Новые низкомолекулярные ковалентные конъюгаты противоопухолевых агентов и ASGP-R-таргетных лигандов для селективной терапии гепатоцеллюлярной карциномыНИР

New low-molecular covalent conjugates of antitumor agents and ASGP-R-targeted ligands for selective therapy of hepatocellular carcinoma

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 9 октября 2018 г.-31 октября 2019 г. Новые низкомолекулярные ковалентные конъюгаты противоопухолевых агентов и ASGP-R-таргетных лигандов для селективной терапии гепатоцеллюлярной карциномы
Результаты этапа: Полученные результаты на 1 этапе проекта: Проект направлен на решение актуальной научной задачи современной медицинской химии – создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов для рациональной терапии гепатоцеллюлярной карциномы (далее – ГЦК). Среди онкологических заболеваний человека гепатоцеллюлярная карцинома является одной из наиболее распространенных и по числу смертельных исходов занимает 2 место в мире. Согласно статистике Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), в 2012 году было зарегистрировано 782500 новых случаев ГЦК, смертность составила 700000 человек [Torre, L. A., etal. // Cancer J. Clin., V. 65, P. 87-108 (2015)]. В настоящее время очевидна необходимость применения низкомолекулярных адресных лигандов («small-molecule carriers») в качестве эффективного инструмента модификации цитотоксических агентов. При этом накоплен большой массив данных, свидетельствующий об эффективности данного метода. Главное целью проекта является синтез и исследование серии новых низкомолекулярных конъюгатов противоопухолевых препаратов и терапевтических молекул с тканеспецифическими лигандами ASGP-R на основе N-ацетил-D-галактозамина. Согласно предложенному плану работу на первом этапе проекта предстояло осуществить синтез и первичную оценку адресных свойств гликоконъюгатов асиалогликопротеинового рецептора. Для этого предлагалось получить несколько серий низкомолекулярных конъюгатов N-ацетилгалактозамина (далее по тексту – GalNAc) и терапевтических молекул (доцетаксела, монометилауристатина, эрибулина, артесуната и природных тритерпеноидов), а также провести компьютерное моделирование взаимодействия конъюгатов с активным сайтом связывания целевого рецептора. По итогам первого этапа были получены следующие результаты в соответствии с заявленным планом: 1. Впервые будет осуществлен синтез нового класса низкомолекулярных гликоконъюгатов эрибулина, монометилауристатина, доцетаксела, артесуната и пентациклических тритерпеноидов с лигандами на основе производных N-ацетилгалактозамина. Дизайн линкера для ковалентного связывания тканеспецифичных векторов и терапевтических молекул будет осуществлен с помощью компьютерного моделирования (молекулярного докинга) с активными центрами ASGP-R. Первым этапом проекта исследований нам предстояло осуществить компьютерное моделирование связывания конъюгатов в активный сайт асиалогликопротеинового рецептора. Ранее в нашей научной группе было проведено аналогичное исследование в отношении гликоконъюгатов доксорубицина и паклитаксела [Petrov R. A. et al. Synthesis and biological evaluation of novel mono-and bivalent ASGP-R-targeted drug-conjugates //Bioorganic & medicinal chemistry letters. – 2017; Ivanenkov Y. A. et al. Synthesis and biological evaluation of novel doxorubicin-containing ASGP-Rtargeted drug-conjugates //Bioorganic & medicinal chemistry letters. – 2017.]. Была валидирована компьютерная модель в сравнении с известным синтетическим ASGPR-лигандом. На ее основе был проведен молекулярный докинг предполагаемых гликоконъюгатов. В результате были получены значения расчетных констант связывания для всех предполагаемых к синтезу структур (см. Таблица 1, стр. 12 Дополнительных материалов). Было определено, что моно- и тривалентные конъюгаты обладают схожим потенциалом к связыванию с ASGP-рецептором. При этом следует учитывать, что используемая модель рецептора предполагает определение связывания для одного структурного фрагмента с GalNAc, т.е. тривалентные конъюгаты проходили оценку в виде поэтапных расчетов моновалентных взаимодействий. Окончательный профиль связывания с ASGP-R будет определен на 2 этапе проекта методом SPR-спектроскопии. В целом, значения энергии связывания оказались равны около минус 4-6 ккал/моль. Таким образом, с помощью метода молекулярного моделирования in silico было показано, что планируемые к синтезу гликоконъюгаты терапевтических препаратов и GalNAc обладают способностью к связыванию с целевым ASGP-рецептором. Была проведена предварительная оценка констант взаимодействия с активным центром рецептора. Анализ структурных закономерностей позволил сформировать рекомендации для дальнейшего синтеза, например использование линкера на основе триэтиленгликоля или тривалентного лиганда нового строения, который был синтезирован в процессе выполнения настоящего проекта. Детальное описание полученных взаимодействий фрагментов молекул с рецептором приведено в Дополнительных материалах. 2. Будет получено 4 различных производных N-ацетилгалактозамина с помощью реакций классического С-O и C-N β-гликозилирования. С этой целью будут использованы такие системы реагентов как TMSOTf / спирты (Z-6-аминогексанол, аллиловый спирт, 2-азидоэтанол) или FeCl3 / TMSN3. В качестве исходного соединения будет использован легкодоступный пентаацетат β-D-галактозамина. На первом этапе (схема 1 в Дополнительных материалах) нами было осуществлено ацилирование 2-амино-2-дезокси-β-D-галактопираноза (A1) при помощи уксусного ангидрида в пиридине. В ходе данной реакции идет активация карбоксильной группы путем образования ацилпиридиния по методу Айнхорна, что позволяет проводить реакцию в мягких условиях с высокими выходами. Основным показателем того, что реакция протекает полностью, является наличие пяти синглетных сигналов в области 1.7-2.0 м.