ИСТИНА

В современном обществе наблюдается достаточно высокая частота бесплодия, до 40%, вызванного так называемым "мужским" фактором, когда ведущая роль в бесплодии принадлежит мужчине (Inhorn and Patrizio, 2015). По данным разных авторов в разных популяциях 10-20% мужчин репродуктивного возраста являются бесплодными (Barratt et al., 2017). Также наблюдается тренд уменьшения концентрации сперматозоидов среди мужчин западных стран в течение последнего полувека (Levine et al., 2017). Процессы сперматогенеза и созревания сперматозоидов включают в себя каскад эпигенетических изменений (Wu et al., 2015b). Изучение эпигенома сперматозоидов представляет очень перспективное направление по нескольким причинам. Во-первых, эпигенетические маркеры нарушения сперматогенеза и созревания сперматозоидов недостаточно изучены. Во-вторых, явно недостаточно изучено специфическое воздействие разнообразных факторов среды, включая химические факторы, на эпигеном. В-третьих, эпигенетические маркеры связаны с качеством и количеством сперматозоидов. И, в-четвертых, что может быть особенно важно - репрограммирование эпигенома половых клеток может быть передано следующему поколению, что может привести к нарушению развития потомства, как на этапе развития эмбриона, так и в последующей жизни. Эпигенетические изменения в сперматозоидах включают метилирование ДНК, малую РНК и модификацию гистонов. Из этих трех эпигенетических механизмов более изучено метилирование ДНК сперматозоидов в норме и при бесплодии, больше в животных моделях, меньше у человека (Laqqan et al., 2017, Xu et al., 2016) Профиль малой некодирующей РНК (snc RNA), к которой относят транспортную РНК (tRNA), микро РНК (mi RNA) и piRNA (Estill and Krawetz, 2016, Garcia-Lopez et al., 2015) в сперматозоидах на данный момент изучен существенно меньше. Недавно опубликованные данные свидетельствуют о наличии динамических изменений в профиле малой РНК сперматозоидов во время ее созревания в эпидидимусе. Целями заявляемого исследования являются: 1. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и лейкоцитов, его связи с хроническим перипубертатным воздействием химических веществ и качеством семени в проспективной когорте молодых мужчин, наблюдаемых с восьмилетнего возраста. 2. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и клеток печени, его связи с перинтальным воздействием промышленных ингибиторов горения (БДЭ-47) и качеством спермы в экспериментальной модели крыс. В предыдущем проекте РНФ (#14-45-00065) мы анализировали изменения в ДНК-метилировании и ретенции гистонов в сперматозоидах и соматических клетках молодых мужчин и лабораторных крыс, ассоциированных с воздействием факторов окружающей среды. Малые некодирующие РНК являются третьим основным механизмом эпигенетического репрограммирования клеток и тканей. В данном проекте мы исследуем профиль малой некодирующей РНК, используя те же биологические образцы, что были использованы для изучения метилирования ДНК, для получения полной картины эпигенетических изменений в сперматозоидах и соматических тканях, возникающих в результате воздействий химических веществ. Проект состоит из двух компонентов. Первый – это молекулярно-эпидемиологическое (эпигенетически-эпидемиологическое) исследование, для которого были получены образцы сперматозоидов и лейкоцитов молодых мужчин в ходе крупного родительского проспективного когортного исследования «Russian Children’s Health. Male Reproductive SubStudy», начавшегося в 2003 году. Это исследование является уникальным, как по периоду воздействия (перипубертат), по рассматриваемым химическим веществам (диоксины, свинец), так и по комплексу эпигенетических изменений (метилирование ДНК и профиль малой РНК) в сперматозоидах, выявляемых с помощью масштабного параллельного секвенирования. Для анализа была выбрана субкогорта 51 участников из когорты 516 мужчин. Второй компонент – это молекулярно-токсикологический эксперимент, который также является уникальным по нескольким факторам. Мы впервые в мире изучаем перинатальное воздействие БДЭ-47, представителя класса ингибиторов горения (антипиретиков), добавляемых в промышленных масштабах в оргтехнику, мебель и строительные материалы, на эпигеном сперматозоидов. В токсикологическом эксперименте была использована экспозиционная доза, релевантная средней экспозиции, которую испытывает человек в повседневной жизни. У животных впервые используется изучение