ИСТИНА

Актуальность исследования механизмов, регулирующих рост пыльцевой трубки, обусловлена тем, что этот процесс, во-первых, определяет успех оплодотворения и, соответственно, образования семян, а во-вторых, служит удобной моделью для выявления универсальных закономерностей полярного роста. Хотя для пыльцевых трубок цветковых растений уже получено достаточно много данных по функционированию основных регуляторных систем, альтернативная (и более древняя) модельная система - пыльцевая трубка хвойных, имеющая ряд отличий в ключевых аспектах роста и его регуляции, только начинает изучаться. Концепция редокс-сигналинга стала общепринятой в биологии растительной клетки: сейчас АФК рассматриваются как ключевые компоненты сигнальных событий практически в любой физиологической ситуации; основным механизмом передачи сигнала является регуляция ионных каналов. Основываясь на данных литературы и собственных результатах, полученных ранее, мы рассматриваем АФК и ионный гомеостаз как единый регуляторный модуль, имеющий огромное значение в физиологии мужского гаметофита. В ходе реализации проекта впервые будет проведено сравнительное исследование функционирования регуляторного модуля «АФК - ионный транспорт» в репродукции покрытосеменных и голосеменных растений. При этом планируется изучить компоненты этого модуля и их взаимодействие in vitro на примере лилии и ели, в результате чего будет получены ответы на вопросы: (1) насколько компоненты регуляторной системы являются универсальными для семенных растений, и (2) что нового появилось у цветковых растений, позволив трубкам расти значительно быстрее и строго линейно. Отдельного внимания заслуживает протеомная часть проекта, в ходе реализации которой будут выявлены основные белки, ответственные за восприятие редокс-сигнала и вовлеченные в работу изучаемого регуляторного модуля. Во второй части проекта мы, следуя современной тенденции к изучению прорастания in vivo, планируем выявить роль регуляторного модуля «АФК - ионный транспорт» во взаимодействии пыльцы с женским спорофитом на начальном этапе прорастания. С этой целью будут собраны жидкости, в которых прорастает пыльца на женских тканях: экссудат рыльца (для лилии) и опылительная капля шишки (для ели), изучены их редокс-свойства и состав АФК, а также действие на мужской гаметофит и механизмы поддержания его роста и взаимодействия с ним. Сравнив голосеменные и покрытосеменные растения по этим параметрам, мы получим важнейшие сведения об эволюции взаимодействия между мужскими и женскими тканями в репродукции семенных растений.

The relevance of the study on the mechanisms regulating pollen tube growth is due to the fact that this process, firstly, determines the success of fertilization and, accordingly, the formation of seeds, and secondly, it is a convenient model for revealing the universal patterns of polar growth. Although a lot of data on the functioning of main regulatory systems has already been obtained for pollen tubes of flowering plants, an alternative (and more ancient) model system - a pollen tube of conifers, which has a number of differences in key aspects of growth and its regulation, is just beginning to be studied. The concept of redox signaling has become common in plant cell biology: now, ROS are considered as key components of signaling events in almost any physiological situation; the main mechanism for signal transduction is the regulation of ion channels. Based on the literature data and our results obtained previously, we consider ROS and ion homeostasis as a single regulatory module that is of great importance in male gametophyte physiology. The project will be the first comparative study of the functioning of the regulatory unit "ROS - ion transport" in the reproduction of angiosperms and gymnosperms. We will study the components of this module and their interaction in vitro on lily and spruce pollen tubes, resulting in answers to the questions: (1) to which extent the regulatory system`s components are universal for seed plants, and (2) what`s new in flowering plants, allowing the tubes to grow considerably faster and strictly linearly. Special attention should be paid to the proteomic part of the project, in which the main proteins responsible for perception of the redox signal and involved in the regulatory module will be identified. In the second part of the project, following the modern trend to study germination in vivo, we plan to identify the role of regulatory unit "ROS - ion transport" in the cooperation of pollen with female sporophyte at the initial stage. For this purpose the fluids in which pollen germinates on the female tissues will be collected : stigma exudate (for lily) and pollination drop from cones (for spruce), their redox properties and ROS composition will be studied, as well as their effects on male gametophyte and its growth mechanisms. By comparing gymnosperms and angiosperms by these parameters, we will obtain very important data on the evolution of the interaction between male and female tissues in seed plant reproduction.