д. в спектре ПМР соединения (A2). Затем из пентаацетата N-ацетигалактозамина (A2) реакцией с триметилсилилтрифлатом (TMSOTf) получили соединение (B1), содержащее в своей структуре оксазолиновый цикл. Образование только α-изомера продукта объясняется стереоселективностью протекающей реакции. О получении именно α-изомера свидетельствует константа спин-спинового взаимодействия атома водорода при гликозидном атоме углерода с Н при С-2 атоме углерода, равная J = 6.7 Гц, что характерно для α-аномеров галактозы. Нуклеофильное раскрытие оксазолина (B1) 2-азидоэтанолом в присутствии кислоты Льюиса (схема 1) приводит к получению производного (B2) и идет по SN2 механизму. Реакция получения соединения (A3) также идет через стадии образования и раскрытия оксазолинового цикла по механизму SN2, однако с небольшими отличиями: в качестве нуклеофила выступает азид-анион, и реакцию проводят без промежуточного выделения оксазолина (B1). В каждом из описанных случаев раскрытия оксазолинового цикла образуется лишь β-продукт, что можно подтвердить, исходя из величин вицинальных констант спин-спинового взаимодействия сигнала протона при гликозидном атоме углерода в спектре ПМР представленных соединений (J = 8.3 Гц (B2), J= 9.3 Гц (A3); что соответствует транс–положению заместителей при С2 и С1). Далее реакцией алкоголиза (схема 1) в основной среде (MeONa в MeOH) удалили защитные ацильные группы с гидроксильных групп соединений (A3), (B2), при этом не были затронуты ацетамидные группы данных соединений, поскольку продолжительность реакции была строго ограничена. Наличие только одного синглетного сигнала ацетамидной группы в области 1.7-2.1 м.д. спектров ПМР полученных соединений (A) и (B) говорит о полноте протекания реакции. 3. Будет получен таргетный триразветвленный лиганд ASGP-R с высокими показателями тканеспецифичности. В качестве основной стадии синтеза будет использована реакция амидного синтеза с использованием активирующего агента Pfp-TFA, позволяющего эффективно проводить конъюгацию систем с множественными реакционными центрами. Для синтеза разветвленного лиганда ASGPR с тремя остатками N-ацетилгалактозамина и азидо группой за основу была взята разработанная нами ранее методика [R. A. Petrov, S. Y. Maklakova, Y. A. Ivanenkov et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 2018, 28(3), 382–387]. При этом выход некоторых промежуточных продуктов удалось увеличить. Например (схема 2), в синтезе соединения Х введение Cl-HOBt способствовало более глубокому протеканию реакции. В результате было выделено около 100 мг целевого соединения в виде белого кристаллического вещества. Индивидуальность полученного продукта доказывали с помощью ВЭЖХ-МС и ЯМР спектроскопии. Зарегистрированные 1Н ЯМР спектры и данные масс-спектрометрии находятся в согласии с предложенной структурой. 4. Будет осуществлен синтез не менее 5 предшественников низкомолекулярных гликоконъюгатов ацилированием противоопухолевых агентов производными ацетиленкарбоновых кислот с использованием карбодиимидов или промежуточных хлорангидридов, а также взаимодействием карбоксильной группы с пропаргилбромидом в присутствии K2CO3. Вторым этапом подготовки к синтезу конечных конъюгатов стала модификация исходных молекул терапевтических препаратов введением фрагментов-линкеров. В связи с тем, что в качестве основной реакции конъюгирования было выбрано азид-алкиновое циклоприсоединение, а азидогруппа была введена в структуру моносахаридов, предстояло осуществить функционализацию производными ацетиленов. На основании данных молекулярного докинга в качестве линкеров были выбраны остатки 5-гексиновой кислоты, синтетического дипептида ValCit, производного Алкин-PEG3-COOH и пропаргилового спирта. Данные структурные фрагменты могут быть введены с использованием коммерчески доступных реагентов. При этом стоит отметить, что в качестве связующего звена между линкером и препаратом была выбрана сложноэфирная или амидная связь. Известно, что в физиологических условиях сложные эфиры и амиды вступают во взаимодействие с внутриклеточными ферментами и подвергаются расщеплению. Данный факт дает основания предполагать способность гликоконъюгатов к распаду во внутриклеточной среде после рецептор-опосредованного эндоцитоза с высвобождением биоактивной молекулы, что является одним из ключевых факторов фармакологического действия низкомолекулярных адресных конъюгатов. Первым объектом исследований стал противоопухолевый препарат Доцетаксел. Из литературных данных [Fu Y. et al. Medicinal Chemistry of Paclitaxel and its Analogues // Curr. Med. Chem. 2009. Vol. 16, № 30. P. 3966–3985] известно, что в структуре паклитаксела самым реакционноспособным нуклеофильным центром является атом кислорода гидроксильной группы при атоме углерода 2’, который более реакционноспособен, чем гидроксил при атоме углерода 7, поскольку последний более стерически затруднен (рис 6. Стр. 27 Дополнительных материалов). В качестве линкера использовали гидрофобную гекс-5-иновую кислоту и гидрофильное соединение Alkyne-PEG3-COOH. Аналогично паклитакселу, самой реакционноспособной гидроксильной группой доцетаксела является группа у 2’ атома углерода. На первой стадии синтеза проводили взаимодействие гекс-5-иновой кислоты и доцетаксела с образованием сложноэфирной связи (схема 3, стр. 27). Использование 4-диметиламинопиридина вместо N-гидроксисукцинимида облегчает атаку нуклеофильной гидроксильной группой доцетаксела по карбонильному атому благодаря образующемуся активированному интермедиату. В качестве побочного продукта получено соединение, замещенное гекс-5-иновой кислотой по положениям доцетаксела 2’ и 7 одновременно (рис. 7 стр. 28 Дополнительных материалов). В качестве линкера использована коммерчески доступная 3,6,9,12-тетраоксопентадек-1-ин-15-овая кислота (схема 4, стр. 31). В ходе реакции образования сложноэфирной связи доцетаксела с линкером в присутствии EDC и DMAP так же происходило образование смеси продуктов монозамещения в положении 2’ и дизамещения в положениях 2’ и 7. Целевой продукт монозамещения 5 был выделен методом колоночной хроматографии. Спектр ЯМР 1Н соединения 5 содержит характеристичный пик протона при атоме углерода 2’, смещенный от 4.78 м.д. (исходный доцетаксел) до 5.54 м.д. Спектр ЯМР 13С содержит 5 пиков, соответствующих карбоксильным атомам углерода. Далее, нами была осуществлена попытка ацилирования эрибулина, который вводили во взаимодействие с NHS-эфиром гекс-5-иновой кислоты (схема 10, стр. 58). Анализ реакционной смеси (ВЭЖХ-МС) не выявил даже следовых количеств целевого продукта. Был обнаружен эрибулин, который не вступил во взаимодействие. Ввиду дороговизны эрибулина (например, в составе лекарственного препарата «Халавен» около 100 т.р. за ампулу, содержащую 1 мг эрибулина мезилата) дальнейшие работы с ним были приостановлены. В настоящее время проводится поиск оптимальной системы реагентов для ацилирования данной молекулы. Монометилауристатин Е (ММАЕ) модифицировали линкером с терминальной тройной связью, а не напрямую гекс-5-иновой кислотой (схема 5, стр. 38). Из литературы известно, что для направленного транспорта ауристатинов широкое применение находят моноклональные антитела, соединенные с лекарственной молекулой с помощью линкеров, позволяющих высвобождать действующее вещество под влиянием внутриклеточных протеолитических ферментов, таких как катепсин b [Senter, P. D.; Sievers, E. L. Nat. Biotechnol. 