Изучение механизмов активации киназ RIP1 и RIP3 при индукции нового типа клеточной гибели-некроптоза в клетках карциномы яичника для поиска мишеней для лекарственных препаратов и создания новых терапевтических подходовНИР

Investigation of the mechanisms of activation of the kinases RIP1 and RIP3 upon induction of the new type of cell death necroptosis in ovarian carcinoma cells for the uncovering new targets for pharmacological interference and development of more efficient therapeutic approaches

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 14 февраля 2018 г.-31 декабря 2018 г. Изучение механизмов активации киназ RIP1 и RIP3 при индукции нового типа клеточной гибели-некроптоза в клетках карциномы яичника для поиска мишеней для лекарственных препаратов и создания новых терапевтических подходов
Результаты этапа: Проведены исследования структуры и функции макромолекулярных комплексов, индуцирующих некроптоз в клетках карциномы яичников.
2 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. изучение механизмов активации киназ RIP1 и RIP3 при индукции нового типа клеточной гибели-некроптоза в клетках карциномы яичника для поиска мишеней для лекарственных препаратов и создания новых терапевтических подходов
Результаты этапа: В рамках проекта к концу 2019 года были изучены в клетках карциномы яичника CAOV-4 молекулярные механизмы образования макромолекулярного комплекса - некросомы под действием ДНК-повреждающего агента цисплатина. Некроптоз является новым и одним из наименее изученных типов программируемой клеточной гибели (ПКГ). Основными регуляторами данного типа ПКГ являются серин-треониновые киназы RIPК1 и RIPК3, активация которых происходит в макромолекулярном комплексе - некросоме или, в так называемом комплексе IIb. Также, следует отметить, что активация киназ RIPК1 и RIPК3 напрямую зависит от активности инициаторной каспазы-8, которая способна расщеплять данные киназы, и, таким образом, ингибировать некроптоз. Таким образом для запуска данного типа ПКГ необходимо эффективное ингибирование активности каспазы-8. Для ингибирования каталитической активности каспазы-8 в данном проекте был использован ингибитор активности каспаз широкого действия – zVAD-fmk. Именно этот ингибитор каспаз широко используется в мировой практике для подавления активности данных ферментов, в том числе и для запуска некроптоза. Именно данная методика ингибирования активности каспаз и индукции некроптоза одобрена мировым научным сообществом. Ингибитор zVAD-fmk добавлялся к клеткам карциномы яичника CAOV-4 в концентрации 50 µM вместе с цисплатином, в концентрации 70 µM. На предыдущем этапе проекта (2018 г) было показано, что именно данные условия являются оптимальными для запуска некроптоза в данной клеточной линии. Более того, для проверки эффективности входа клеток в некроптоз и действия ингибитора каспаз была проведена серия контрольных экспериментов по индукции клеточной гибели и измерению активности каспаз. В результате выполнения экспериментов был показан эффективный запуск некроптотической клеточной гибели и отсутствие активации каспаз. Также, для оценки входа клеток в некроптоз в данных условиях использовался метод определения степени фосфорилирования белка RIPК1. Все использованные в настоящем проекте методики одобрены Номенклатурным Комитетом по исследованию гибели клеток и являются необходимыми измерениями для подтверждения входа клетки в некроптотический тип гибели. Проведенный анализ показал, что концентрация 50 µM zVAD-fmk является оптимальной для индукции некроптоза в клетках карциномы яичника CAOV-4. Также, с помощью данных методик удалось показать, что концентрация цисплатина 70 µM является оптимальной для индукции некроптоза в клетках карциномы яичника CAOV-4. Таким образом, на предыдущем этапе проекта в 2018 г удалось подобрать оптимальные концентрации агента повреждающего ДНК - цисплатина и ингибитора каспаз zVAD-fmk для эффективного входа в клеток в некроптоз, и именно в данных условиях было решено изучать молекулярные механизмы образования макромолекулярного комплекса некросомы на настоящем этапе проекта (2019 г). На этапе проекта 2019, для выделения комплекса некросома, с целью изучения молекулярных механизмов ее образования, было решено применить метод иммунопреципитации. Для проведения иммунопреципитации были разработаны методики с использованием антител к различным компонентам комплекса некросомы, что, в свою очередь, является необходимым условием доказательства сборки исследуемого макромолекулярного комплекса, так называемая ко-иммунопреципитация за различные ключевые компоненты изучаемого комплекса. Прежде всего на этом этапе проекта были использованы антитела к одному из центральных компонентов комплекса некросомы - прокаспазе-8. Прокаспаза-8 содержит два DED домена: DED1 и DED2, за которыми следуют каталитические домены р18 и р10 (детальное описание структуры прокаспазы-8 представлено в обзоре Иванисенко, 2019, приложенной к отчету за 2019 г.). Для проведения экспериментов были подобраны антитела, которые связываются с р18 доменом белка прокаспазы-8. Данный выбор был основан на предположении, что DED домены белка прокаспазы-8 должны быть вовлечены в образование комплекса некросома через гомотипические взаимодействия между DED доменами DED-содержащих белков с-FLIP, FADD, прокаспаза-10 и прокаспаза-8. Таким образом, иммунопреципитация через р18 домен белка прокаспазы-8 не должна препятствовать связыванию с другими белками в данном комплексе и должна позволить выделить комплекс некросома в полном составе. Для проведения экспериментов, клетки карциномы яичника CAOV-4 были обработаны как цисплатином в концентрации 70 µM, так и пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk в концентрации 50 µM, после чего проводилось лизирование клеток с помощью детергента ТритонХ100. На следующем