Впервые будет получена детальная картина ион-транспортных процессов и динамики цитоплазматических показателей в процессе активации мужского гаметофита голосеменного растения с применением специфичных флуоресцентных зондов и систем (на данный момент это совершенно не изучено). Впервые будет проведено высокоспецифичное картирование АФК в пыльцевой трубке покрытосеменных растений. Будут обнаружены градиенты и установлена субклеточная локализация различных активных форм, установлен вклад конкретных источников образования АФК. Это позволит сравнить распределение пероксида водорода и супероксид-радикала, а также суммарных АФК в цитоплазме растущей трубки лилии и ели, а также выявить накопление АФК в органеллах. Впервые будет проведен сравнительный анализ редокс-регуляции транспорта и распределения неорганических ионов в пыльцевой трубке у голосеменных и покрытосеменных растений. Полученные результаты позволят сделать выводы об универсальности регуляторного блока «АФК-ионный транспорт» среди семенных растений или выявить различия между цветковыми и хвойными растениями. С помощью протеомного анализа будут выявлены белки, ответственные за реакцию мужского гаметофита на АФК. На основании полученных данных будет построена рабочая схема реализации ответа, с привлечением литературы и баз данных, находящихся в открытом доступе. Впервые будет изучен редокс-статус рыльцевого экссудата лилии, а также опылительной капли женской шишки, в которой происходит прорастание пыльцы ели. Будут оценены антиоксидантные свойства данных жидкостей, содержание в них АФК и изучена реакция на них пыльцы для ответа на вопрос об участии регуляторного модуля «АФК-ионный транспорт» в репродукции хвойных и цветковых растений in vivo. Этот результат может стать одним из первых в новом и актуальном направлении исследований – изучении эволюции взаимодействия между мужским гаметофитом и женским спорофитом у семенных растений. Полученные результаты внесут важный вклад в изучение эволюции регуляторных систем, обеспечивающих полярный рост и репродуктивные взаимодействия у растений. Прикладная значимость заключается в том, что понимание функционирования одного из ключевых регуляторных модулей растительной клетки позволит в будущем направленно изменять свойства растений, в частности, оптимизировать процессы репродукции, а значит, получения сортового потомства и увеличения урожая.

Планируемое исследование основывается на многолетнем опыте изучения физиологии мужского гаметофита, которое проводится нашей группой на кафедре физиологии растений МГУ. В последние 10 лет интерес сотрудников был сконцентрирован на трех основных направлениях: ионная регуляция прорастания пыльцы, роль АФК в прорастании и влияние тяжелых металлов на этот процесс. Первые два направления напрямую связаны с предполагаемой тематикой проекта, который является их закономерным развитием. С 2015 года под руководством Брейгиной М.А. группа исследовала взаимосвязь между ионной регуляцией прорастания и АФК, а также между реакцией пыльцы на тяжелые металлы и функционированием ионных каналов. В этих исследованиях использовалась количественная и качественная флуоресцентная микроскопия, включая оценку содержания АФК в протопластах, а также пэтч-кламп (в сотрудничестве с кафедрой ФЧЖ). В ходе работы группы был разработан ряд оригинальных методик, основанных на количественной флуоресцентной микроскопии и компьютерном анализе изображений, а также спектрофлуориметрии. Все эти методики разрабатывались как неинвазивные, то есть позволяют проводить физиологические измерения в процессе прорастания и роста. В частности, были разработаны методики (1) мониторинга мембранного потенциала с помощью быстрого красителя Di-4-ANEPPS и (2) оценки его абсолютных значений в мВ с помощью калибровки медленного красителя DiBAC4(3), (3) метод количественной оценки выхода анионов. Ряд общепринятых методик был адаптирован для пыльцевых трубок табака: метод регистрации внутриклеточной концентрации кальция, многоканальная микрокиносъемка для изучения распределения и движения органелл в пыльцевой трубке, визуализация цитоскелета с помощью флуоресцентно-меченого фаллоидина.