2012, 30 (7), 631–637]. В данной работе использовали катепсин-расщепляемый линкер на основе дипептида валин-цитруллин и пара-аминобензилового спирта (далее Val-Cit-PAB). Линкер получали согласно опубликованной последовательности химических превращений (схема 5, стр. 38). Далее синтезированный линкер вводили в реакцию с монометилауристатином Е. Целевое соединение 13 выделяли с помощью препаративного хроматографа PuriFlash-4250. Продукт был получен в виде жетовато-белого кристаллического вещества. Следующим этапом использовали природный сесквитерпеновый пероксид Артесунат. Модификация исходного терапевтического агента заключалась в ацилировании производными ацетиленкарбоновых кислот с использованием карбодиимидного (EDC/DMAP или EDC/NHS) методов или во взаимодействии с пропаргил бромидом в присутствии K2CO3. Данная модификация оказалась возможной благодаря наличию свободной карбоксильной функции в составе молекулы (схема 6, стр. 43). Таким образом, в качестве линкеров использовали два варианта – гидрофобный и гидрофильный. Для получения соединения 18, содержащего короткий гидрофобный линкер, была выбрана методика, включающая в себя депротонирование карбоксильной группы артесуната с помощью карбоната калия в апротонном полярном растворителе (ДМФА), с последующей нуклеофильной атакой (SN2) получившегося карбоксильного аниона по пропаргил бромиду. Данная методика проста в исполнении и не требует дорогостоящих реактивов или жестких условий реакции, в отличие от аналогичных, использующих карбодиимидный или хлорангидридный методы активации карбоксильной группы. Использование ДМФА продиктовано необходимостью стабилизировать получающийся анион СОО- в растворе за счет полярности растворителя с одновременной необходимостью избежать формирования дополнительных нуклеофилов, способных взаимодействовать с уже существующей в структуре артесуната сложноэфирной связью. О протекании реакции свидетельствуют: 1) ЯМР 1Н характерный триплет терминального протона тройной связи (2.47 мд, J=2.4 Гц); 2) ЯМР 13С – характеристичные алкинные сигналы в области 75-80 мд; 3) ИК – характеристичная полоса поглощения 2130 см-1. 4) Масс-спектрометрия высокого разрешения – совпадение экспериментальных и расчетных m/z для катионов [M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+. Для получения соединения содержащего длинный гидрофильный линкер 19 была выбрана методика, включающая в себя карбодиимидную активацию карбоксильной группы с помощью системы EDC/DMAP, с последующим добавлением HO-PEG3-СOOН (схема 6, стр. 43). Методика выбрана из-за большей коммерческой доступности гидрокси-производного перед галоген-производными. Данное обстоятельство приводит к необходимости активировать кабоксильную группу артесуната, для этого в свою очередь оптимальным является карбодиимидный метод. О протекании реакции свидетельствуют: 1) ЯМР 1Н характерный триплет терминального протона тройной связи (2.94 мд, J=2.4 Гц); 2) ЯМР 13С – характеристичные алкинные сигналы в области 75-80 мд; 3) ИК – характеристичная полоса поглощения 2110 см-1. 4) Масс-спектрометрия высокого разрешения – совпадение экспериментальных и расчетных m/z для катионов [M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+. Таким образом, нам удалось использовать две альтернативные методики модифицирования артесуната по карбоксильной группе субстратами различной природы. Обе методики дают продукты со схоже высокими выходами за относительно небольшое время (менее 24 часов), не требуют редких каталитических систем и сложных стадий отчистки, что делает их оптимальными для начальных стадий предложенных синтетических цепочек. В качестве объекта исследования из числа тритерпеноидов нами была выбрана олеаноловая кислота. Из литературы известно, что она обладает высоким потенциалом против гепатоцеллюлярной карциномы [M. Lange et al. // Biochemical Pharmacology, V. 118, P. 9–17 (2016)]. Кроме того, ранее было выявлено соединение-лидер – моновалентный конъюгат ASGP-R олеаноловой через положение С(3). Данное соединение проявило отличный уровень цитотоксичности вместе с селективностью действия против контрольных клеточных культур рака предстательной железы, рака легкого и молочной железы, здоровых клеток фибробластов человека. В результате, в рамках настоящего проекта мы провели этерификацию олеаноловой кислоты 5-гексиновой кислотой в положение С-3 углеводородного скелета через промежуточный хлорангидрид (схема 7, стр. 49). Выбранный метод синтеза отличается высокой эффективностью в отношении пространственно сложных терпеновых структур. Применение других активирующих агентов для этерификации олеаноловой кислоты оказалось непримелем ввиду наличия свободной карбоксильной группы и стерическим влиянием двух диметильных групп в положении С(4). 5. Будет получено не менее 5 ковалентных конъюгата с тривалентным лигандом ASGP-R разветвленного строения и не менее 5 моновалентных конъюгатов с азидопроизводными N-ацетилгалактозамина. Сочетание азидо-производных углеводов и лигандов с тройной связью линкеров будет осуществлено реакцией медь катализируемого азид-алкинового [3+2]-циклоприсоединения с использованием каталитических систем CuSO4 / аскорбат Na или CuI / DIPEA. На сегодняшний день существует множество способов конъюгирования в создании гликоподобных систем. Среди них можно выделить классическое гликозилирование, реакции амидного синтеза, синтез оснований Шиффа, ряд клик-реакций и многие другие. Несмотря на видимые ограничения для применения в фармакологии, медь-катализируемое азид-алкиновое циклоприсоединение (CuAAC) является первоочередным способом, используемым в области конъюгирования производных сахаридов и других молекул. Простота исполнения, высокая селективность и выход реакции, а также способность 1,2,4-триазольного фрагмента к имитации природной пептидной связи в живых системах делают указанный метод синтеза незаменимым в лабораторной практике. Опираясь на данные молекулярного докинга, в данном проекте нами была использована реакция сочленения азидосахаров и алкиновых производных терапевтических молекул через 1,2,4-триазолы. Выбор CuI в качестве приоритетного катализатора был обусловлен предварительным апробированием для синтеза ASGPR-адресных конъюгатов противоопухолевых препаратов паклитаксел и доксорубицин, в которых данный реагент показал высокую эффективность, а также рядом других факторов. В результате была получена серия гликоконъюгатов артесуната, монометил ауристатина, доцетаксела и пентациклических тритерпеноидов, содержащих в своем составе один или несколько остатков N-ацетил-D-галактозамина (схемы 3- 7 Дополнительных материалов). Так, на заключительной стадии провели конъюгирование производных доцетаксела 2 и 5 с моновалентными лигандами A и B и с тривалентным лигандом D (схема 3, стр. 27 и схема 4, стр. 31). Синтезированы конъюгаты с этиленгликолевым спейсером 7, 8 и 9 для анализа влияния более длинного линкерного фрагмента на гибкость структуры и на растворимость конъюгата в воде. В качестве катализатора был также был использован водный раствор аскорбата натрия и сульфата меди (II). Определено, что в данном случае происходил гидролиз сложноэфирной связи. Выделение целевых конъюгатов 3,4,7-9 проводилось методом колоночной хроматографии, а образование продуктов было подтверждено данными спектроскопии ЯМР 1Н (появление сигнала протона триазольного фрагмента при 7.42-8.00 м.