этапе было проведено фракционирование лизатов клеток карциномы яичника CAOV-4, как обработанных цисплатином и zVAD-fmk, так и необработанных. Фракционирование проводилось с помощью гель–фильтрации. Иммунопреципитация проводилась при инкубации лизатов клеток карциномы яичника CAOV-4 из различных фракций после гель-фильтрации с антителами и протеин А сефарозой. Детали данной методики иммунопреципитации с использованием антител против каспазы-8 были опубликованы в статье (Замараев с коллегами, 2019), которая приложена к данному отчету. Состав комплекса, иммунопреципитированного с помощью антител к каспазе-8, был проанализирован с помощью методов количественного и качественного Вестерн Блота. В результате данного анализа в составе выделенного комплекса были детектированы белки RIPК1, с-FLIP, FADD, прокаспаза-10 и прокаспаза-8, что свидетельствует о полной сборке макромолекулярного комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4 под действием цисплатина и ингибитора каспаз (Рисунок 1а). В качестве контроля данного эксперимента использовалась иммунопреципитация из лизатов клеток, полученных из высокомолекулярных фракций и не обработанных цисплатином, а также ингибитором каспаз. В данных условиях белки RIPК1, с-FLIP, FADD и прокаспаза-10 в иммунопреципитатах из клеток карциномы яичника CAOV-4 не были обнаружены. Более того, наше предположение о том, что, используя антитела против р18 домена каспазы-8, можно иммунопреципитировать комплекс некросома оказалось подтвержденным экспериментальными данными. Таким образом, можно сделать предположение о том, что именно DED домен прокаспазы-8 должен быть вовлечен в образование комплекса некросома через гомотипические взаимодействия между DED доменами DED-содержащих белков с-FLIP, FADD и прокаспазы-10. При этом, сборка данного комплекса наблюдалась при проведении иммунопреципитации из высокомолекулярной фракции, а не из низкомолекулярных фракций, что действительно подтверждает сборку высокомолекулярного комплекса, включающего в себя белки RIPК1, с-FLIP, FADD, прокаспазу-10 и прокаспазу-8 в клетках карциномы яичника CAOV-4, что, в свою очередь, свидетельствует о специфичности нашего метода. Более того, все изоформы белков с-FLIP, прокаспазы-10 и прокаспазы-8 были детектированы в данных экспериментах, а именно короткая и длинная изоформы белка с-FLIP; прокаспаза-10а и прокаспаза-10д; прокаспаза-8а и прокаспаза-8б, что полностью согласуется с предполагаемым составом данного комплекса и подтверждает специфичность используемых антител (Рисунок 1а). На следующем этапе была проведена иммунопреципитация с использованием антител против другого белка данного комплекса, а именно белка FADD. В данном случае было решено использовать антитела против С-концевой части белка FADD, которая согласно нашим предположениям, не должна была участвовать в образовании комплекса некросома. Состав комплекса, который был ко-иммунопреципитирован с помощью антител против белка FADD из клеток карциномы яичника CAOV-4, был проанализирован с помощью методов количественного и качественного Вестерн Блота. При этом, клетки карциномы яичника CAOV-4 были обработаны цисплатином и ингибитором каспаз, с последующим фракционированием и лизисом, в таких же условиях как для иммунопреципитации с использованием антител против каспазы-8. В результате данного анализа в составе комплекса, иммунопреципитированного с помощью антител против белка FADD, также были детектированы белки RIPК1, с-FLIP, прокаспаза-10 и прокаспаза-8 (Рисунок 1б). Таким образом, предположение о том, что, используя антитела против С-концевого домена белка FADD, можно иммунопреципитировать комплекс некросома оказалось подтвержденным экспериментальными данными. При этом, также как в случае иммунопреципитации с помощью антител против каспазы-8, сборка данного комплекса наблюдалась при проведении иммунопреципитации из высокомолекулярной фракции, а не из низкомолекулярных фракций, что независимо подтверждает сборку высокомолекулярного комплекса. Также, все изоформы белков с-FLIP, прокаспазы-10 и прокаспазы-8 были детектированы и в данных экспериментах, а именно, короткая и длинная изоформы белка с-FLIP; прокаспаза-10а и прокаспаза-10д; прокаспаза-8а и прокаспаза-8б, что является еще одним независимым контролем наших экспериментов (Рисунок 1б). Также, как в случае иммунопреципитации с помощью антител против каспазы-8 в качестве контроля данного эксперимента использовалась иммунопреципитация из лизатов клеток, полученных из высокомолекулярных фракций и не обработанных цисплатином, а также ингибитором каспаз. И также, в данных условиях белки RIPК1, с-FLIP и прокаспаза-8/10 не были обнаружены в иммунопреципитатах, что свидетельствует о специфичной сборке комплекса некросома под действием цисплатина. Фосфорилирование белка RIPК1 (рRIPК1) согласно Номенклатурному Комитету по исследованию гибели клеток является необходимым измерением для подтверждения входа клетки в некроптоз и активации комплекса некросомы. Фосфорилирование белка RIPК1 (рRIPК1) является первым инициаторным шагом в запуске некроптотической клеточной гибели. Более того, фосфорилирование белка RIPК1 происходит в комплексе некросома. На основании этой информации было предположено, что проведение иммунопреципитации через фосфорилированную форму белка RIPК1 - рRIPК1 позволит иммунопреципитировать комплекс некросомы в активированном состоянии. Поэтому, на следующем этапе проекта, было решено провести иммунопреципитацию комплекса некросома с помощью антител против фосфорилированного белка RIPК1 (рRIPК1). При этом, клетки карциномы яичника CAOV-4 были обработаны цисплатином и ингибитором каспаз, с последующим лизисом клеток, в таких же условиях как для иммунопреципитации с использованием антител против каспазы-8 и белка FADD. При этом, так же было использовано фракционирование клеток для отделения