев эксплуатации в рекомендованных условиях (рН 3-7 для сорбентов на основе силикагеля). При минимизации смены подвижной фазы и эксплуатации в условиях постоянства состава элюента срок службы колонок составляет не менее 4 месяцев без изменения селективности и без заметного снижения эффективности. Для сорбентов на основе полимерной матрицы было проведена оценка стабильности при высоких (13-14) и низких (0-2) значениях рН, при которых нет возможности работы на традиционных силикагелевых матрицах. Показано, что использование таких подвижных фаз не приводит к изменению эффективности и селективности фазы для ГИХ с гиперразветвленным слоем, что свидетельствует о стабильности не только матрицы, но и привитого функционального слоя. 6) Проведены работы по выбору условий необходимой пробоподготовки реальных образцов и количественного извлечения биологически активных соединений и веществ ионного характера в ИХ и ГИХ. В итоге для анализируемых объектов рекомендованы следующие условия пробоподготовки: Анализ напитков на содержание углеводов в ГИХ: Пробу следует фильтровать через шприцевой фильтр Titan 3 NYLON (0,45 мкм), затем добавлять деионизованной воды и ацетонитрила до общего объема пробы 5 мл и соотношения водной и органической фаз 1:9, соответствующего условиям элюирования. Антибиотики, таблетированные формы в ГИХ: В процессе пробоподготовки капсулу препарата измельчить, в течение 20 мин с использованием ультразвуковой ванны растворить в 500 мл воды, после чего фильтровать на бумажном пористом фильтре. Из полученного фильтрата отобрать аликвоту и разбавить ее до соотношения водной и органической фаз, соответствующего составу элюента на начальной стадии градиента (CH3CN – H2O 80:20, об. %). Препарат спортивного питания, капсулы в ГИХ: В ходе пробоподготовки капсулу препарата измельчить, в течение 20 мин с использованием ультразвуковой ванны растворить в 200 мл воды, затем добавить 50 мл ацетонитрила и фильтровать от нерастворенных компонентов на пористом стеклянном фильтре. Из полученного фильтрата отобрать аликовту и разбавить до соотношения водной и органической фаз, соответствующего составу элюента (CH3CN–H2O 88:12, об. %). Газированный напиток Спрайт в ИХ: Пробоподготовка заключалась в предварительной дегазации пробы с помощью ультразвука. Виноградный сок и вино в ИХ: Пробоподготовка данных напитков заключалась в их предварительном разбавлении в 5 и 50 раз и последующем пропускании разбавленных проб через картридж ПС-ДВБ для устранения гидрофобных или ароматических соединений, которые потенциально могут загрязнить колонку. Исходное разбавление определялось концентрацией определенного компонента в образце. Так, например, из-за высокого содержания винной кислоты в виноградном соке и вине разбавление в 5 раз данных напитков оказалось недостаточным, поскольку определяемые концентрации винной кислоты находились выше максимальной точки градуировочного диапазона. В этом случае требовалось разбавление в 50 раз. Пропускание уже подготовленных проб через картридж с полимерным сорбентом является стандартной процедурой для анализа объектов со сложными матрицами методом ИХ. Противоэпилептический препарат в ИХ: Пробоподготовка образца заключалась в растворении 0,3 г препарата в 100 мл воды. Соль для копчения в ИХ: Раствор соли готовили, растворив 0,5 г образца в колбе объемом 100 мл. 7) Установлены и рекомендованы для практического приложения сорбенты, обладающие наилучшими характеристиками по разделению и количественному определению каждого класса веществ, а также разделению сложных аналитических смесей. Осуществлена разработка методик анализа реальных объектов, представляющих интерес и имеющих ключевое значение в области пищевой промышленности, сельского хозяйства, медицины и фармацевтики. В режиме ИХ: Разработаны методики анализа реальных объектов со сложными матрицами с использованием анионообменников Gly-M4 и M4-DEA. Одним из таких объектов являются высокосолевые растворы, так, в частности, определение бромида в морской воде представляет собой нетривиальную задачу из-за высокого содержания хлорид-иона. Селективность анионобменника Gly-M4 позволила подобрать условия, в которых бромид элюируется значительно позже хлорид- и сульфат-ионов (рис. 6а). Анализ поровой воды Белового моря показал содержание бромид-иона на уровне 5,4 ± 0,1 мг/л. Методика характеризовалась высокой правильностью и воспроизводимостью (внутрисуточная – 0,3%, межсуточная – 1%). Еще одной сложной задачей является определения нитрит-иона на фоне больших содержаний хлорид-иона. Многие коммерческие колонки с химически модифицированными сорбентами для ИХ с подавлением не справляются с такой задачей из-за близких времен удерживания хлорида и нитрита, в связи с чем приходиться прибегать к УФ-детектированию нитрита, что приводит к потере чувствительности. Возможность решения такой задачи на колонке Gly-M4 была продемонстрирована в условиях градиентного элюирования на примере определения нитрит-иона в соли для копчения (рис. 6б). В образце обнаружено 0,62 масс.