эпигенома сперматозоидов в разные периоды их полового развития, на 65-ый (пубертат) и 120-ый (половозрелость) постнатальные дни. Методологической основой заявляемого проекта является технология масштабного параллельного секвенирования (NGS), которая будет использована для анализа изменения мнк РНК, выделенной из сперматозоидов и лейкоцитов крови мужчин и сперматозоидов и клеток печени лабораторных животных. Протокол выделения мнк РНК, проверка качества и создания библиотек разработан с участием нашего консультанта, Др. Кравец (Krawetz et al., 2011, Mao et al., 2013, Goodrich et al., 2013, Mao et al., 2014). мнк РНК из образцов сперматозоидов была успешно выделена в лаборатории д-ра Логачевой (рис. 2) в тестовом эксперименте, в котором использовались образцы, накопленные в ходе текущего исследования. Будет проведено секвенирование на Illumina HiSeq 2000 мнк РНК всех образцов, включая 51 образец сперматозоидов и 51 образец лейкоцитов мужчин, а также 36 образцов сперматозоидов и клеток печени крыс. Для проекта сформирована междисциплинарная международная команда исследователей на базе трех институтов, которая в ходе выполнения предыдущего проекта РНФ позволила успешно проделать запланированную работу по поиску молекулярных биологических маркеров воздействия промышленных химических веществ на геном репродуктивных клеток и фертильность у мужчин (проект РНФ 14-45-00065). Команда включает в себя репродуктивного эндокринолога и эпидемиолога (Сергеев), молекулярных биологов-генетиков с большим опытом лабораторной работы на современной приборной базе, включая HiSeq 2000 (Логачева, Штратникова, Ашапкин), молекулярного эпидемиолога, являющегося экспертом в области эпигеномики сперматозоидов (Пилзнер), молекулярного токсиколога-биолога (Суворов), биоинформатиков, специализирующихся на методах, применяемых в эпигенетике (Медведева, Шершебнев). У проекта есть консультанты, с которыми налажены давние связи в текущем лонгитудинальном проекте, финансируемом Национальным Институтом Здоровья США «Воздействие фталатов и химических смесей на пубертат и качество семени» (субконтрактное соглашение между Гарвардской Школой Общественного Здоровья и НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ). Это эпидемиолог, изучающий влияние химических веществ на репродуктивное здоровье, один из мировых лидеров в этой области, директор Департамента окружающей среды и здоровья Гарвардской школы общественного здоровья, Расс Хаузер и Стивен Кравец, США, автор протоколов выделения мнк РНК из спермотозоидов с последующим секвенированием и биоинформатическим анализом. У нашей команды имеется большой, в том числе совместный, опыт в доступе и использовании NGS (отчет проекта РНФ, http://xn--m1afn.xn--p1ai/prjcard?rid=14-45-00065) и изучения эпигенетических маркеров. Анализ изменения метилирования ДНК (проект РНФ 14-45-00065) выявил нарушения как в эпидемиологическом исследовании (сперматозоиды человека), так и в токсикологическом эксперименте (сперматозоиды крысы). В частности, мы идентифицировали 52 дифференциально метилированных региона (ДМР) в сперматозоидах в двух группах с наибольшей и наименьшей перипубертатной экспозицией диоксинами, используя образцы из проспективной субкогорты мальчиков\молодых мужчин (Pilsner et al., 2017). В экспериментальной модели на крысах, перинатально экспонированных БДЭ-47 (ингибитор горения), мы выявили 21 и 9 ДМР, сравнивая экспонированную группу и контрольную на 65 и 120 дни развития, соответственно (Suvorov et al., 2017). При изучении двух групп молодых мужчин с разным качеством семени, нами обнаружены 6 значимо дифференциально метилированных регионов (при разнице метилирования больше 10%, q < 0.05), ассоциированных с 6 генами (STC2, BVES-AS1, USP35, EFCAB13, KAZN, LOC101929268) в группе с пониженным качеством семени по сравнению с нормальным. Интересно, что два из 6 ДМР (BVES-AS1 и LOC101929268) ассоциированы с малой некодирующей РНК (мнкРНК), которые являются высокоэкспрессируемыми в яичках. Таким образом, ранее полученные данные о влиянии химических факторов среды на такие молекулярно-эпигенетические механизмы, как метилирование ДНК и ретенцию гистонов, наряду с изученным в рамках подаваемого проекта изменением профилей мнк РНК, лягут в основу комплексного подхода, раскрывающего методологически доступные на сегодняшний день изменения эпигенома сперматозоидов под воздействием химических факторов окружающей среды.