высокомолекулярных от низкомолекулярных фракций с последующей иммунопреципитацией из высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций. В результате данного анализа в составе комплекса, иммунопреципитированного с помощью антител против белка рRIPК1, были детектированы белки RIPК1, с-FLIP, FADD, прокаспаза-10 и прокаспаза-8 (Рисунок 1в). При этом, также как в случае иммунопреципитации с помощью антител против каспазы-8 и FADD, сборка данного комплекса детектировалась при проведении иммунопреципитации из высокомолекулярной фракции, а не из низкомолекулярных фракций, что подтверждает образование высокомолекулярного активированного комплекса в клетках карциномы яичника CAOV-4. Более того, аналогично с предыдущими экспериментами, все изоформы белков с-FLIP, прокаспазы-10 и прокаспазы-8 были детектированы и в данных экспериментах, а именно, короткая и длинная изоформы белка с-FLIP; прокаспаза-10а и прокаспаза-10д; прокаспаза-8а и прокаспаза-8б (Рисунок 1б). Таким образом, с помощью проведенных экспериментов и применения инновационных методик иммунопреципитации, удалось установить состав комплекса некросомы в клетках карциномы яичника CAOV-4, и показать, что он содержит киназы RIPK1 и RIPK3, адапторный белок FADD, короткую и длинную изоформы белка с-FLIP; прокаспазу-10а и прокаспазу-10д; прокаспазу-8а и прокаспазу-8б. Подбор антител, с помощью которых проводилась иммунопреципитация, позволил сделать вывод о том, что в сборке комплекса некросома участвуют два основных домена: DD домены RIPK1 и белка FADD, DED домены белков с-FLIP, FADD, прокаспазы-10 и прокаспазы-8. При этом, сборка комплекса происходит за счет гомотипических взаимодействий между DD и DED доменами. Следует отметить, что при использовании всех трех подходов иммунопреципитации из клеток карциномы яичника CAOV-4, важной задачей являлось изучение присутствия прокаспазы-2 в комплексе некросома. Данная задача была поставлена в связи с тем, что на предыдущем этапе проекта в 2018 г, было показано, что каспаза-2 является негативным регулятором процесса некроптоза, индуцируемого через добавление цисплатина к клеткам карциномы яичника CAOV-4 (Zamaraev, 2018). Однако, несмотря на эффективно функционирующие антитела против каспазы-2, которые позволяли успешно детектировать данный белок в лизатах клеток карциномы яичника CAOV-4 при анализе методом Вестерн Блота, детектировать данный белок в составе комплекса некросома, иммунопреципитированного из данных клеток, не удалось. Таким образом, проведенное исследование позволило сделать вывод об отстуствии данного белка в изучаемом комплексе. Последний факт можно объяснить с точки зрения первичной структуры каспазы-2. Действительно, каспаза-2 содержит CARD домен, который необходим для ее рекрутирования в комплексы ее активации. Однако, у каспазы-2 отсутствуют DD и DED домены, за счет которых происходит связывание белков в комплекс некросома. Таким образом, каспаза-2 не содержит домена для гомотипического взаимодействия, который необходим для ее связывания в комплекс некросома, что было окончательно подтверждено на этапе проекта 2019 г. Однако, как показано ранее каспаза-2 является негативным регулятором некроптоза. Механизм данной регуляции требует дополнительных исследований. На следующем этапе, с помощью методов количественной масс-спектрометрии с использованием технологии AQUA пептидов были проанализированы соотношения между белками в комплексе некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4. Для проведения данного анализа были получены иммунопреципитаты комплекса некросома, к которым добавлялись AQUA пептиды. Данный подход позволил определить абсолютные количества белков в изучаемом комплексе с помощью передовых методов масс-спектрометрии, что позволило сделать выводы о механизмах активации киназ RIPK1 и RIPK3 в составе данного комплекса. В частности, впервые было установлено соотношение между киназами RIPK1 и RIPK3 в составе данного макромолекулярного комплекса и было показано, что киназа RIPK1 представляет собой основной компонент некросомы, в то время как количество киназы RIPK3 приблизительно в 10 раз меньше в этом комплексе (Рис. 2). Данный анализ говорит о том, что активация киназы RIPK3, по-видимому, является скорость-определяющей для входа клетки в некроптоз. Также полученные данные предполагают необходимость существования пороговой концентрации белка RIPK1 для сборки данного комплекса. Другой интересной особенностью данного комплекса является соотношения между DED-содержащими белками с-FLIP, FADD, прокаспазой-10 и прокаспазой-8 (Рис. 2). Характерной особенностью комплекса DISC, который инициирует апоптоз, как было показано нами ранее также с применением метода количественной масс-спектрометрии, является образование так называемых DED-цепей, в которых происходит активация каспазы-8 (Schleich 2012). При этом, количество каспазы-8 в данном комплексе превышает количество белка FADD в 10 раз. Однако, при сборке комплекса некросома, соотношение между прокаспазой-8 и белком FADD примерно одинаковое. Данные результаты показывают, что комплекс некросома существует только при равных соотношениях между данными белками. Такая стехиометрия также говорит об отсутствии образования DED-цепей и активации каспазы-8 в данном комплексе, что является необходимым условием для запуска некроптоза. Действительно, как было упомянуто выше, активация киназ RIPК1 и RIPК3 напрямую зависит от активности инициаторной каспазы-8, которая способна расщеплять данные киназы, и, таким образом, ингибировать данный тип ПКГ. Таким образом для запуска данного типа ПКГ необходимо эффективное ингибирование активности каспазы-8, что и осуществляется за счет отсутствия образования DED-цепей. Изучению более детальных механизмов данных процессов в клетках карциномы яичника CAOV-4 будет посвящен следующий этап данного проекта.
