ИСТИНА

Проект посвящен актуальной проблеме - выяснению молекулярного механизма электрогенного переноса протонов и сопряжения его с переносом электронов в терминальных гем-медных оксидазах. Эти мембранные ферменты являются ключевым звеном дыхательных цепей митохондрий и бактерий, обеспечивая каталитическое восстановление кислорода до воды и образование протон-движущей силы. Помимо переноса на кислород субстратных протонов, они способны к редокс-зависимому перекачиванию протонов через мембрану. В отличие от канонических оксидаз семейства А, гем-медные оксидазы семейства B мало изучены, но обладают уникальным механизмом, позволяющим им перекачивать протоны с разной стехиометрией, использовать единственный протон-проводящий путь для субстратных и перекачиваемых протонов, обходиться без карбоксильных аминокислотных остатков в качестве промежуточных доноров протонов. Научная новизна исследования состоит в идентификации промежуточных стадий переноса электронов и протонов в ходе каталитического цикла неканонических гем-медных оксидаз. Значимыми научными результатами должны стать: выяснение траекторий проведения протонов, функциональной роли протон-проводящих путей, особенностей сопряжения перекачивания протонов с катализируемой реакцией восстановления кислорода, выяснение используемых внутрибелковых доноров протонов в неканических молекулярных протонных насосах разных типов.

The project is devoted to the actual problem - elucidation of the molecular mechanism of electrogenic proton transfer and its coupling with electron transfer in terminal heme-copper oxidases. These membrane enzymes are a key part of the respiratory chains of mitochondria and bacteria, providing a catalytic reduction of oxygen to water and the formation of proton-motive force. In addition to transferring the substrate protons to oxygen, they are capable of redox-dependent pumping of protons through the membrane. In contrast to the canonical oxidases family, heme-copper oxidase family B are poorly understood, but have a unique mechanism that allows them to pump protons with different stoichiometry, using only proton-conductive pathway for substrate and pumped protons, without the carboxyl of amino acid residues as the intermediate donor of protons. Scientific novelty of the research is to identify intermediate stages of transfer of electrons and protons during the catalytic cycle of the non-canonical heme-copper oxidases. Significant scientific results should be: clarifying the trajectories of protons, the functional role of proton-conducting paths, the features of coupling of proton pumping with the catalyzed oxygen reduction reaction, the elucidation of the use of intraprotein proton donors in noncanonical molecular proton pumps of different types.

1) Подобрать условия для эффективного встраивания рекомбинатной цитохромоксидазы семейства B, цитохрома ba3 из T.thermophilus дикого типа и мутантных форм в протеолипосомы. Подобрать условия для эффективного приклеивания протеолипосом со встроенными белками к макроскопической мембране. 2) Разрешить и охарактеризовать кинетику генерации мембранного потенциала рекомбинатной цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus дикого типа в быстрой реакции полностью восстановленного фермента с кислородом. 3) Подобрать условия для эффективного встраивания мутантов ретинального белка из Exiguobacterium sibiricum (ESR) с заменами по остатку лизина в позиции K96, соответствующей внутреннему карбоксильному донору протона D96 в бактерирородопсине. Подобрать условия для эффективного приклеивания протеолипосом со встроенными белками к макроскопической мембране. 4) Разрешить и охарактеризовать быструю кинетику генерации мембранного потенциала в ретинальном белке ESR с заменой остатка лизина на гидрофобный остаток аланина (K96A). 5) Разрешить и охарактеризовать быструю кинетику спектральных изменений в оптическом диапазоне в ходе каталитического цикла ESR с мутацией K96A. Соотнести разрешаемые стадии в кинетике генерации мембранного потенциала с таковыми в фотоцикле ESR с мутацией K96A.

Впервые проведено исследование с временным разрешением каталитического цикла цитохромоксидазы ba3-типа из Thermus thermophilus, характеризующейся частичной редукцией способности к трансмембранной перекачке протонов. Выявлено отличие оксидаз семейств А и B в локализации внутреннего акцептора протона в кинетическом интермедиате F. Впервые показано, что возможной причиной сниженной усредненной эффективности протонного насоса ba3 цитохромоксидазы из T. thermophilus является отсутствие сопряженного трансмембранного переноса протона в ряде одноэлектронных стадий каталитического цикла. Установлено, что при восстановлении низкоспинового гема b каталитический биядерный центр окисленной цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus переходит в открытое состояние и приобретает способность связывать внешние лиганды. Выяснены особенности структуры и свойства каталитического интермедиата E (одноэлектронная форма) цитохромоксидазы ba3-типа и caa3 из T. thermophilus. Исследованы отдельные стадии переноса электронов и протонов в каталитическом цикле цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus. Выявлены эффекты, вызванные присутствием дополнительного редокс-центра, гема цитохрома с. Впервые разрешена кинетика генерации мембранного потенциала цитохромоксидазы ba3-типа из T. thermophilus, сопряженная с одноэлектронным вoсстановлением окисленного отрелаксированного и высоко реактивного состояний O и OH, соответственно. Впервые разрешена кинетика генерации мембранного потенциала ретинальным белком из Exiguobacterium sibiricum (ESR).

1) Подобраны условия для эффективного встраивания рекомбинатной цитохромоксидазы семейства B, цитохрома ba3 из T.thermophilus дикого типа и мутантных форм в протеолипосомы. Подобрать условия для эффективного приклеивания протеолипосом со встроенными белками к макроскопической мембране. 2) Разрешена и охарактеризована кинетика генерации мембранного потенциала рекомбинатной цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus дикого типа в быстрой реакции полностью восстановленного фермента с кислородом. 3) Подобрать условия для эффективного встраивания мутантов ретинального белка из Exiguobacterium sibiricum (ESR) с заменами по остатку лизина в позиции K96, соответствующей внутреннему карбоксильному донору протона D96 в бактерирородопсине. Подобрать условия для эффективного приклеивания протеолипосом со встроенными белками к макроскопической мембране. 4) Разрешить и охарактеризована быструю кинетика генерации мембранного потенциала в ретинальном белке ESR с заменой остатка лизина на гидрофобный остаток аланина (K96A). 5) Разрешена и охарактеризована быстрая кинетика спектральных изменений в оптическом диапазоне в ходе каталитического цикла ESR с мутацией K96A.