Today infertility rates caused by paternal factors are very high and sometimes reach 40% (Inhorn and Patrizio, 2015). Data from different studies indicate that 10-20% of reproductive age man are infertile in different populations (Barratt et al., 2017). During the last 50-year period concentrations of sperm go down continuously in western countries (Levine et al., 2017). Spermatogenesis and sperm maturation include significant epigenetic remodeling of the germ cell (Wu et al., 2015b). Studies of sperm epigenome is an important and potentially impactful direction of research due to several reasons. First, epigenetic markers of spermatogenesis disruption are yet poorly studied. Second, there is a significant knowledge gap in the understanding of effects of different environmental factors, including chemical exposures, on the sperm epigenome. Third, epigenetic markers are associated with sperm quantity and quality. Finally, the most important reason to study sperm epigenetics consists in the fact that epigenetic program altered by a variety of factors may be transferred to the next generation via the germline and result in the altered trajectories of embryonic and postnatal development. Epigenetic changes include changes in DNA methylation, histone modification and sncRNA. DNA methylation is the one that is better studied in healthy and infertile organisms both in animal models and in human populations (Laqqan et al., 2017, Xu et al., 2016). Profile of snc RNA, which include transfer RNAs (tRNAs), microRNAs (miRNAs), and piwiinteracting RNAs (piRNAs), (Estill and Krawetz, 2016, Garcia-Lopez et al., 2015) is a few investigated in sperms. Recent data from mouse have illustrated dynamic shifts in miRNA profiles of sperm during epididymal maturation. Specific aims of proposed study are following: To determine a profile of the small non-coding RNA of spermatozoa and leukocytes, and its associations with chronic peripubertal chemical exposures and sperm quality in a prospective cohort of young men recruited at 8 years of age. To determine a profile of the small non-coding RNA of spermatozoa and liver cells, and its associations with perinatal exposure to a flame retardant BDE-47 and sperm quality in a rat experimental model. At the previous RSF project (#14-45-00065) we have analyzed changes in DNA-methylation and histone retention in sperm and somatic cells of young men and laboratory rat in relation to environmental exposures. Small non-coding RNA represents the 3rd major mechanism of epigenetic programing of cells and tissues. In proposed Project we will address this remaining mechanism using the same set of biological samples to obtain complex understanding of epigenetic changes in sperm and somatic tissues due to chemical exposures. The proposed project consists of two parts: molecular epidemiological (epigenetic epidemiological) and toxicological. For molecular-epidemiological study sperm and leukocytes samples of 51 young adults were collected from unique parent prospective cohort study «Russian Children’s Study. Male Reproductive Health», conducted in 2003 with 516 participants that were 8-9 years old boys. The parent study is unique as 1) it is addressing peripubertal developmental window; 2) it is focusing on a unique set of environmental exposures (dioxins, lead); 3) it is addressing complex epigenetic changes in sperm (DNA methylation and small non-coding RNA) using NextGen massively parallel sequencing. For epigenetic analysis the subcohort of 51 young adults was selected. Second component of this application uses molecular toxicology approach and is also unique due to several factors. First it is the first study to analyze changes in sperm epigenome induced by BDE-47 – flame retardant added to a broad range of materials and goods, including building materials, furniture, computer cases and etc. In toxicological experiment with rats we used exposure doses relevant for human everyday exposures. Use of 2 time-points of sperm collection corresponds to puberty (postnatal day 65) and sexual maturity (postnatal day 120) and opens window to analyze dynamic changes in the sperm epigenome induced by