3 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. механизм активации киназ RIP1 и RIP3 при индукции нового типа клеточной гибели-некроптоза в клетках карциномы яичника для поиска мишеней для лекарственных препаратов и создания новых терапевтических подходов
Результаты этапа: В рамках проекта была изучена способность клеток карциномы яичника CAOV-4 образовывать макромолекулярный комплекс – некросому, а также молекулярные механизмы функционирования данного комплекса, под действием цисплатина – агента, повреждающего ДНК. Программа клеточной гибели (ПКГ) - некроптоз является новым и наименее изученным типом ПКГ. Механизм образования комплексов, инициирующих данный вид ПКГ при действии агентов повреждающих ДНК, является одним из ключевых направлений современных биомедицинских исследований. В рамках данного проекта были проведены исследования с использованием самых современных методов анализа макромолекулярных комплексов индуцирующих клеточную гибель, которые позволили установить образование комплекса некросома, при повреждении ДНК в клетках карциномы яичника. Новейшие технологии иммунопреципитации были применены для изучения образования некроптотических комплексов и определения их состава в клетках карциномы яичника CAOV-4. Анализ проведенный в рамках данного проекта можно разбить на несколько этапов. Одним из ключевых этапов современных технологий иммунопреципитации является использование набора специфических антител к различным белкам изучаемого комплекса. Именно, анализ методом иммунопреципитации с использованием антител к различным компонентам макромолекулярного комплекса является важнейшим этапом доказательтва его образования. Состав комплекса некросома, выделенного в результате иммунопреципитации с использованием различных антител, был проанализирован с помощью методов количественного и качественного Вестерн Блота. В результате данного анализа в составе комплекса иммунопреципитируемого с помощью различных антител были обнаружены основные компоненты комплекса некросома-киназы: RIPК1 и RIPК3, а также белки ФАДД, ФЛИП и прокаспаза-8. Таким образом, было показано, что комплекс некросома образуется в клетках карциномы яичника CAOV-4 при действии цисплатина. Более того, при анализе образования макромолекулярных комплексов важным этапом является изучение их сборки на протяжении нескольких временных промежутков и широкого интервала концентраций агентов, индуцирующих изучаемый тип гибели. Для подбора оптимальных условий образования комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4 был использован широкий интервал концентраций цисплатина от 35 до 400 µM. После проведения детального анализа, для образования комплекса некросома были выбраны условия обработки цисплатином в концентрации 70 µM в комбинации с пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk в концентрации 50 µM. Данные условия приводили к самому высокому уровню иммунопреципитации комплекса некросомы. Важно, что при обработке клеток карциномы яичника CAOV-4 только цисплатином в концентрации 70 µM, без добавления ингибитора каспаз, эффективного образования комплекса некросома не наблюдалось, что подтвердило необходимость ингибирования каспазной активности и апоптоза для сборки данного комплекса. Важным контролем функциональности образуемого комплекса является проверка индукции соответствующего клеточного ответа в изучаемых условиях. Для того чтобы показать, что образование комплекса некросома предшествует некроптозу, индукция данного типа ПКГ определялась с использованием передового метода измерения клеточной гибели с помощью проточного цитофлуориметра с функцией визуализации клеток Amnis FlowSight (Merck Millipore). Для проведения данного анализа клетки были обработаны цисплатином а также цисплатином в комбинации с ингибитором каспаз и затем были окрашены аннексином V, конъюгированным с FITC, а также пропидием йодида (ПИ). Следует отметить, что именно данный тип анализа является общепринятым в мировом сообществе для определения индукции определенного типа ПКГ. Использование данного подхода позволило определить количество клеток, находящихся в позднеапоптотической и некроптотической популяциях. Критерием разделения данных популяций стали морфологические изменения клетoк: во время позднего апоптоза происходит образование апоптотических телец, при этом клетки сжимаются, что также сопровождается конденсацией хроматина; в то время как при некроптотической гибели, клетки, наоборот, набухают и увеличиваются в размерах. Данные морфологические различия были детально проанализированы с помощью специальных программ проточного цитофлуориметра с функцией визуализации клеток Amnis FlowSight (Merck Millipore), что позволило определить количество клеток в некроптотической и апоптотической популяциях. Проведенный анализ показал, что при добавлении ДНК-повреждающего агента - цисплатина в концентрации 70 µM происходилa индукция как апоптотической, так и некроптотической гибели клеток, при этом, количество клеток которые подвергались апоптозу и некроптозу было примерно одинаково. Однако, при добавлении цисплатина в концентрации 70 µM в комбинации с пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk в концентрации 50 µM наблюдалось значительное увеличение количества клеток, которые входят в некроптотический тип ПКГ. Таким образом, данные исследования с использованием передовых методов проточной цитометрии позволили сделать вывод о том, что добавление ДНК-повреждающего агента - цисплатина в концентрации 70 µM в комбинации с пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk в концентрации 50 µM ведет к некроптозу. Важным контролем образования изучаемого комплекса является не только его иммунопреципитация, но и проверка его активности. Основным показателем активности комплекса некросома, одобренный мировым сообществом по изучению гибели клеток является фосфорилирование белка РИПК1. Поэтому, для анализа активности комплекса некросома, был применен метод определения степени фосфорилирования белка RIPК1 с помощью количественного Вестерн Блота при обработке клеток карциномы яичника CAOV-4 цисплатином в концентрации 70 µM в комбинации с пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk в концентрации 50 µM. В частности, изучалось фосфорилирование белка RIPK1, то есть было исследовано присутствие фосфорилированной формы RIPК1 (pRIРК1). Проведенный анализ позволил выявить наличие фосфорилированной формы данного белка при добавлении цисплатина в концентрации 70 µM в комбинации с пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk в концентрации 50 µM, что позволяет подтвердить активность комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4. Еще одним важным критерием образованием комплекса является детекция компонентов изучаемого комплекса в высокомолекулярных фракциях, которые можно получить при фракционировании клеточных лизатов. Для оценки способности клеток карциномы яичника CAOV-4 образовывать макромолекулярный комплекс некросому была проведена гель-фильтрация образцов, обработанных цисплатном совместно с zVAD-fmk, с последующим Вестерн Блот анализом высокомолекулярных фракций. Именно данные подходы являются передовыми в мировой науке для изучения образования высокомолекулярных комплексов. Данный анализ позволил установить присутствие основных компонентов комплекса некросома в высокомолекулярных фракциях и, таким образом, подтвердить его сборку. Таким образом, для изучения сборки комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4 при действии цисплатина в рамках данного проекта были разработаны и применены следующие методы: -- Иммунопреципитация с использованием набора специфических антител против различных белков данного комплекса -- Количественный и качественный Вестерн Блот - Измерение фосфорилирования белка РИПК1 для контроля активности данного комплекса -- Проверка входа клеток в некроптоз с помощью проточной цитометрии с функцией визуализации -- Изучение образования высокомолекулярного комплекса некросома с помощью гель-фильтрации образцов с последующим Вестерн Блот анализом высокомолекулярных фракций Именно данные методики одобрены Номенклатурным Комитетом по исследованию гибели клеток и являются необходимыми измерениями для подтверждения входа клетки в некроптотический тип гибели и образования комплекса некросома. Следующим этапом данного проекта стало дальнейшее изучение молекулярных механизмов образования макромолекулярного комплекса - некросомы под действием ДНК-повреждающего агента цисплатина в клетках карциномы яичника CAOV-4. В частности, основной задачей явилась изучение основных доменов белков, которые образуют комплекс некросома. Основная гипотеза состояла в том что данный комплекс образуется за счет взаимодействия DD доменов белков ФАДД и РИПК1, DED доменов белков ФАДД, прокаспаза-8/10 и ФЛИП, а также RHIM доменов киназ РИПК1 и РИПК3. Таким образом, белки РИПК1 и ФАДД являются ключевыми адапторами необходимыми для образования данного комплекса. Для того чтобы проверить данную гипотезу было решено применить метод иммунопреципитации. Для проведения иммунопреципитации были разработаны методики с использованием антител к различным доменам белков комплекса некросома и таким образом позволяют охарактеризовать основные домены необходимые для сборки комплекса. Прежде всего на этом этапе проекта были использованы антитела к одному из центральных компонентов комплекса некросомы - прокаспазе-8. Прокаспаза-8 содержит два DED домена: DED1 и DED2, за которыми следуют протеазные домены р18 и р10. Для проведения экспериментов были подобраны антитела, которые связываются с р18 протеазным доменом белка прокаспазы-8. Данный выбор был основан на предположении, что DED домены белка прокаспазы-8 должны быть вовлечены в образование комплекса некросома через гомотипические взаимодействия между DED доменами DED-содержащих белков с-FLIP, FADD, прокаспаза-10 и прокаспаза-8. Таким образом, иммунопреципитация через р18 домен белка прокаспазы-8 не должна препятствовать связыванию с другими белками в данном комплексе и должна позволить выделить комплекс некросома в полном составе. Для проведения экспериментов, клетки карциномы яичника CAOV-4 были обработаны как цисплатином в концентрации 70 µM, так и пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk в концентрации 50 µM, после чего проводилось лизирование клеток с помощью детергента ТритонХ100. На следующем этапе было проведено фракционирование лизатов клеток карциномы яичника CAOV-4, как обработанных цисплатином и zVAD-fmk, так и необработанных. Фракционирование проводилось с помощью гель–фильтрации. Иммунопреципитация проводилась при инкубации лизатов клеток карциномы яичника CAOV-4 из различных фракций после гель-фильтрации с антителами и протеин А сефарозой. Детали данной методики иммунопреципитации с использованием антител против каспазы-8 были опубликованы в статье (Замараев с коллегами, 2019), которая приложена к данному отчету. Состав комплекса, иммунопреципитированного с помощью антител к каспазе-8, был проанализирован с помощью методов количественного и качественного Вестерн Блота. В результате данного анализа в составе выделенного комплекса были детектированы белки RIPК1, с-FLIP, FADD, прокаспаза-10 и прокаспаза-8, что свидетельствует о полной сборке макромолекулярного комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4 под действием цисплатина и ингибитора каспаз. В качестве контроля данного эксперимента использовалась иммунопреципитация из лизатов клеток, полученных из высокомолекулярных фракций и не обработанных цисплатином, а также ингибитором каспаз. В данных условиях белки RIPК1, с-FLIP, FADD и прокаспаза-10 в иммунопреципитатах из клеток карциномы яичника CAOV-4 не были обнаружены. Более того, наше предположение о том, что, используя антитела против р18 домена каспазы-8, можно иммунопреципитировать комплекс некросома оказалось подтвержденным экспериментальными данными. Таким образом, можно сделать предположение о том, что именно DED домен прокаспазы-8 должен быть вовлечен в образование комплекса некросома через гомотипические взаимодействия между DED доменами DED-содержащих белков с-FLIP, FADD и прокаспазы-10. При этом, сборка данного комплекса наблюдалась при проведении иммунопреципитации из высокомолекулярной фракции, а не из низкомолекулярных фракций, что действительно подтверждает сборку высокомолекулярного комплекса, включающего в себя белки