д.) и ЯМР 13С (6 сигналов, соответствующих карбоксильным атомам углерода), и масс-спектрометрии высокого разрешения. Для проведения ряда экспериментов по изучению клеточного накопления представленных выше систем доставки был синтезирован конъюгат доцетаксела, содержащий флюоресцентную метку Cy5. Для этого соединение 5 было модифицировано коммерчески доступным флюоресцентным красителем Cy5-COOH по положению C7-OH при помощи реакции карбодиимидного синтеза с использованием EDC*Cl и DMAP (схема 4, стр. 31). Спектр ЯМР 1H соединения 6 содержит сигналы как производного Cy5, так и сигналы характерные исходному соединению 5. Также сигнал протона при С7 смещается в область более слабого поля (из области 4.32 м.д. для соединения 5 в область 5.30-5.40 м.д. для соединения 6). Для образования конъюгата 10 проведена реакция азид-алкинового циклоприсоединения с лигандом B. Получение целевых соединений подтвердилось спектром ЯМР 1Н (появление сигнала триазольного протона около 8.00 м.д. и отсутствие сигнала терминального протона при тройной связи в районе 2.82-2.89 м.д.). Чистота и индивидуальность всех промежуточных и целевых соединений были подтверждены методом ВЭЖХ, а состав и структура – методами 1H и 13C ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Для производного MMAE 13 было осуществлено несколько реакций медь катализируемого азид-алкинового [3+2]-циклоприсоединения. Прежде всего были получены конъюгаты 14 и 15 с двумя азидопроизводными N-ацетилгалактозамина А и B (схема 5, стр. 38). В обоих случаях в реакцию водили по 10 мг (8 µмоль) производного ММАЕ и использовали стандартную каталитическую систему CuI-Et3N. При получении конъюгата 14 конверсия оказалась меньше, поэтому пришлось прибегнуть к ВЭЖХ для выделения целевого продукта. Во втором случае, согласно ВЭЖХ-МС, конъюгат 15 был основным компонентом в реакционной смеси и его удалось выделить с использованием препаративного хроматографа InterChim PuriFlash-4250. Состав полученных конъюгатов подтверждали с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения, об их индивидуальности судили по ВЭЖХ-МС. Кроме того, в реакцию с производным ММАЕ 13 вводили лиганд D. Для этого в 1 мл ДМФА растворяли 3 мг соединения 13 и 5 мг (1.5 eq) азида D, из реакционной смеси откачивали кислород, заполняли колбу аргоном и добавляли 10 мкл триэтиламина и каталитические количества йодида меди. После выдерживания реакционной смеси в инертной атмосфере в течение ночи наблюдали образование целевого конъюгата 16 (содержание согласно ВЭЖХ-МС – 18% в положительных и 36% в отрицательных ионах).В настоящее время осуществляется хроматографическая очистка конъюгата ММАЕ и тривалентного лиганда D. Для заключительной стадии конъюгирования в синтезе конъюгатов артесуната 20, 21, 22 и 23 с учетом наличия в исходных молекулах пероксидного фрагмента (схема 6, стр. 43), способного выступать в качестве окислителя, было отдано предпочтение каталитической системе CuI-DIPEA, не имеющим в своем составе восстановителя, роль которого в системе CuSO4-аскорбат натрия выполняет аскорбат натрия. Для синтезированных соединений выявлена низкая устойчивость в хлороформе, метаноле, воде и ДМСО. Единственным удовлетворительным методом хранения является заморозка растворенного в ДМСО образца до -20°С. Деградация соединений в растворе наблюдалась при помощи ЯМР 1Н и LCMS. Первичная отчистка реакционной смеси, заключалась в отделении производных меди через бумажный фильтр из взвеси, полученной при растворении твердого, оставшегося после удаления ДМФА остатка. Затем проводили колоночную хроматографию в системе CH2Cl2/CH3OH. В завершении осуществили повторную препаративную очистку с помощью ВЭЖХ с целью для выделения чистого продукта из смеси веществ, полученных при деградации необходимого продукта на предшествующих стадиях. О протекании реакций свидетельствуют: 1) ЯМР 1Н характерный синглет протона триазольного цикла (~8.00 мд). 2) Масс-спектрометрия высокого разрешения – совпадение экспериментальных и расчетных m/z для катионов [M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+. Для пентациклического тритерпеноида олеаноловой кислоты первоочередной стояла задача синтеза конъюгата с тривалентным лигандом D, для последующего сравнения его с полученными ранее моновалентными конъюгатами. Производное олеаноловой кислоты 25 вовлекали во взаимодействие с тривалентным лигандом D в ДМФА при комнатной температуре в атмосфере аргона (схема 7, стр. 49). Состав полученного конъюгата 26 подтверждали с помощью ВЭЖХ-МС. В настоящее время проводится препаративное выделение с помощью обращено-фазовой хроматографии. Кроме того, при выполнении проекта в нашей лаборатории был предложен новый тривалентный лиганд упрощенного строения, а также осуществлен его синтез (схема 8, стр. 51). С этой целью нами первоначально была осуществлена постановка Boc-защита аминогруппы молекулы ТРИС во избежание конкурирующих реакций ацилирования. Далее бокированный ТРИС 27 этерифицировали гекс-5-иновой кислотой в присутствии EDC-Cl / DMAP. В результате был получен сложный эфир 28, содержащий в себе три линкера в виде свободных цепочек с терминальными тройными связями. Выход соединения 28 после хроматографической очистки составил 42%. Структуру установили методами ЯМР-спектроскпии. Применение пары реагентов EDC-Cl / DMAP в данном случае оказалось оптимальным благодаря высокой эффективности и разнице в хроматографической подвижности с продуктом реакции. Так, применение карбодиимидов DIC или DCC осложняло процесс хроматографии и уступало по конверсии продукта реакции. Применение хлорангидридного метода этерификации оказалось неприемлемым из-за лабильной Boc-защиты в структуре исходного вещества. Ключевую стадию взаимодействия алкина 28 и азидов A и B осуществили в присутствии каталитической системы CuI/DIPEA в безводном ДМФА (схема 8, стр. 51). Реакцию проводили при комнатной температуре в инертной атмосфере аргона. В результате