early life exposures. We will use state of the art methods of massively parallel sequencing to analyze changes in small non coding RNA, extracted from human spermatozoa and leucocytes and spermatozoa and liver tissue of laboratory rats. Protocols of snc RNA isolation from the sperm, followed by prepare and test the libraries, assess their quality, sequencing and bioinformatics analysis developed by our consultant Dr. Kravets (Krawetz et al., 2011, Mao et al., 2013, Goodrich et al., 2013, Mao et al., 2014). Small non-coding RNA extraction from sperm samples were successfully accomplished in the laboratory of Dr. Pilsner and in the laboratory of Dr. Logacheva (figure 2). In fact Logacheva lab used sperm samples from the cohort that will be used in this study. We will extract snc RNA and sequenced 51 sperm sample and a 51 leukocytes sample in human. Additionally, we will get profile of snc RNA for 36 rat sperm samples and liver cells (12 sperm samples on the 65th postnatal day 12 sperm samples on 120 postnatal day and 12 samples liver at 120 minutes post-natal day). We have successful previous experience by this research team using NGS.At previous step of our research funded by RSF (№14-45-00065) we have analyzed changes in DNA methylation in spermatozoa and somatic cells of young men exposed to dioxins, lead and other xenobiotics during peripuberty and in spermatozoa and somatic cells of rats developmentally exposed to BDE-47. Using whole genome bisulfate sequencing (WGBS) for biological samples from our prospective cohort study we have identified 52 differentially methylated regions (DMRs) in subjects with highest levels of peripubertal exposures to dioxins in comparison with subjects with lowest peripubertal dioxins (Pilsner et al., 2017). In a framework of the same project supported by RSF we identified 21 and 9 DMRs in the sperm collected on postnatal days 65 and 120 respectively from rats exposed perinatally to brominated flame retardant BDE-47 (Suvorov et al., 2017).Today there are no available reliable methods for histone modification analysis in sperm. Therefore we have analyzed histone-protamine exchange in human and rat sperm. Finally, to build a complex picture of epigenetic changes in spermatozoa (and somatic cells as well) we plan to analyze sncRNA in the same set of human and rat samples and to investigate the association of profile sncRNA with peripubertal exposure to dioxins and lead in human and with perinatal exposure to BDE-47 in rats as well as with semen quality in both species. Given this compelling data regarding RNA changes in sperm, our proposed research is a next logical step to determine the relationship of environmental toxicants with small RNAs of sperm in humans. This study will be the first to discover all methodologically accessible changes in sperm epigenome due to chemical environmental exposures. This study will pave the road for the understanding of the role of paternal exposures in the health of offspring.

В рамках выполнения проекта будут определены изменения мнк РНК с помощью методов масштабного параллельного секвенирования в образцах сперматозоидов и лейкоцитов в выборке 51 молодых мужчин и в сперматозоидах и клетках печени крыс, экспонированных в перипубертатный период (мужчины) и перинатальный (крысы) загрязнителями окружающей среды, такими как свинец, диоксиноподобные соединения и ингибиторы горения (ПБДЭ). Мы предполагаем изучить отдельно каждое рассматриваемое химическое вещество (диоксины, свинец – в эпидемиологическом исследовании – 2 статьи, БДЭ-47 – у крыс – 1 статья) в качестве предиктора для профиля мнк РНК (RPKM- скорректированные значения) с учетом конфаундеров. Также будет изучена с использованием обобщенных оценивающих уравнений (GEE model) взаимосвязь мнк РНК с качеством семени и другими репродуктивными эффектами (1 статья). Далее мы определим координированность\различие изменений мнк РНК в сперматозоидах и соматических клетках (лейкоциты у мужчин – 1 статья, ткань печени – у крыс – 1 статья). В последующем анализе мы сосредоточимся на изучении связи изменения метилирования ДНК (результаты проекта РНФ №14-45-00065) и мнк РНК для более комплексного