RIPК1, с-FLIP, FADD, прокаспазу-10 и прокаспазу-8 в клетках карциномы яичника CAOV-4, что, в свою очередь, свидетельствует о специфичности нашего метода. Более того, все изоформы белков с-FLIP, прокаспазы-10 и прокаспазы-8 были детектированы в данных экспериментах, а именно короткая и длинная изоформы белка с-FLIP; прокаспаза-10а и прокаспаза-10д; прокаспаза-8а и прокаспаза-8б, что полностью согласуется с предполагаемым составом данного комплекса и подтверждает специфичность используемых антител. На следующем этапе была проведена иммунопреципитация с использованием антител против другого белка данного комплекса, а именно белка FADD. В данном случае было решено использовать антитела против С-концевой части белка FADD, которая согласно нашим предположениям, не должна была участвовать в образовании комплекса некросома. Состав комплекса, который был ко-иммунопреципитирован с помощью антител против белка FADD из клеток карциномы яичника CAOV-4, был проанализирован с помощью методов количественного и качественного Вестерн Блота. При этом, клетки карциномы яичника CAOV-4 были обработаны цисплатином и ингибитором каспаз, с последующим фракционированием и лизисом, в таких же условиях как для иммунопреципитации с использованием антител против каспазы-8. В результате данного анализа в составе комплекса, иммунопреципитированного с помощью антител против белка FADD, также были детектированы белки RIPК1, с-FLIP, прокаспаза-10 и прокаспаза-8. Таким образом, предположение о том, что, используя антитела против С-концевого домена белка FADD, можно иммунопреципитировать комплекс некросома оказалось подтвержденным экспериментальными данными. Данный результат позволяет сделать вывод о том что DD домены белка ФАДД и DED домены белка ФАДД необходимы для сборки данного комплекса. При этом, также как в случае иммунопреципитации с помощью антител против каспазы-8, сборка данного комплекса наблюдалась при проведении иммунопреципитации из высокомолекулярной фракции, а не из низкомолекулярных фракций, что независимо подтверждает сборку высокомолекулярного комплекса. Также, все изоформы белков с-FLIP, прокаспазы-10 и прокаспазы-8 были детектированы и в данных экспериментах, а именно, короткая и длинная изоформы белка с-FLIP; прокаспаза-10а и прокаспаза-10д; прокаспаза-8а и прокаспаза-8б, что является еще одним независимым контролем наших экспериментов. Также, как в случае иммунопреципитации с помощью антител против каспазы-8 в качестве контроля данного эксперимента использовалась иммунопреципитация из лизатов клеток, полученных из высокомолекулярных фракций и не обработанных цисплатином, а также ингибитором каспаз. И также, в данных условиях белки RIPК1, с-FLIP и прокаспаза-8/10 не были обнаружены в иммунопреципитатах, что свидетельствует о специфичной сборке комплекса некросома под действием цисплатина. Данные результаты позволяют сделать вывод о том, что DD и DED домены белка ФАДД необходимы для формирования комплекса некросома. Фосфорилирование белка RIPК1 (рRIPК1) согласно Номенклатурному Комитету по исследованию гибели клеток является необходимым измерением для подтверждения входа клетки в некроптоз и активации комплекса некросомы. Фосфорилирование белка RIPК1 (рRIPК1) является первым инициаторным шагом в запуске некроптотической клеточной гибели. Более того, фосфорилирование белка RIPК1 происходит в комплексе некросома. На основании этой информации было предположено, что проведение иммунопреципитации через фосфорилированную форму белка RIPК1 - рRIPК1 позволит иммунопреципитировать комплекс некросомы в активированном состоянии, а также подтвердить роль DD доменов и RHIM доменов белка РИПК1 в образовании данного комплекса, поскольку сайт фосфорилирования белка РИПК1 располагается между этими двумя доменами. Поэтому, на следующем этапе проекта, было решено провести иммунопреципитацию комплекса некросома с помощью антител против фосфорилированного белка RIPК1 (рRIPК1). При этом, клетки карциномы яичника CAOV-4 были обработаны цисплатином и ингибитором каспаз, с последующим лизисом клеток, в таких же условиях как для иммунопреципитации с использованием антител против каспазы-8 и белка FADD. При этом, так же было использовано фракционирование клеток для отделения высокомолекулярных от низкомолекулярных фракций с последующей иммунопреципитацией из высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций. В результате данного анализа в составе комплекса, иммунопреципитированного с помощью антител против белка рRIPК1, были детектированы белки RIPК1, с-FLIP, FADD, прокаспаза-10 и прокаспаза-8. При этом, также как в случае иммунопреципитации с помощью антител против каспазы-8 и FADD, сборка данного комплекса детектировалась при проведении иммунопреципитации из высокомолекулярной фракции, а не из низкомолекулярных фракций, что подтверждает образование высокомолекулярного активированного комплекса в клетках карциномы яичника CAOV-4. Более того, аналогично с предыдущими экспериментами, все изоформы белков с-FLIP, прокаспазы-10 и прокаспазы-8 были детектированы и в данных экспериментах, а именно, короткая и длинная изоформы белка с-FLIP; прокаспаза-10а и прокаспаза-10д; прокаспаза-8а и прокаспаза-8б. Таким образом, с помощью проведенных экспериментов и применения инновационных методик иммунопреципитации, удалось установить состав комплекса некросомы в клетках карциномы яичника CAOV-4, и показать, что он содержит киназы RIPK1 и RIPK3, адапторный белок FADD, короткую и длинную изоформы белка с-FLIP; прокаспазу-10а и прокаспазу-10д; прокаспазу-8а и прокаспазу-8б. Подбор антител, с помощью которых проводилась иммунопреципитация, позволил сделать вывод о том, что в сборке комплекса некросома, по-видимому, участвуют следующие домены: DD домены RIPK1 и FADD, DED домены белков с-FLIP, FADD, прокаспазы-10 и прокаспазы-8, а также RHIM домены белка РИПК1. При этом, сборка комплекса, по-видимому, происходит за счет гомотипических взаимодействий между DD, RHIM и DED доменами. Следующим важным этапом проекта являлось изучение присутствия прокаспазы-2 в комплексе некросома. Данная задача была поставлена в связи с тем, что нами было показано, что каспаза-2 является негативным регулятором процесса некроптоза, индуцируемого