региоселективно были синтезированы лиганды 29 и 30 с E-1,4-замещенными циклами 1,2,3-триазолов. Далее мы синтезировали адресный конъюгат артесуната 33, содержащий в себе новый упрощенный тройник (схема 9, стр. 55). При этом, сборку конструкции новго тройника осуществлили непосредственно на молекулу исходного артесуната. С этой целью первоначально ацилировали ТРИС свободной концевой СООН-группой артесуната с использованием пары реагентов амидного синтеза HBTU\HOBt. Далее повторили отработанную цепочку превращений этерификации 5-гексиновой кислотой и CuAAC-реакции с азидосахаридом А. В результате было получено ранее неизвестное производное артесуната 33. Образование соединения 33 установлено методом ВЭЖХ-МС, проводится хроматографическая очистка с использованием препаративного хроматографа InterChim PuriFlash-4250. Кроме того, в рамках данного проекта был синтезирован новый моновалентный конъюгат бетулиновой кислоты. При разработке оригинальной схемы синтеза нами за основу был взят пропаргиловый эфир бетулиновой кислоты 34 (схема 11, стр. 58). Ранее было показано, что модификация бетулиновой кислоты через карбоксильную функцию в положении С-28 углеродного скелета приводит к потере исходных цитотоксических свойств к клеточным линиям гепатокарциномы HepG2 и Huh7. На первом этапе было получено производное бетулиновой кислоты 34, содержащее тройную связь. Синтез проводился по известной методике взаимодействия карбоновых кислот и алкилгалогенидов (схема 11, стр. 58). На следующем этапе осуществили введение свободной –COOH группы в цикл А соединения 34 с помощью короткого фрагмента щавелевой кислоты, используя метод ацилирования спиртов хлорангидридами. В качестве ацилирующего агента использовали оксалилхлорид, который способен взаимодействовать с 3-OH гидроксильной группой тритерпеноидов. Далее промежуточный бис-хлорангидрид растворяли в минимальном количестве 1,4-диоксана и проводили кислотный гидролиз в воде. По окончании реакции гидролиза, соединение 35 выделяли с помощью обращённо-фазовой хроматографии, так как при введении свободной –COOH группы наблюдалось сильное увеличение полярности продукта реакции. Применение нормально-фазовой хроматографии ограничивалось необходимостью в сильнополярном элюенте, таком как MeOH, который приводил к частичной переэтерификации свободной карбоксильной группы соединения 35. После очистки продукт выделили в виде белого порошкообразного вещества, выход составил 48%. Структуру гемиоксалата 35 установили методом ЯМР 1H спектроскопии: сигнал атома водорода H-3 (4.65 м.д.) сместился в область слабого поля, что свидетельствовало об успешном образовании сложного эфира. Анализ спектра ЯМР 13С показал, что в спектре соединения 35 появлялись пики 157.33 м.д. и 157.05 м.д., характерные для атомов углерода остатка щавелевой кислоты. Наконец, взаимодействие алкинил производного бетулиновой кислоты 35 и азида А осуществляли классически в присутствии CuSO4 и NaAsc. По окончании процесса очищали продукт хроматографически на колонке с обращенно-фазовым силикагелем, что также было обусловлено высокой полярностью конечного конъюгата и наличием свободной –COOH группы. В результате получили соединение 36 с выходом 81%. Структура конъюгата 5 была установлена методами ЯМР спектроскопии, а состав и брутто-формула подтверждены масс-спектрометрией высокого разрешения ESI HRMS. На спектре ЯМР 1Н в слабой области поля наблюдался характерный синглет ароматической системы 1,2,3-триазольного цикла 7.97 м.д. (Н-33). Одновременно в спектре ЯМР 13С присутствовали сигналы атомов углерода 1,2,3-триазольного цикла при 148.26 и 121.57 м.д. β-Конфигурация фрагмента аминомоносахарида после реакции осталась неизменной в структуре конъюгата 36. Анализ спектра ЯМР 1H показал, что константа спин-спинового взаимодействия сигнала атома водорода аномерного центра при С-1 равна J = 10 Гц, что характерно для транс-положения заместителей при атомах углерода С-1 и С-2. 6. Идентификация структуры полученных соединений будет осуществлена набором физико-химических методов: спектроскопия ЯМР, масс-спектрометрия высокого разрешения, ВЭЖХ-МС. Полученные конъюгаты будут обладать улучшенным фармакологическим профилем в сравнении с исходными молекулами: высокой тканеспецифичностью и селективностью действия, низкой общей токсичностью, способностью к метаболизму в физиологических условиях при сопоставимом противоопухолевым потенциалом в отношении клеточных линий ГЦК. Идентификация структуры полученных соединений в рамках проекта осуществлена набором физико-химических методов: спектроскопия ЯМР, масс-спектрометрия высокого разрешения, ВЭЖХ-МС, ИК-спектроскопия. Подробные экспериментальные данные для каждого соединения приведены в файле «Дополнительные материалы». Таким образом, на первом этапе проекта была синтезирована: серия лигандов ASGP-R, содержащих в себе азидогруппу; серия предшественников низкомолекулярных гликоконъюгатов, модифицированных алкиновыми линкерами в условиях реакций ацилирования; и серия адресных гликоконъюгатов с N-ацетил-D-галактозамином на их основе. Всего было получено: классических 2 моновалентных и 1 тривалентный лигандов ASGP-R; 7 модифицированных терапевтических молекул - предшественников с линкерами; 12 моновалентных конъюгатов; 3 тривалентных конъюгата, 2 новых тривалентных лиганда. Все синтезированные на первом этапе проекта гликоконъюгаты являются новыми соединениями и ранее не были описаны в литературе. Также следует отметить, что работа с доцетакселем и пентациклическими тритерпеноидами является логичным продолжением начатых ранее исследований. В тоже время низкомолекулярные адресные конъюгаты ММАЕ и артесуната с лигандами ASGP-R ранее не синтезировались, подобные исследования проводятся впервые. Для всех представленных гликоконъюгатов были получены предварительные данные аффинности с помощью молекулярного докинга in silico. Изучена принципиальная возможность связывания синтезированных структур с активным углеводраспознающим сайтом рецептора, выявлены перспективные соединения и даны рекомендации к синтезу. На втором этапе проекта в 2019-2020 гг. будет осуществлена оценка их биологических свойств in vitro. Мы ожидаем, что гликоконъюгаты проявят сопоставимый с исходными молекулами цитотоксический эффект, с одновременным приобретением адресных свойств. Кроме того, нами предложен оригинальный и простой подход к синтезу новых тривалентых лигандов ASGP-R и нового моновалентного гликоконъюгата бетулиновой кислоты и GalNAc. На основе нового тривалентного лиганда синтезирован адресный конъюгат артесуната. Данные соединения также пройдут оценку биологических свойств в рамках второго этапа проекта.