изучения эпигенетических изменений репрограммирования, возникающего при воздействии химических веществ на организм (1 статья). Полученная информация позволит проанализировать современными статистическими методами причинно-следственную связь перипубертатной (люди) и перинатальной (крысы) химической экспозиции (ВОЗДЕЙСТВИЕ), эпигенетических изменений (МЕХАНИЗМЫ, МОДИФИКАЦИЯ) и репродуктивных показателей, таких как качество семени (ИТОГ) в лонгитудинальном эпидемиологическом исследовании и экспериментальной животной модели. Токсикологическая модель на крысах, экспонированных БДЭ-47, позволит получить экспериментальное подтверждение результатов нашего эпидемиологического исследования, а также, что особенно значимо, полученную модель можно будет использовать в будущем для оценки рисков ухудшения мужского репродуктивного здоровья под воздействием различных химических экспозиций, включая фармакологические, и экспозиции веществами, входящими в состав диеты современного человека. Все вышеуказанные ожидаемые результаты будут получены впервые в мире и позволят: • во-первых, оптимизировать для данного материала (образцы крови, сперматозоидов - люди, сперматозоидов и клеток печени - крысы) методы анализа мнкРНК; • во-вторых, получить информацию о возможных изменениях мнкРНК в лейкоцитах и сперматозоидах мужчин, связанных с воздействием факторов окружающей среды (в частности, экспозиции свинцом и диоксинами); • в третьих, сравнить изменения мнкРНК в лейкоцитах и сперматозоидах (образцы человека) и в клетках печени и сперматозоидах в разные периоды полового развития (крысы); • в-четвертых, создать предпосылки для разработки лабораторной модели для относительно быстрого и экономически эффективного тестирования различных химических экспозиций на качество спермы и изменения мнкРНК в сперматозоидах и клетках печени. С учетом результатов предыдущего исследования, поддержанного РНФ (проект 14-45-00065), где было изучено метилирование ДНК с помощью редуцированного бисульфитного секвенирования (RRBS), мы получим комплексную картину эпигенетических изменений в сперматозоидах и соматических тканях, возникающих в результате воздействий химических веществ. Данное исследование будет первым исследованием, рассматривающим методологически доступные на сегодняшний день (метилирование ДНК и профиль мнк РНК) изменения в эпигеноме сперматозоидов, возникающие в результате воздействия нескольких классов химических веществ в экспериментальной модели и в проспективном эпидемиологическом исследовании. Исследование заложит фундамент в понимании механизмов передачи действия факторов окружающей среды с отцовской стороны будущему потомству. В целом, полученные в рамках выполнения проекта новые данные, вероятно, позволят разработать новые подходы для диагностики патологии, а также для прогнозирования и предотвращения патологии сперматозоидов и лечения нарушений фертильности у мужчин. Достижимость решения поставленных задач обуславливается наличием собранных образцов, наличием основного оборудования (Illumina HiSeq 2000), наличием протоколов, пилотных результатов возможности выделения мнкРНК на образцах и наличием команды с опытом совместной работы по проекту РНФ. Образцы собраны как для молекулярно-эпидемиологической части, так и для молекулярно-токсикологической. Оценка перипубертатной экспозиции диоксинами и свинцом рассматриваемой когорты произведена методом химического анализа содержания диоксиноподобных соединений в сыворотке и свинца в крови и детально описана ранее (Burns et al., 2009, Williams et al., 2010). Факторы-конфаундеры, потенциально влияющие на профиль малой некодирующей РНК и качество семени молодых мужчин, учтены и рассматривались в предыдущих публикациях (Minguez-Alarcon et al., 2017, Pilsner et al., 2017).

Ранее полученные данные о влиянии химических факторов среды на такие молекулярно-эпигенетические механизмы, как метилирование ДНК и ретенцию гистонов, наряду с изученным в рамках подаваемого проекта изменением профилей мнк РНК, лягут в основу комплексного подхода, раскрывающего методологически доступные на сегодняшний день изменения эпигенома сперматозоидов под воздействием химических факторов окружающей среды.

