| Результаты этапа: 1. Определены полные нуклеотидные последовательности митохондриальных геномов (МГ) двух видов мхов - Mielichhoferia elongata из группы так называемых “copper mosses” устойчивых к повышенным концентрациям тяжелых металлов и Polytrichum commune.
Митохондриальный геном M. elongata состоит из 100342 пар оснований (Рис. 1) и имеет в основном тот же набор генов и их порядок, как и у других изученных мхов. Такой размер митохондриального генома является наименьшим из известных для непаразитических наземных растений. Геном содержит 66 генов, при этом в отличие от большинства ранее секвенированных митогеномов мохообразных, он не обладает функциональным геном nad7.
Определенно содержание простых повторяющихся последовательностей (SSR) в митохондриальном геноме M. elongata, их количество равно 73. Распределение SSR по длинам неодинаково у разных видов, этот параметр может быть использован в дальнейших исследованиях в качестве филогенетического маркера.
Построено высоко поддерживаемое филогенетическое дерево по 31 белок-кодирующему участку для 40 видов мхов с печеночником в качестве внешней группы (Рис.2.). M. elongata представляет собой отдельную ветвь на филогенетическом дереве внутри Bryidae и располагается ближе всего к группе Hypnales / Ptychomniales / Orthotrichales. Отсутствие в настоящее время данных по MG последовательностям представителей Mniaceae и Bryaceae исключает уточнение таксономического положения Мелихоферия. Построенное дерево согласуется с другими реконструкциями, основанными на меньших наборах данных: 14–17 пластидных генов из 43 видов мхов, представляющих основные линии, обобщенные Chang, Sean & Graham (2013) и основанные на 41 митохондриальных белок-кодирующих генов из 19 видов Bryophyta (Liu et al., 2014). Хотя митохондриальные последовательности у растений эволюционируют медленно (Palmer & Herbon, 1988), наши данные свидеткльствуют, что филогеномный анализ может быть эффективен для таксонов мохообразных как низших, так и высших рангов.
Хотя митохондриальные геномы Bryophyta стабильны с точки зрения содержания генов, известны два других мха, B. aphylla и T. pellucida, у которых отсутствует интактная открытая рамка считывания гена nad7 в митохондриальных геномах. Нами установлено, что экзонная структура псевдогена nad7 у M. elongata существенно отличается от таковой у B. aphylla и T. pellucida (рис.3).
Реконструкция филогении и анализ структуры гена nad7, проведенный в нашем исследовании, свидетельствует о независимой псевдогенизации nad7 в разных линиях бриофитов
С учетом крайне далекого положения М. elongata относительно двух указанных видов на построенном филогенетическом дереве (рис. 2), можно заключить что потеря функциональности гена nad7, произошло как минимум дважды в течение эволюционной истории мхов.
Секвенированный нами митохондриальный геном Polytrichum commune имеет кольцевую форму и состоит из 114831 п.н., что превосходит длину большинства известных в настоящее время митохондриальных геномов мхов, за исключением Sphagnum palustre (141276 п.н.) и Atrichum angustatum (115146 п.н.), занимающих базальное положение на филогенетическом дереве, и содержит 67 генов и 89 локусов микросателлитов (SSR). Более детальный анализ структуры митохондриального генома Polytrichum commune в сопоставлении с данными для других бриофит будет осуществлен на следующем этапе работ по гранту.