2 1 ноября 2019 г.-1 октября 2020 г. Новые низкомолекулярные ковалентные конъюгаты противоопухолевых агентов и ASGP-R-таргетных лигандов для селективной терапии гепатоцеллюлярной карциномы
Результаты этапа: В ходе реализации проекта были получены следующие результаты согласно заявленному плану исследований: 1. На первом этапе проекта нами был осуществлен дизайн линкера для ковалентного связывания тканеспецифичных векторов и терапевтических молекул с помощью компьютерного моделирования (молекулярного докинга) с активными центрами ASGPR. В результате были получены значения расчетных констант связывания для всех предполагаемых к синтезу структур (см. Таблица 1, стр. 11 Дополнительных материалов). Было определено, что моно- и тривалентные конъюгаты обладают схожим потенциалом к связыванию с ASGP-рецептором. При этом следует учитывать, что используемая модель рецептора предполагает определение связывания для одного структурного фрагмента с GalNAc, т.е. тривалентные конъюгаты проходили оценку в виде поэтапных расчетов моновалентных взаимодействий. В целом, значения энергии связывания оказались равны около минус 4-6 ккал/моль. Таким образом, с помощью метода молекулярного моделирования in silico было показано, что планируемые к синтезу гликоконъюгаты терапевтических препаратов и GalNAc обладают способностью к связыванию с целевым ASGP-рецептором. 2. Впервые осуществлен синтез нового класса низкомолекулярных гликоконъюгатов монометилауристатина, доцетаксела, артесуната и пентациклических тритерпеноидов с лигандами на основе производных N-ацетилгалактозамина (Схема 1-11, Дополнительные материалы). Нами предварительно была проведена модификация исходных терапевтических молекул введением структурных фрагментов, содержащих алкиновую группу. Всего по проекту было получено 8 предшественников конъюгатов. Далее нами было синтезировано 4 лиганда асилогликопротеинового рецептора (далее по тексту ASGPR) на основе молекулы N-ацетил-D-галактозамина (далее по тексту GalNAc) – два тривалентных и два моновалентных лигандов. На финальной стадии сшивки лигандов и модифицированных предшественников было синтезировано 15 низкомолекулярных адресных конъюгата для адресной доставки в гепатоциты (12 моновалентных конъюгатов; 3 тривалентных конъюгата). Кроме того, в рамках выполнения проекта было получено флюоресцентно-меченое производное противоопухолевого препарата доцетаксел, содержащее в своей структуре остатки GalNAc и красителя Cyanine5. Изображения всех синтезированных структур и схем синтеза приведены в Дополнительных материалах. Структура и состав полученных в рамках проекта соединений были установлены набором физико-химических методов: спектроскопия ЯМР1Н и ЯМР13С, масс-спектрометрия высокого разрешения, ВЭЖХ-МС, ИК-спектроскопия. 3. Для всех полученных гликоконъюгатов определена аффинность к ASGPR с помощью метода поверхностно-плазмонного резонанса (ППР-спектроскопия). Были получены значения термодинамических констант диссоциации комплексов «конъюгат-рецептор» (см. Таблица 1, стр. 11 Дополнительных материалов), на основании которых удалось провести предварительную оценку адресных свойств синтезированных соединений в гепатоциты. Соотнесение совокупности результатов молекулярного докинга и ППР-спектроскопии позволило выявить общие закономерности связывани. Показано, что синтезированные соединения проявляют аффинность, сопоставимую с ранее опубликованными соединениями. 4. Для всех синтезированных конъюгатов проведено исследование цитотоксичности in vitro с использованием клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2 или Huh7), экспрессирующих ASGPR. Известно, что HepG2 экспрессирует больше количество ASGPR на единицу клетки, в то время как Huh7 практически не экспрессирует ASGPR. Цитотоксичность определяли с помощью MTS-теста, значения активности выражали в виде концентрация полумаксимального ингибирования (ИК50, см. Таблица 2, стр. 13 Дополнительных материалов). Таким образом, была проведена оценка противоопухолевой активности полученных по проекту соединений и произведен первичный отбор наиболее активных. 5. Далее для отобранных конъюгатов была определена цитотоксичность на контрольных клеточных линиях рака предстательной железы РС3 и эмбриональных почек человека Hek293 (здоровая клеточная культура). Данные клеточные культуры не экспрессируют ASGPR. Цитотоксичность определяли с помощью MTS-теста, значения активности выражали в виде концентрация полумаксимального ингибирования (ИК50, см. Таблица 2, стр. 13 Дополнительных материалов). В результате был проведен анализ селективности действия ASGP-адресных конъюгатов и повторный отбор наиболее перспективных веществ для последующих фармакологических тестов. 6. Для конъюгатов-лидеров, отобранных по итогам тестов на цитотоксичность и связываемость, была изучена стабильность в физиологических условиях инкубированием при различных значениях рН (5.5 и 7.4) в фосфатно-солевом буфере, а также в присутствии ферментов (эстеразы и пептидазы)при рН 7.4. По данному показателю нами были изучены гликоконъюгаты доцетаксела и монометилауристатина. Показана их устойчивость в физиологических условиях и способность к деградации под действием внутриклеточных ферментов. Таким образом можно сделать вывод о способность высвобождать исходный лекарственный препарат после процесса клатрин-зависимого ASGPR-опосредованного эндоцитоза. 7. На заключительном этапе был проведен анализ полученных данных. В совокупности данных в качестве соединений-лидеров, показавших наилучшие результаты нами были выбраны гликоконъюгаты доцетаксела, показавшие оптимальный фармакологический профиль в рамках проведенных тестов – отличное связывание с ASGPR, сопоставимый уровень цитотоксической активности, устойчивость в физиологической среде и высвобождение препарата под действием эстераз. Далее для гликоконъюгатов доцетаксела были проведены расширенные испытания, такие как способность к внутриклеточному поглощению и накоплению, анализ генерации свободных форм кислорода (АФК) после внутриклеточного проникновения под действием синтезированных соединений, анализ растворимости в воде в сравнении с исходным соединением. Также нами были предложены новые тривалентные лиганды ASGPR, исследованы их основные фармакологические показатели, синтезирован первый пример адресного конъюгата с препаратом Артесунат. С точки зрения всего объема исследований по проекту основные результаты можно разделить на несколько групп в зависимости от используемого препарата: 1) Доцетаксел В ходе реализации исследований нами были разработаны синтетические подходы к созданию новых систем адресной доставки в клетки печени на основе противоопухолевого препарата доцетаксела (DTX) и лигандов асиалогликопротеиновового