через добавление цисплатина к клеткам карциномы яичника CAOV-4 (Zamaraev, 2018). Однако, несмотря на эффективно функционирующие антитела против каспазы-2, которые позволяли успешно детектировать данный белок в лизатах клеток карциномы яичника CAOV-4 при анализе методом Вестерн Блота, детектировать данный белок в составе комплекса некросома, иммунопреципитированного из данных клеток, не удалось. Таким образом, проведенное исследование позволило сделать вывод об отсутствии данного белка в изучаемом комплексе некросомы. Последний факт можно объяснить с точки зрения структурной организации каспазы-2. Каспаза-2 содержит CARD домен, который необходим для ее рекрутирования в комплексы ее активации. Однако, у каспазы-2 отсутствуют DD, RHIM и DED домены, за счет которых происходит связывание белков в комплекс некросома. Таким образом, каспаза-2 не содержит домена для гомотипического взаимодействия, который необходим для ее связывания в комплекс некросома. Однако, как было показано в нашей лаборатории, каспаза-2 также является негативным регулятором некроптоза (Детали опубликованы в статье:Замараев с коллегами, 2018, которая приложена к данному отчету). Одним из возможных механизмов является влияние фосфорилирования каспазы-2 на запуск некроптоза и ее связывания с комплексом некросома. Изучение фосфорилирования каспазы-2 было также инициировано в рамках данного проекта (Детали опубликованы в статье:Замараев с коллегами, 2020, которая приложена к данному отчету). Однако, детальный механизм данной регуляции требует дополнительных исследований. На следующем этапе, с помощью методов количественной масс-спектрометрии с использованием технологии AQUA пептидов были проанализированы соотношения между белками в комплексе некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4. Для проведения данного анализа были получены иммунопреципитаты комплекса некросома, к которым добавлялись AQUA пептиды. Данный подход позволил определить абсолютные количества белков в изучаемом комплексе с помощью передовых методов масс-спектрометрии, что позволило сделать выводы о механизмах активации киназ RIPK1 и RIPK3 в составе данного комплекса. В частности, впервые было установлено соотношение между киназами RIPK1 и RIPK3 в составе данного макромолекулярного комплекса и было показано, что киназа RIPK1 представляет собой основной компонент некросомы, в то время как количество киназы RIPK3 приблизительно в 10 раз меньше в этом комплексе. Данный анализ говорит о том, что активация киназы RIPK3, по-видимому, является скорость-определяющей для входа клетки в некроптоз. Также полученные данные предполагают необходимость существования пороговой концентрации белка RIPK1 для сборки данного комплекса. Другой интересной особенностью данного комплекса является соотношения между DED-содержащими белками с-FLIP, FADD, прокаспазой-10 и прокаспазой-8. Характерной особенностью комплекса DISC, который инициирует апоптоз, как было показано нами ранее также с применением метода количественной масс-спектрометрии, является образование так называемых DED-цепей, в которых происходит активация каспазы-8. При этом, количество каспазы-8 в данном комплексе превышает количество белка FADD в 10 раз. Однако, при сборке комплекса некросома, соотношение между прокаспазой-8 и белком FADD примерно одинаковое. Данные результаты показывают, что комплекс некросома существует только при равных соотношениях между данными белками. Такая стехиометрия также говорит об отсутствии образования DED-цепей и активации каспазы-8 в данном комплексе, что является необходимым условием для запуска некроптоза. Действительно, как было упомянуто выше, активация киназ RIPК1 и RIPК3 напрямую зависит от активности инициаторной каспазы-8, которая способна расщеплять данные киназы, и, таким образом, ингибировать данный тип ПКГ. Таким образом для запуска данного типа ПКГ необходимо эффективное ингибирование активности каспазы-8, что и осуществляется за счет отсутствия образования DED-цепей. Таким образом, для изучения молекулярных механизмов сборки комплекса некросома и подтверждения его состава в рамках данного проекта были разработаны и применены следующие методы: -- инновационные методы иммунопреципитации с анализом вовлечения различных доменов изучаемых белков в сборку комплекса -- изучение присутствия прокаспазы-2 в комплексе некросома и механизмов негативной регуляции сборки данного комплекса -- изучение стехиометрических соотношений между компонентами комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4 с помощью методов количественной масс-спектрометрии Для ингибирования каталитической активности каспазы-8 был использован ингибитор активности каспаз широкого действия – zVAD-fmk. Именно данный ингибитор активности каспаз широко используется в мировой практике для ингибирования активности данных ферментов, и именно данная методика ингибирования активности каспаз одобрена мировым научным сообществом. Ингибитор активности каспаз zVAD-fmk добавлялся к клеткам карциномы яичника CAOV-4 в различных концентрациях от 5 до 50 µM в комбинации с цисплатином в концентрации 70 µM. Результаты Вестерн Блота показали, что в клетках карциномы яичника Caov-4 происходила активация некроптотической гибели клеток и образование комплекса некросомы, о чем свидетельствовалa детекция белков RIPК1, RIPК3 и фосфорилированной формы RIPК1 (pRIPК1) в высокомолекулярной фракции. Данный анализ показал, что концентрация 50 µM zVAD-fmk является оптимальной для индукции фосфорилирования белка RIPК1 в клетках карциномы яичника CAOV-4. Также, с помощью данных методик было проанализировано влияние различных концентраций цисплатина на индукцию комплекса некросома, при этом, удалось показать, что концентрация цисплатина 70 µM является оптимальной для индукции образования комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4. Таким образом, нам удалось подобрать оптимальные концентрации цисплатина и ингибитора каспаз zVAD-fmk для эффективного входа в клеток в некроптоз. В ходе заключительного года проекта, 2020, основное внимание было сосредоточено на изучении пост-трансляционных модификаций комплекса некросома в клетках карциномы яичника CAOV-4 при действии цисплатина. В