Целями заявляемого исследования являлись: 1. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и лейкоцитов, его связи с хроническим перипубертатным воздействием химических веществ и качеством семени в проспективной когорте молодых мужчин, наблюдаемых с восьмилетнего возраста. 2. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и клеток печени, его связи с перинтальным воздействием промышленных ингибиторов горения (БДЭ-47) и качеством спермы в экспериментальной модели крыс. Научный коллектив добился поставленных целей и решил запланированные задачи. Проект состоял из двух компонентов. Первый – это молекулярно-эпидемиологическое (эпигенетически-эпидемиологическое) исследование, для которого были получены образцы сперматозоидов и лейкоцитов молодых мужчин в ходе крупного родительского проспективного когортного исследования «Russian Children’s Health. Male Reproductive SubStudy», начавшеесяя в 2003 году. Это исследование является уникальным, как по периоду оцениваемого воздействия (перипубертат), по объему рассматриваемых факторов воздействия (химические вещества (разнообразные хлоорганические соединения, включая диоксины, свинец), социально-экономические факторы и факторы образа жизни), так и по комплексу эпигенетических маркеров (метилирование ДНК и профиль малой РНК), изученных в двух биологических средах (лейкоциты и сперматозоиды) одних и тех же молодых мужчин, выявленных с помощью масштабного параллельного секвенирования. Второй компонент – это молекулярно-токсикологический эксперимент, который также является уникальным по нескольким факторам. Мы впервые в мире изучили перинатальное воздействие БДЭ-47, представителя класса ингибиторов горения (антипиретиков), добавляемых в промышленных масштабах в оргтехнику, мебель и строительные материалы, на эпигеном сперматозоидов. В токсикологическом эксперименте была использована экспозиционная доза, релевантная средней экспозиции, которую испытывает человек в повседневной жизни. У животных впервые использовалось изучение эпигенома сперматозоидов в разные периоды их полового развития, на 65-ый (пубертат) и 120-ый (половозрелость) постнатальные дни. Методологической основой проекта являлась технология масштабного параллельного секвенирования (NGS), которая была использована для изучения профиля мнк РНК, выделенной из сперматозоидов и лейкоцитов крови мужчин и сперматозоидов и клеток печени лабораторных животных. Проект позволил оптимизировать, а в некоторых случаях, существенно улучшить, протоколы выделения РНК, подготовки библиотек, секвенирования и биоинформатического анализа для изучаемых биологических сред (печень, лейкоциты, сперматозоиды). Это особенно актуально для образцов сперматозоидов из эпидемиологического исследования с широким диапазоном количества клеток в эякуляте и аликвотах, от образцов с количеством менее 500 тысяч клеток до десятков миллионов. Научный коллектив успешно решил методологическую задачу получения профиля мнкРНК надлежащего качества из образцов с малым количеством сперматозоидов, подготовил статью в Systems Biology in Reproductive Medicine "Optimization of small RNA extraction and comparative study of NGS library preparation from low count sperm samples" и доложил результаты на 12 международном конгрессе по Андрологии-2020 (https://andrology2020-digital.de/). По результатам молекулярно-токсикологического эксперимента научный коллектив получил профили мнкРНК печени, а также сперматозоидов крыс в два периода их половой зрелости, на 65-ый (пубертат) и 120-ый (половозрелость) постнатальные дни. Мы сравнили возраст-ассоциированные изменения профиля мнкРНК в сперматозоидах крыс, а также изучили влияние на эти изменения экспозиции загрязнителем окружающей среды, бромированным антипиретиком БДЭ-47. Результаты опубликованы в статье «Aging induces profound changes in sncRNA in rat sperm and these changes are modified by perinatal exposure to environmental flame retardant» журнала «International Journal of Molecular Sciences». График-схема полученных находок представлена на рисунке 6. Пожалуй, самым неожиданным результатом данного исследования стало то, что у контрольных животных очень большое количество мнкРНК (1384) значимо меняет экспрессию в зависимости от возраста. В то же время экспозиция БДЕ-47, на первый взгляд, подавляет эти изменения (165 значимо возраст-зависимых мнкРНК). При более глубоком анализе мы обнаружили, что химическая экспозиция "ускоряет" возраст-зависимые