рецептора (ASGPR) моно- и тривалентного типа. Мы получили новые конъюгаты DTX и GalNAc, используя стратегию дизайна пролекарств и легко доступные органические реакции (Схемы 3 и 4, стр. 3-4 дополнительные материалы). Нами были изучены основные фармакологические показатели и молекулярно-биологические аспекты действия полученных конъюгатов. Так, одновалентные гликоконъюгаты имеют растворимость в 21–75 раз выше растворимости DTX (Таблица 4, стр. 14 дополнительные материалы). Все конъюгаты показали превосходное сродство к ASGPR (Таблица 1, стр. 11 дополнительные материалы) и высокую цитотоксическую активность против клеток HepG2 (Таблица 2, стр. 13 дополнительные материалы), причем значения IC50 сопоставимы со значениями IC50 доцетаксела и превышали таковые для ранее разработанных аналогов паклитаксела. Сравнение гидрофобных (5-гексиновая кислота) и гидрофильных (алкин-PEG3-COOH) линкеров не выявило существенных различий ни в аффинности и цитотоксичности полученных конъюгатов, ни в селективности действия. Мы показали неспецифический эффект моновалентных конъюгатов DTX на ASGPR-отрицательные клеточные линии PC-3 и HEK-293. Напротив, конъюгат DTX и тривалентного лиганда D продемонстрировал превосходную цитотоксическую селективность между клетками HepG2 (ASGPR+) и PC-3 / Hek293 (ASGPR-), подтверждая повышенную эффективность в отношении клеток ГЦК. Также, нами были получены флуоресцентно меченые производные доцетаксела 6 и 10 (Схема 4, стр. 4 дополнительные материалы). Селективное клеточное поглощение клетками ГЦК гликоконъюгатов DTX было показано в исследованиях этих производных, меченных красителем Cy5, с помощью флуоресцентной микроскопии и подтверждено ASGPR-опосредованное клеточное поглощение клетками HepG2 (Рисунки 2 и 3, стр. 16-17 дополнительные материалы). Наконец, разработанные соединения обладают лабильностью в условиях внутриклеточного гидролиза (Таблица 3, стр. 14 дополнительные материалы) и способствуют усиленной генерации активных форм кислорода (АФК) в клетках HepG2 (Рисунок 10, стр. 23 дополнительные материалы). Представленные результаты однозначно указывают на высокий потенциал разработанных средств для таргетного лечения ГЦК. 2) Монометилауристатин Е (ММАЕ) Для синтеза целевых конъюгатов монометил ауристатина Е исходный препарат был модифицирован катепсин-расщепляемым линкером с терминальной тройной связью (Схема 5, стр. 5, дополнительные материалы). После чего полученное производное MMAE 13 было введено в реакцию медь катализируемого азид-алкинового [3+2]-циклоприсоединения с азидопроизводными N-ацетилгалактозамина А, B и D. Состав полученных конъюгатов был подтвержден с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения, индивидуальность – с помощью ВЭЖХ-МС. Для исследования строения конъюгатов была использована 1Н ЯМР спектроскопия. Для синтезированных гликоконъюгатов была измерена аффинность по отношению к ASGPR с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Полученные значения термодинамических констант диссоциации комплексов «конъюгат-рецептор» представлены в Таблице 1 (стр. 11, дополнительные материалы). KD всех трех конъюгатов 14-16 были ниже измеренных ранее [A. G. Majouga, et al. Identification of novel small-molecule ASGP-r ligands (2016) Current Drug Delivery. 13(8), 1303–1312] для N-ацетилгалактозамина. Конъюгат 14 в in vitro тестировании проявил большее связывание с рецептором, чем конъюгат 15, что согласуется с результатами молекулярного докинга. Конъюгат 16 с лигандом D продемонстрировал KD ≈ 250 нМ. Это значение выше, чем таковые для конъюгатов 14 и 15, однако не совсем корректно сравнивать столь разные по структуре соединения только на основании довольно упрощенных in vitro и in silico моделей. Возможно, конъюгат ММАЕ 16 с более сложным тривалентным лигандом проявит более ценные биологические свойства в последующих in vivo испытаниях. Для всех конъюгатов 14-16 была определена цитотоксичность по отношению к клеткам линий HepG2, PC-3 и HEK293. Все вещества оказались токсичными: измеренные значения СC50 лежали в диапазоне 0.1-0.5 мкМ, что несколько выше чем для не модифицированного монометил ауристаина Е. Снижение цитотоксичности ММАЕ после соединения с лигандами может быть связано с их высокой устойчивостью и плохим высвобождением действующего вещества внутри клетки. В связи с этим, для конъюгата 14 было проведено исследование подверженности гидролизу (рисунок 2, стр. 15 Дополнительные материалы) в условиях, имитирующих физиологические и внутриклеточные: в водных растворах рН 5.5 и 7.4, а также в присутствии ферментов (Pronase from Streptomyces griseus, Roche). Вещество продемонстрировало стабильность при выдерживании в течение 24 часов в водных растворах с рН 5.5 и 7.4, однако оно полностью расщеплялось уже после 8 часов под действием ферментов (константа гидролиза k=0.783 ч-1). Данное направление проекта планируется развивать за счет проведения дополнительных биологических испытаний, которые позволят установить более четкие связи между активностью разрабатываемых соединений и их строением, выявить наиболее благоприятные структурные факторы, оптимизировать дизайн конъюгатов ММАЕ и лигандов ASGPR. 3) Артесунат С использованием Артесуната (гемисукцинат дигидроартемизинина, пролекарство природного сесквитерпенового органического пероксида) впервые был получен ряд ASGPR-направленных гликоконъюгатов как моновалентной (схема 6, стр. 6 дополнительные материалы), так и тривалентной (схема 7, стр. 7 дополнительные материалы) структуры. Все полученные соединения проявили превосходную связываемость in vitro с ASGPR в наномолярном диапазоне концентрацией по результатам исследования ППР-спектроскопией, что в несколько порядков превосходит связываемость исходного GalNAc (таблица 1, стр. 11 дополнительные материалы). Данный результат также подтвержден с помощью расчетов молекулярного докинга, в которых предложенные структуры связывались с углевод-распознающим доменом компьютерной модели со значительным выигрышем энергии ΔG = [-6.0; -8.0] ккал/моль. Все полученные соединения были изучены против представленной панели клеточных линий. Исходя из результатов по связыванию, мы обоснованно ожидали, что гликопроизводные дигидроартемизинина проявят цитотоксическую активность по отношению к клеткам гепатокарциномы, значительно превышающую исходный артесунат, с возможностью последующего отбора перспективных соединений. Неожиданным образом, по итогам тестирования было определено, что все синтезированные по проекту конъюгаты не проявляют ингибирующих свойств по отношению к клеткам HepG2, Huh7, PC3 и Hek293 (таблица 2, стр. 13 дополнительные материалы). Таким образом, гликоконъюгаты артесуната и GalNAc не рассматривались далее для последующих биологических испытаний. Однако, следует отметить, что отсутствие цитотоксичности в таких высоких концентрациях позволяет развивать данное направление проекта и провести тестирование против печеночной стадии малярийных плазмодиев. В настоящее время в лаборатории ведется работа в указанном направлении. 