2.Выявлены ранее не обнаруживаемые локусы TAS3 у мхов классов Sphagnopsida и Anthocerotopsida, у Marchantiophyta, а также локусы TAS6 у представителей Bryophyta, Tetraphidiopsida, Polytrichopsida, Andreaeopsida и Takakiopsida. Указанного результата удалось достичь, используя разработанную новую пару вырожденных ПЦР-праймеров - Spha-TASP и Spha-TASM, отличные от тех, которые использовались нами ранее (Красникова и др., 2011; 2013) и биоинформатический анализ известных к настоящему времени последовательностей. Полученные новые данные дополнительно раскрывают эволюционный путь miR390-зависимых локусов TAS3 у наземных растений. У харовых водорослей обнаружены последовательности, кодирующие супрессор сайленсинга гена 3 (SGS3), необходимого для генерации ta-siRNAs в растениях. На Рис. 4 представлено филогенетическое дерево, построенное по консервативным аминокислотным последовательностям белка SGS3. Сделано заключение, что что регуляторный путь экспресси генов, связанный с ta-siRNAs возник ещё на ранних этапах эволюции Viridiplantae.
3.Осуществлена реконструкция филогении рода Marsupella на основании вновь секвенированных участков ITS 1-2 ядерного рибосомного оперона и хлоропластного гена trnL-F и имеющихся в базе данных GenBank (всего 106 последовательностей из 53 образцов). Исследование основано, в значительной степени на материалах из Восточной Азии, где этот род таксономически разнообразен, но слабо изучен. В результате ревизована внутриродовая структура семейства, восстановлен видовой статус M. apertifolia Steph., обоснован видовой характер отличий и сделаны номенклатурные комбинации для M. patens (N. Kitag.) Bakalin & Fedosov и M. vermiformis (R.M. Schust.) Bakalin & Fedosov. Описано два новых для науки вида: корейский эндем M. koreana Bakalin & Fedosov, M. vietnamica Bakalin Fedosov и амфиатлантический-амфипацифический семикриптический M. subemarginata Bakalin & Fedosov. В целом показано, что ряд таксонов распространенных в Восточной Азии следует трактовать как отдельные виды, викарные к европейско-американским, а не морфологически отклоняющиеся восточноазиатские популяции циркумполярных видов.
4. Осуществлено выделение ДНК из 50 представителей родов Scapania, Nardia, Cephalozia и Schistochilopsis, собранных в частности в текущем году на о-ве Кунашир. Проведено секвенирование генов ITS 1-2, trnL-F и trnG (всего 91 последовательность) и их выравнивание.
Осуществлена предварительная реконструкция филогении исследованных образцов методом объединения соседей. Филогенетические деревья, построенные по пластидным генам (Рис. 5 а,б) имеют более высокое разрешение, чем по спейсерному участку ITS 1-2 ядерного рибосомного оперона. Во всех случаях выявляется гетерогенность рода Nardia, в составе которого обнаруживается 7 – 8 клад.
5. Разработан автоматический пайплайн SAPPHIRE, реализованный на языке C#; для создания графического интерфейса были использованы Windows Forms. Функционал данного программного продукта позволяет проводить основные этапы обработки данных высокопроизводительного секвенирования ампликонов с использованием более доступного для обычного пользователя графического интерфейса (GUI). Таким образом, SAPPHIRE позволит исследователям не владеющих опытом работы в Unix окружении и не имеющих существенного опыта в анализе NGS данных активно использовать их для реконструкции филогении и решения других повседневных задач. После доработки программного продукта на следующем этапе работы он будет открыт для свободного доступа.
6.Для выявления консервативных участков в уже известных геномах митохондрий мхов было проведено множественное варавнивание 39 последовательностей митохондриальных геномов с помощью программ MAFFT и Genious. Длина полученного выравнивания составляет 270722 пн. С помощью данного выравнивания было произведено выявление консервативных участков, фланкирующих вариабельные локусы генома. Всего было выявлено 48 консервативных участков.
6. Проводится подготовка кадров по молекулярной систематике печеночников – обучение в рамках служебной командировки в НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ молодого сотрудника БСИ ДВО РАН Ю.Д. Мальцевой, исполнителя проекта в 2019 г.
7. Опубликована статья «Митохондриальный геном мха Brachythecium rivulare (Hypnales, Brachytheciaceae)» по исседованиям, выполненных в рамках предыдущего гранта РФФИ № 15-04-06027. |