изменения профиля малой РНК у молодых животных и "тормозит" у зрелых. Таким образом, профили малой РНК у молодых и зрелых экспонированных животных становятся более похожими друг на друга, чем таковые у контролей. Интересно, что анализ метилирования ДНК у тех же животных, выполненный в рамках предыдущего проекта РНФ нашей группой, выявил те же закономерности. Эта работа «Aging-induced changes in sperm DNA methylation are modified by low dose of perinatal flame retardants» была опубликована в журнале «Epigenomics”, и в ней наш научный коллектив впервые в мире продемонстрировал сопряженные возраст-ассоциированные изменения как в метиломе ДНК, так и в профиле мнкРНК сперматозоидов (Pilsner et al., 2020). Также мы обнаружили, что миРНК, претерпевающие наиболее существенные возрастные изменения у крыс в нашем исследовании (mir34с, mir449а, mir122), являются маркерами мужского бесплодия у человека. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эпигеном сперматозоидов претерпевает существенные возрастные изменения, которые могут сказываться на мужской фертильности, и нормальное течение этих возрастных изменений может быть нарушено химическими экспозициями. Для валидации метода и результатов масштабного параллельного секвенирования малой РНК методом ПЦР в реальном времени были использованы 3 значительно дифференциально экспрессированные миРНК в два возрастных периода сперматозоидов крыс (mir34с-5p, mir449а-5p, mir122-5p). В целом, результаты ПЦР в реальном времени подтвердили результаты секвенирования (рис. 5). Анализ влияния перинатальной экспозиции БДЭ-47 на изменение профиля малой РНК печени крыс продемонстрировал изменения в молекулярных каскадах, ответственных за инсулиновый сигналинг, диабет второго типа и стеатоз печени. Таким образом, полученные результаты впервые в мире демонстрируют, что экспозиция крыс БДЭ-47 на ранних этапах развития меняет эпигеном печени таким образом, что может влиять на метаболизм жиров и углеводов. Эти результаты полностью соответствуют ранее описанным эффектам БДЭ-47 на метаболический профиль организма и позволяют идентифицировать эпигенетические механизмы в качестве механизмов, ответственных за долгосрочное поддержание аберрантного метаболического фенотипа печени. Результаты были опубликованы в статье «Rat liver epigenome programing by perinatal exposure to 2,2',4'4'-tetrabromodiphenyl ether» журнала «Epigenomics” (Suvorov, Naumov, et al., 2020). В рамках эпигенетически-эпидемиологического исследования научным коллективом впервые в мире описан профиль малой РНК, включая миРНК, пиРНК и фрагменты тРНК, среди 42 образцов лейкоцитов и 49 образцов сперматозоидов молодых мужчин, с попарным профилем у 40 здоровых мужчин. В попарном датасете профиль мнкРНК лейкоцитов состоял из 1458 мнкРНК, включая 264 зрелых миРНК и 447 прекурсоров миРНК, 427 пиРНК и 320 фрагментов тРНК со средним количеством каунтов в матрице более 10. Профиль мнкРНК сперматозоидов включал 2265 мнкРНК (136 зрелых миРНК и 234 прекурсоров миРНК, 1546 пиРНК и 349 фрагментов тРНК со средним количеством каунтов в матрице более 10). Подтверждена клеткоспецифичность профилей мнкРНК при сравнении профилей сперматозоидов и лейкоцитов, из общего количества 3021 мнкРНК, представленных или в сперматозоидах или лейкоцитах одних и тех же мужчин, только 702 мнкРНК (23%) были общими. Коэффициент корреляции Спирмена между экспрессией всех мнкРНК в парах сперматозоидов и лейкоцитов составил 0.1-0.3 (рис. 3), а отдельно для миРНК он был несколько выше, 0.1-0.5 (рис. 4). Научный коллектив впервые в мире получил результаты взаимосвязи параметров качества семени с профилем мнкРНК среди 49 здоровых мужчин молодого возраста. Эти результаты были доложены в устном докладе на 12 международном конгрессе по Андрологии-2020 (https://andrology2020-digital.de/). В качестве интегрального параметра, характеризующего качество семени, был выбран показатель «Общее количество прогрессивно подвижных сперматозоидов», включающий характеристику объема эякулята, концентрации сперматозоидов и количества прогрессивно подвижных сперматозоидов. Обнаружено 102 мнкРНК, значимо дифференциально экспрессированных в зависимости от общего количества прогрессивно подвижных сперматозоидов, p-value, FDR adjusted <0.05 (Таблица 3). Функциональный анализ дифференциально экспрессированных 5 миРНК и связанных с ними 1282 потенциальных мишеней - белок-кодирующих генов, показал высоко значимые (-log10(P)>10) биологические категории, связанные с эмбриональным развитием, ответом на факторы роста и гормоны (рис. 7). Впервые в мире проведен масштабный анализ зависимости профиля мнкРНК как отдельно в сперматозоидах и лейкоцитах мужчин, так и сопряженные изменения в двух типах клеток в зависимости от перипубертатной экспозиции широким спектром хлорорганических соединений, включая самый токсичный конгенер диоксинов, 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксин (ТХДД), суммарную концентрацию по группам химикатам (диоксины, фураны, диоксиноподобные ПХБ, недиоксиноподобные ПХБ), суммарный диоксиновый эквивалент (ДЭ). С учетом недавних находок о связи хлорорганических пестицидов с качеством семени, опубликованных нашим научным коллективом в журнале «Environmental International” в статье «"Peripubertal serum concentrations of organochlorine pesticides and semen parameters in Russian young men» (Abou Ghayda et al., 2020) отдельно проанализирован профиль мнкРНК сперматозоидов и лейкоцитов в зависимости от пестицидов и их метаболитов, таких как гексахлорбензол (ГХБ), гексахлорциклогексан (ГХЦГ) и дихлордифенил дихлорэтилен (ДДЭ). Также отдельно были получены результаты по влиянию перипубертатной экспозиции свинцом на профиль мнкРНК у мужчин молодого возраста. Более того, получены результаты по сопряженным изменениям профиля мнкРНК и метилома ДНК в лейкоцитах и сперматозоидах одних и тех же мужчин в зависимости от экспозиции химическими веществами: хлорорганическими соединениями и свинцом. Для поиска связанных геномных регионов с дифференциально метилированными CpG в нашем исследовании, использовался пакет annotatr, а для дифференциально экспрессированных миРНК – miRDbase. В результате были составлены списки белок-кодирующих генов для каждого из четырех датасетов (мнкРНК лейкоцитов, мнкРНК сперматозоидов, CpG лейкоцитов, CpG сперматозоидов) и выявлены списки генов, присутствующих во всех 4 датасетах для изучаемых факторов экспозиции (Таблица 5). Так, для экспозиции самым токсичным конгенером ТХДД, было обнаружено 14 генов, суммарными диоксинами – 14, хлорорганическим пестицидом ГХБ – 175, а свинцом – 16. Обнаружен один ген, SIX1 (sine oculis homeobox 1), имеющий отношение к воздействию экспозицией всеми рассматриваемыми хлорорганическими соединениями. В литературе данный ген описан как онкоген, его экспрессия значительно увеличивается при развитии многих видов карцином. Описаны некоторые миРНК, для которых SIX1 является мишенью, в частности, miR-140-5p, а по результатам нашего исследования mir-140-precursor и miR-140-3p значимо дифференциально экспрессированы в сперматозоидах в зависимости от экспозиции ТХДД. Результаты функционального анализа демонстрируют связь экспозиции хлорорганическими соединениями со многими процессами эмбрионального развития и органогенеза (рис. 9, 10, 11). Готовится статья по эпигеному лейкоцитов и сперматозоидов мужчин молодого возраста. Готовятся статьи по эффектам перипубертатного воздействия хлорорганических соединений и свинца на эпигеном сперматозоидов, а также на эпигеном лейкоцитов. Готовится статья по взаимосвязи эпигенетических маркеров, гормональных маркеров и качества семени. Таким образом, впервые в мире показаны сопряженные изменения профиля мнкРНК и метилома как сперматозоидов, так и лейкоцитов человека, связанные с процессами эмбрионального развития и органогенеза. Особенную роль имеют выявленные изменения в сперматозоидах, которые несут эпигенетическую информацию последующему поколению. Наш научный коллектив следует современной концепции отцовских первопричин здоровья и болезней (англ. Paternal Origins of Health and Disease, POHaD), основанной на научных данных, говорящих о том, что воздействие факторов окружающей среды на отца может играть роль в репрограммировании здоровья следующего поколения на протяжении всей жизни, а возникшие изменения могут быть переданы через поколения посредством сложных и разнообразных эпигенетических механизмов. Опубликована обзорная статья (Sergeyev & Nikitin, 2019) на эту тему, написана обзорная статья о «Возраст-ассоциированных изменения эпигенома сперматозоидов». В целом, полученные в рамках выполнения проекта новые данные закладывают фундамент для разработки новых подходов обнаружения новых биомаркеров как влияния факторов окружающей среды, биомаркеров, связанных с фертильностью, так и специфических «отцовских» биомаркеров репрограммирования здоровья следующих поколений.