4) Тритерпеноиды. Последовательностью простых химических реакций этерификации и медь-катализируемого азид-алкинового циклоприсоединения впервые синтезирован тривалентный конъюгат 26 олеаноловой кислоты и лиганда D (схема 8, стр. 8 дополнительные материалы). Последующий анализ цитотоксичности выявил, что данное соединение не обладает активностью в отношении клеточных линий гепатокарциномы HepG2 и Huh7, ИК50 > 100 мкМ (таблица 2, стр. 13 дополнительные материалы). В результате соединение 26 не было снято с испытаний по проекту. По всей видимости, данный результат обусловлен затрудненным высвобождением биологически активной против HepG2 олеаноловой кислоты из структуры конъюгата 26. Также нами предложен оригинальный и простой подход к синтезу нового гликоконъюгата бетулиновой кислоты и N-ацетил-D-галактозамина 36, который заключается в последовательной этерификации исходного тритерпеноида и заключительном конъюгировании с азидопроизводным аминомоносахарида (схема 10, стр. 9 дополнительные материалы). Ключевой стадией в разработанной схеме является взаимодействие пропаргилбетулината 34 и оксалилхлорида с последующим кислотным гидролизом, в результате которого в структуру бетулиновой кислоты был введен фрагмент щавелевой кислоты в виде гемиэфира. Полученное гликопроизводное 36 обладает высокой активностью в отношении клеточных линий гепатокарциномы in vitro со значениями ИК50 HepG2 = 6.4 мкМ, Huh7 = 12.4 мкМ (таблица 2, стр. 13 дополнительные материалы), избирательностью цитотоксического действия к клеткам гепатокарциномы с высоким и низким содержанием ASGPR (Индекс селективности SI HepG2/Huh7 = 1.9), а также по отношению к другим опухолевым клеточным линиям, не экспрессирующим ASGPR (ИК50 PC3=12.9 мкМ, индекс селективности SI HepG2/PC3 = 2.0) и превосходной связываемостью с асиалогликопротеиновым рецептором гепатоцитов со значениями KD = 0.21 нМ и ΔG = -4.65 ккал/моль (таблица 1, стр. 11 дополнительные материалы). Аффинность к рецептору установлена с помощью метода спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса и подтверждена расчетами молекулярного докинга in silico. В то же время следует отметить высокую токсичность соединения 36 к нормальной клеточной линии Hek293 (ИК50 = 4.4 мкМ). Именно из-за неудовлетворительного результата по данному параметру соединение 36 не было отобрано для расширенных испытаний наравне с производными доцетаксела и ММАЕ. Осуществленная схема превращения была предложена в качестве способа усиления цитотоксических свойств сложных эфиров бетулиновой кислоты (по атому С(28)) за счет получения гемиэфира щавелевой кислоты в положении С(3) кольца А. В настоящее время в нашей лаборатории проводится поиск перспективных аналогов соединения 36 с помощью синтеза схожих по структуре производных олеаноловой, урсоловой и глицирретиновой кислот. 5) Новые тривалентные лиганды. Кроме того, нами были синтезированы и изучены новые тривалентные лиганды для адресной доставки терапевтических или диагностических молекул в гепатоциты через ASGPR (схема 9, стр. 8 дополнительные материалы).). Далее с помощью реакций ацилирования аминогруппы карбоновой кислотой в присутствии активирующего реагента был получен ранее не описанный диагностический конъюгат лиганда 39 с флуоресцентным красителем Cy5 (схема 11, стр. 10 дополнительные материалы).). Показана высокая эффективность урониевой соли азабензотриазола (HATU) для сшивки аминогруппы лигандов с карбоновыми кислотами в синтезе ковалентных конъюгатов. Методами молекулярного докинга in silico и ППР-спектроскопии установлено, что полученные лиганды 29 и 30 имеют высокую аффинность к ASGPR (таблица 1, стр. 11 дополнительные материалы), оптимальную пространственную геометрию и гидрофильно-липофильный баланс. С помощью МТS-теста клеточной выживаемости in vitro определен низкий уровень цитотоксичности лигандов в отношении клеточных линий гепатокарциномы HepG2 и Huh7, рака простаты PC3, здоровых гепатоцитов HepaRG и эндотелиальных клеток кровеносных сосудов EA.hy926. Все значения ИК50 превысили предел 100 мкМ (таблица 2, стр. 13 дополнительные материалы). Кроме того, выявлено, что флуоресцентно-меченный конъюгат 39 проявляет специфическое накопление в клетках HepG2 в отличие от контрольной клеточной линии PC3, не экспрессирующей ASGPR (рис. 4-6, стр. 18-19 Дополнительных материалов). В результате показано, что разработанные в рамках настоящего проекта соединения 29 и 30 являются перспективными и высокоэффективными лигандами ASGPR для направленного транспорта в гепатоциты, которые могут быть использованы в дальнейшем для создания инновационных препаратов в терапии заболеваний печени. Например, в продолжение исследований нами впервые был синтезирован низкомолекулярный конъюгат 33 противомалярийного препарата артесуната с тривалентным лигандом асиалогликопротеинового рецептора 29 (схема 7, стр. 7 дополнительные материалы) для адресной доставки дигидроартемизинина в гепатоциты. В процессе его синтеза была показана высокая эффективность урониевой соли азабензотриазола (HATU) для сшивки аминогруппы лигандов с карбоновыми кислотами в синтезе ковалентных конъюгатов. Как и моновалентные производные артесуната, конъюгат 33 был апробирован против клеток гепатокарциномы. К сожалению, в данном случае также был получен отрицательный результат, ИК50 против клеток HepG2 и Huh7 значительно превышает 100 мкМ (таблица 2, стр. 13 дополнительные материалы). Таким образом, соединение 33 далее в рамках проекта не рассматривалось в качестве перспективного противоопухолевого агента для адресной терапии гепатоцеллюлярной карциномы. Однако оно может быть изучено на предмет активности против вирусов гепатита В и С, и против малярийных плазмодиев, патогенез которых также неразрывно связан с гепатоцитами. Работа в данном направлении продолжается в качестве диверсификации текущих исследований по адресной доставке в печень через ASGPR. Таким образом, основной результат выполненного проекта заключается в разработке перспективных агентов для лечения ГЦК, а также в изучении основных аспектов их биологической активности in vitro и in silico – связываемость с ASGPR рецептором, цитотоксичность, селективность действия, стабильность в физиологических условиях, внутриклеточное проникновение и накопление. По итогам испытаний были отобраны высокоактивные соединения-лидеры, определен вектор развития исследований.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".