% нитрит-иона (правильность методики подтверждена методом добавок). Внутрисуточная воспроизводимость составила 0,6%, межсуточная – 1,8%. Селективность анионообменника Gly-M4 позволила использовать его для анализа напитка «Спрайт» (рис. 6в, табл.1). Межсуточная воспроизводимость для указанных анионов не превышала 1,0%, внутрисуточная – 6,5%. Высокая емкость колонки позволяет анализировать подобные объекты без дополнительного разбавления, поскольку даже концентрация цитрата на уровне единиц г/л не перегружает колонку и обеспечивает диапазон линейности не меньше двух порядков. Анионнобменник Gly-M4 также был использован для определения сульфамата и сульфата в противоэпилептическом препарате «Топирамат (рис. 7). Изменение условий элюирования было продиктовано необходимостью отделения сульфамата от слабоудерживаемых органических кислот, которые также являются возможными продуктами деградации топирамата. Результаты анализа подтвердили соответствие препарата заявленным требованиям, содержание сульфамата (0,19 масс.%) не превышало максимально допустимое значение (0,3 масс.%). Продемонстрирована высокая воспроизводимость и правильности методики. Разработана методика анализа фруктовых соков и вин с помощью анионообменника M4-DEA. На предыдущем этапе было показано, что разработанный в ходе проекта анионообменник M4-DЕA позволяет разделять основные слабоудерживаемые анионы (глюконат, хинат, шикимат, гликолят, ацетат, лактат, формиат и галактуронат), которые встречаются в различных напитках. В качестве объектов для анализа были выбран виноградный сок и красное вино. Анализ проводили в условиях градиентного элюирования, подобранных для скринингового анализа образцов неизвестного состава (рис. 8). Продемонстрирована высокая линейность методики, коэффициенты детерминации для всех компонентов были выше 0,995. Пределы обнаружения для исследуемых анионов оказались ниже 0,3 мг/л. Внутрисуточная воспроизводимость оказалась ниже 1,9%, а межсуточная не превышала 2,7% для всех анионов, кроме нитрата. Результаты анализа виноградного сока, произведенного в России на основе красного винограда, методом ИХ с использованием нового анионообменника представлены в табл. 2. Сорбенты для ГИХ: Сорбент с привитым 1,4-БДДГЭ, содержащий поверхностные диольные функциональные группы и положительно заряженные четвертичные аммониевые группы у поверхности силикагелевой матрицы, продемонстрировал лучшие хроматографические характеристики для определения гликопептидных антибиотиков и был использован для анализа реальных объектов – лекарственных препаратов, а также для теста растворения эремомицина как оного из этапов доклинических исследований, показывающего реальную растворимость субстанции эремомицина в желудоно-кишечном тракте (ЖКТ). Определение антибиотиков проводили в следующих лекарственных препаратах: «Ванкомицин» (Красфарма, Россия), «Vancomycin ENTEROCAPS» (Riemser, Германия), «Ванкорус» (Синтез, Россия) и субстанции эремомицина («БиоХиммак СТ», Россия). Хроматограммы объектов приведены на рисунке 9. Результаты количественного определения представлены в таблице 3. Полученные результаты сходятся с заявленными производителями данными. Таким образом, в выбранных условиях возможно проводить определение гликопептидных антибиотиков в фармацевтических препаратах и субстанциях. С применением полученного в проекте сорбента Б также показана хорошая растворимость таблеток «Эремомицин», 250 мг, в ЖКТ, что использовано на первом этапе доклинических исследований этого препарата. Новый сорбент с диольными функциональными группами позволил селективно отделить эремомицин от примесей в составе препарата, а также от полиэтиленгликоля в составе таблеток, который необратимо сорбируется на колонках в обращенно-фазовом режиме ВЭЖХ и делает невозможным определение антибиотиков в этих условиях. Для определения содержания витаминов в реальном объекте применяли сорбент SiO2-Б-ПЭИ-ГЛ, поскольку он показал лучшее разрешение слабоудерживаемых витаминов, достаточно высокую эффективность и селективность. В качестве реального объекта использовали БАД Complex B (Henkel B.V, Нидерланды), в состав которого входят витамины: B1, B2, B3(NAm), B6. Полученные метрологические характеристики методики представлены в таблице 4, а хроматограмма представлена на рис.10. Найденные содержания компонентов согласуются с заявленными производителем (табл.5). Был подобран режим, при котором удалось провести определение четырех витаминов за 3 минуты. Лучшие характеристики для определения аминокислот с точки зрения селективности и экспрессности продемонстрировал сорбент, модифицированный глицином. Разделение незаменимых аминоксилот: лейцина, изолейцина и валина, - возможно в течение 7 мин в изократическом режиме элюирования. Проведен анализ аминокислотного комплекса для спортивного питания BCAA 2250 (Vitalife, Голландия), содержащий в своем составе лейцин, изолейцин и валин. Хроматограмма объекта приведена на рис. 11. Полученные данные по количественному содержанию аминокислот сходятся с заявленными производителем. Применимость сорбента Б-А к количественному анализу реальных объектов показали на примере алкогольсодержащих напитков: белых, красных, розовых вин, ликеров, коньяков. Полученные хроматограммы и содержание углеводов в разных алкогольных напитках представлены в таблице 6. Правильность предложенного подхода к определению сахаров проводили методом «введено-найдено» для темного ликёра «Gorki List», Сербия. Полученные результаты определения свидетельствовали о правильности разработанного подхода и применимости полученного сорбента к анализу реальных объектов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".