частности, были изучены две основные пост-трансляционные модификации: фосфорилирование и протеолиз. Было предположено, что две данные модификации будут играть две противоположные роли в индукции образования комплекса некросома и процесса некроптоза в клетках карциномы яичника CAOV-4. В частности, было предположено, что индукция фосфорилирования белка РИПК1 необходима для сборки некросомы, в то время как протеолитическое расщепление белка РИПК1 приводит к ингибированию формирования комплекса некросома и данного пути ПКГ. Таким образом, две данные модификации играют две строго противоположные роли: инициации и ингибирования некроптотической клеточной гибели, соответственно. Для изучения пост-трансляционных модификаций одним из основных подходов в мировой литературе является применение фармакологических ингибиторов фосфорилирования и протеолиза. Поэтому в рамках проекта 2020 были применены методы фармакологического ингибирования с использованием ингибиторов фосфорилирования белка RIP1К: nec-1, nec-1s и nec-5, а также ингибитора каспаз zVAD-fmk, который ингибирует протеолитическое расщепление, катализируемое каспазами. В ходе проекта были поставлены три основные задачи: 1. Фармакологическое ингибирование высокомолекулярного комплекса некросома с помощью nec-1, nec-1s и nec-5. 2. Фармакологическое ингибирование высокомолекулярного комплекса некросома с помощью ингибиторов активности каспаз. 3. Фармакологическое ингибирование высокомолекулярного комплекса некросома с помощью ингибиторов белка ФЛИП. Для изучения осуществления данных задач, клетки карциномы яичника CAOV-4 были стимулированы цисплатином или цисплатином в комбинации с ингибитором каспаз, zVAD-fmк, а также фармакологических ингибиторов фосфорилирования киназы РИПК1: nec-1, nec-1s и nec-5. Для ингибирования каталитической активности каспазы-8 был использован ингибитор активности каспаз широкого действия – zVAD-fmk. Именно данный ингибитор активности каспаз широко используется в мировой практике для ингибирования активности данного фермента, и именно данная методика ингибирования активности каспазы-8 одобрена мировым научным сообществом. Ингибитор активности каспаз zVAD-fmk добавлялся к клеткам карциномы яичника CAOV-4 в различных концентрациях от 5 до 50 µM в комбинации с цисплатином в концентрации 70 µM. Ингибиторы фосфорилирования киназы РИПК1 nec-1, nec-1s и nec-5 добавлялись к клеткам карциномы яичника CAOV-4 в различных концентрациях от 5 до 50 µM в комбинации с цисплатином в концентрации 70 µM и ингибитором активности каспаз. Вначале, пост-трансляционные модификации белков комплекса некросома изучались при анализе общих клеточных лизатов. При этом, их фосфорилирование и протеолиз были проанализированы при помощи количественного Вестерн Блота. Кроме того, параллельно проводили анализ клеточной гибели с помощью окрашивания пропидием йодида и проточной цитометрии, для того чтобы проконтролировать индукцию некроптоза. Было обнаружено, что при обработке цисплатином клеток карциномы яичника происходит расщепление киназы РИПК1, о чем свидетельствовало расщепление полноразмерной формы белка РИПК1 и детекция продукта расщепления данного белка. Однако при добавлении ингибитора каспаз происходило ингибирование расщепления киназы РИПК1 и индукция фосфорилирования данного белка. В то же время при добавлении ингибиторов фосфорилирования киназы РИПК1 nec-1, nec-1s и nec-5 фосфорилирование данной киназы не наблюдалось. Данные результаты были получены при проведении Вестерн Блота с использованием антител против РИПК1 и фосфоРИПК1 от фирмы Cell Signaling. Также, было показано, что фосфорилирование белка РИПК1 совпадает с индукцией некроптоза, что было показано с помощью измерения клеточной гибели с помощью окрашивания пропидием йодида. Также было показано, что применение ингибитора каспаз приводит к усилению клеточной гибели, что подтверждает негативную роль протеолиза в регуляции некроптотической клеточной гибели, а применение ингибиторов фосфорилирования киназы РИПК1 nec-1, nec-1s и nec-5 приводит к ингибированию процесса некроптоза. Далее, был проведен анализ фосфорилирования и расщепления белка РИПК1 в составе комплекса некросома при обработке клеток цисплатином или цисплатином в комбинации с ингибитором каспаз, zVAD-fmк или же некростатинами. Для этой цели была применена комбинация передовых методов иммунопреципитации и Вестерн Блота. Данный анализ показал, что при применении ингибитора каспаз происходит эффективное образование комплекса некросома, однако при применении ингибитора фосфорилирования киназы РИПК1, происходит ингибирование образования данного макромолекулярного комплекса. Молекулярный механизм данного явления должен быть исследован в дальнейшей работе. Таким образом было показано, что фосфорилирование белка РИПК1 необходимо для образования комплекса некросома, а расщепление данного белка приводит к ингибированию активности данного комплекса. Протеолитическое расщепление белка РИПК1 может происходить как в комплексе некросома, так и в цитозоле Однако его расщепление приводит к ингибированию образования комплекса некросома. Наконец, в ходе данного проекта было проверено действие ингибиторов белка с-ФЛИП, которые был недавно открыт в данном консорциуме. Однако, было показано, что действие данного ингибитора не имеет никакого эффекта на комплекс некросома, что вероятно можно объяснить отсутствием эффектов белков ФЛИП на образование макромолекулярного комплекса некросомы. Таким образом, изучение двух пост-трансляционных модификаций комплекса некросома с помощью фармакологических ингибиторов: фосфорилирования и протеолиза показало, что две данные модификации играют две противоположные роли в формировании комплекса некросома. А именно, было установлено, что фосфорилирование белка РИПК1 необходимо для индукции образования данного комплекса и запуска данного типа ПКГ, в то время как протеолитическое расщепление белка РИПК1 приводит к ингибированию образования комплекса некросома и некроптоза. Таким образом, было установлено, что две данные модификации играют две совершенно противоположные роли: инициации и ингибирования некроптотической клеточной гибели.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".