ИСТИНА

Процессы обновления тканей лежат в основе поддержания гомеостаза всех многоклеточных организмов. На протяжении жизни человека обновлению подвержены большинство тканей организма, а нарушение процессов замещения клеток новыми ассоциировано с целым рядом серьезных заболеваний и патологий. Обновление тканей происходит преимущественно за счет пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Мезенхимные стволовые клетки (МСК) способны дифференцироваться в клетки тканей мезодермального происхождения, такие, как адипоциты, остеобласты, хондробласты. Другая важная функция МСК – это паракринная регуляция близлежащих клеток ткани. МСК, являясь важными регуляторами функционирования ткани, сами подвержены строгой нейро-гуморальной регуляции. МСК непосредственно контактируют с симпатическими нейронами, образуя с ними подобие синапсов, и, располагаясь периваскулярно, регистрируют гормональный фон организма. Ранее, изучая гормональную чувствительность МСК, мы обнаружили, что они проявляют существенную функциональную гетерогенность по чувствительности к различным гормонам. Кроме того, мы обнаружили механизм транзиторной гетерологической сенситизации адренорецепторов, который приводит к временному переключению сигнализации, активируемой норадреналином, с бета-адренорецептор/цАМФ-зависимой на альфа1А-адренорецептор/кальций-зависимую. В данной работе мы выясним, каким образом происходит формирование функциональной гетерогенности стволовых клеток. На модельной системе мы установим, как осуществляется изменение и созревание сигнальных систем при переходе клеток из состояния плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток в мультипотентные мезенхимные стволовые клетки и далее в терминально дифференцированные клетки. Механизмы формирования функциональной гетерогенности МСК необходимо выяснить для возможного использования этих клеток в регенеративной медицине. Это позволит управлять терапевтическим потенциалом МСК и предотвращать нежелательные побочные эффекты использования гетерогенной популяции клеток.

Tissue regeneration processes are at the root of homeostasis maintenance in all multicellular organisms. Most of the tissues undergo regeneration throughout the human lifespan, while the disruption of cell renewal processes is associated with multiple serious disorders and illnesses. Tissue regeneration is provided mostly by proliferation and differentiation of the stem cells. Mesenchymal stem cells (MSC) have the capacity to differentiate into the cells of mesodermal origin, such as adipocytes, chondroblasts and osteoblasts. The other important role played by MSCs consists in paracrine regulation of the nearby cells in the tissue. While MSCs are the major regulators of tissue homeostasis, they are themselves subjects of strict neuroendocrine control. MSCs have direct synapse-like contacts with sympathetic neurons; and as they reside perivascularly, MSCs detect the levels of different hormones. Previously we have studied hormonal sensitivity of MSCs and have found that they exhibit significant functional heterogeneity in their response to different hormones. Moreover, we have discovered the mechanism of heterologous sensitization of adrenoceptors, which leads to transient epinephrine signaling switch – from β-adrenoceptor/cAMP-dependent to alpha-adrenoceptor/Ca2+-dependent. In this study, we are going to find out how the functional heterogeneity of stem cells is formed. Using a model system, we will elucidate the mechanisms of signaling systems development during the transition of stem cells from pluripotent (embryonic stem cells) to multipotent (mesenchymal stem cells) state and further to terminally differentiated cells. The clarification of mechanisms of functional heterogeneity development in MSCs is necessary for potential application of these cells in regenerative medicine. It will help us to manage therapeutic potential of MSCs and prevent undesirable side effects of heterogenic cell population utilization.

Будет отработан протокол дифференцировки линейных эмбриональных стволовых клеток в мезенхимные стволовые клетки. Эффективность процессов дифференцировки будет доказана как при помощи поверхностных маркеров (маркеры плюрипотентности будут исчезать в процессе дифференцировки, а маркеры мультипотентности МСК – появляться), так и при помощи функциональных тестов на мультипотентность – МСК будут дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлениях. Мезенхимные стволовые клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, будут охарактеризованы в соответствии с официальным определением этих клеток. Мы ожидаем, что большинство клеток популяции (более 90%) будет нести маркеры МСК: CD73, CD90 и CD105 и на них будет отсутствовать маркер белых клеток крови CD45. Эти клетки будут сравнены с клетками первичной культуры МСК из жировой ткани мыши по уровню экспрессии этих маркеров, по способности дифференцироваться в адипоциты и остеобласты, а также по способности к клональному росту (образование КОЕ-Ф). Мы ожидаем, что существенных различий по этим параметрам не будет, все они будут на достаточно высоком уровне. В процессе анализа способности отвечать на различные гормоны и нейромедиаторы МСК, полученных из ЭСК, мы ожидаем, что картина будет схожей с ответами на гормоны МСК человека: суммарная популяция будет отвечать на большинство апплицированных гормонов, но отдельные клетки будут проявлять функциональную гетерогенность. Характер ответов на гормоны эмбриональных стволовых клеток предположить намного сложнее. Первый вариант – еще не дифференцированные клетки способны чувствовать множество гормонов одновременно, и в зависимости от того, какие гормоны действуют на клетку, формируется в процессе дифференцировки в МСК функциональная гетерогенность. В этом случае будет проверено, существует ли функциональная гетерогенность ответов эмбриональных стволовых клеток на гормоны. Мы предполагаем, что популяция ЭСК существенно более гомогенная, чем МСК. Другой возможный вариант – эмбриональные стволовые клетки приобретают чувствительность к отдельным гормонам в процессе своей дифференцировки. Тогда они не будут отвечать на гормоны в плюрипотентном состоянии, а чувствительность к гормонам будет появляться в процессе дифференцировки. Будет выяснено, как изменяется функциональная гетерогенность популяции МСК при направлении клеток в адипогенную дифференцировку в динамике. Мы ожидаем, что большая часть клеток популяции, направившихся в адипогенную дифференцировку (обычно это 50-70% клеток популяции), станут гомогенными по чувствительности к гормонам. Оставшиеся клетки, вероятно, сохраняют функциональную гетерогенность. Можно предположить, что клетки, не входящие в адипогенную дифференцировку, или не могут в нее войти, так как коммитированы в другом направлении дифференцировки, или сохраняют стволовость для поддержания пула стволовых клеток в популяции. Будет выяснено, как появление норадреналина влияет на изменение гормональной чувствительности эмбриональных и мезенхимных стволовых клеток, а также полученных из них адипоцитов. Поскольку, согласно нашему предположению, способность МСК к гетерологической сенситизации альфа1А-адренорецепторов – это свойство стволовых клеток, которое сохраняется ими со времени эмбрионального развития, можно предположить, что эмбриональные стволовые клетки тоже будут проявлять гетерологическую сенситизацию адренорецепторов. Если норадереналин будет изменять гормональную чувствительность ЭСК, будет выяснено, как это свойство клеток изменяется в динамике. Далее, после направления МСК в адипоцитарную дифференцировку, согласно нашему предположению, это свойство будет теряться по мере входа клеток в дифференцировку. Установить, могут ли гормоны, отличные от норадреналина, осуществлять гетерологическую сенситизацию адренорецепторов в МСК. Мы предполагаем, что другие гормоны, способные активировать внутриклеточный синтез цАМФ, способны сенситизировать адренергические рецепторы в МСК. Если это так, то для них будут выяснены внутриклеточные сигнальные каскады, ответственные за это.