Изменение дифференцировочного потенциала постнатальных стволовых клеток при их старенииНИР

Changes in differentiation potential of postnatal stem cells during their senescence.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 8 декабря 2018 г.-8 декабря 2019 г. Изменение дифференцировочного потенциала постнатальных стволовых клеток при их старении
Результаты этапа: Цель и задачи проекта (форма изложения должна дать возможность провести экспертизу идеи, в частности оценить, является ли исследование фундаментальным, а представленная идея новой и оригинальной) Цель работы: Оценить изменение гормональной чувствительности и ее взаимосвязь с дифференцировочным потенциалом при старении МСК. Будет выяснено, как изменяются механизмы проведения сигнала от норадреналина, серотонина и инсулина в процессе старения клеток, и как клеточное старение и изменения внутриклеточной сигнализации сопряжены с адипогенным потенциалом МСК. Задачи работы: 1. Установить, как изменяется влияние гормонов норадреналина, серотонина и инсулина на адипогенную дифференцировку МСК в процессе клеточного старения. Будет сравнено влияние гормонов на клетки, полученный от доноров различного возраста и клетки с индуцированным клеточным старением. Далее будет выяснено, изменение каких регуляторных сигнальных процессов связано с различиями в дифференцировочном потенциале молодых и стареющих МСК. Будет выяснено, что изменяется в клетках при старении: чувствительность к гормонам-регуляторам и/или механизмы проведения внутриклеточного сигнала. 2. Отработать протокол трансфекции первичных МСК из жировой ткани человека плазмидами, кодирующими биосенсоры для детекции активных сигнальных киназ: протеинкиназы А (PKA-Spark) и МАР-киназ Erk1 и Erk2 (Erk-Spark) (Zhang, Huang et al., MolCel, 2018); биосенсор для детекции внутриклеточного уровня пероксида водорода, выступающего в качестве вторичного посредника, HyPer (Belousov, Fradkov et al., NatMet, 2006; Ткачук, Тюрин-Кузьмин и др., Биомемб., 2012; Tyurin-Kuzmin et al., PLOSone, 2016; Tyurin-Kuzmin et al., BiolChem, 2018). Будут опробованы протоколы для химической трансфекции труднотрансфицируемых клеток, а также нуклеофекция МСК. Наиболее оптимальный протокол трансфекции будет использоваться для дальнейших экспериментов. 3. Сравнить чувствительность популяций МСК, полученных от доноров различного возраста, а также клеток с индуцированным старением к гормонам норадреналину, серотонину и инсулину. На уровне одиночных клеток выяснить, как влияет клеточное старение на механизмы проведения внутриклеточного сигнала от норадреналина, серотонина и инсулина. Индукция старения клеток будет производиться путем продолжительного культивирования клеток до 10-12 пассажей. При этом, согласно литературным данным, меняется морфология МСК, происходят хромосомные аберрации и индуцируется клеточное старение (Turinetto, Vitale et al. Int J Mol Sci, 2016; Лобанова, Ратушный и др., Докл Акад Наук 2016). Как мы ранее установили, наблюдая за ответами МСК на различные гормоны на уровне одиночных клеток, на отдельные гормоны отвечают лишь небольшие субпопуляции МСК (Kotova, et al., BBA, 2014). При этом доля клеток, отвечающих на конкретный гормон, может меняться в зависимости от функционального состояния клеток (Tyurin-Kuzmin, et al., SciRep, 2016). В связи с этим, число клеток популяции, отвечающих на гормон, является важным маркером чувствительности популяции к нему. В данной работе будет выяснено, как изменяются механизмы проведения сигнала от норадреналина, серотонина и инсулина в процессе старения клеток, и как клеточное старение и изменения внутриклеточной сигнализации сопряжены с адипогенным потенциалом МСК. Для работы будут использованы первичные культуры МСК, выделенных из жировой ткани людей различного возраста (интервал приблизительно 20-70 лет) и различного пассажа (1-4 пассаж для клеток, не подверженных клеточному старению; 9-12 пассажи при индукции клеточного старения). Задача 1. Методика детекции клеточного старения по изменению метаболического статуса на уровне одиночных клеток в реальном времени будет разработана на основе измерения внутриклеточного соотношения АТФ/АДФ в реальном времени при помощи генетически кодируемого биосенсора Perceval (Berg, Hung et al., NatMet, 2009). Известно, что старение клеток неразрывно связано с нарушением митохондриальной функции. В частности, снижение интенсивности митохондриальной продукции АТФ является характеристической чертой стареющих клеток (Ziegler и др., Aging Cell, 2015). Кроме того, снижение продукции АТФ в митохондриях вызывает активацию ингибитора циклин-зависимых киназ p21 (Stöckl et al., ExpGeront. 2006), который определяет снижение регенеративного потенциала стволовых клеток при старении (Bedelbaeva et al., PNAS, 2010). Для определения метаболического статуса МСК и оценки клеточного старения будет использоваться генетически-кодируемый биосенсор на уровень АТФ/АДФ Perceval (Berg, Hung et al., NatMet, 2009). Биосенсор Perceval рациометрический, имеющиеся в нашем распоряжении широкопольный флуоресцентный микроскоп Nikon Eclipse Ti и конфокальный флуоресцентный микроскоп Zeiss LSM780 оснащены всем необходимым для регистрации внутриклеточного соотношения АТФ/АДФ при помощи этого биосенсора. Снижение соотношения АТФ/АДФ в цитоплазме большинства клеток популяции будет свидетельствовать об ухудшении работы митохондриальной дыхательной цепи, и, следовательно, о старении популяции в целом (Ziegler и др., Aging Cell, 2015). При этом, индивидуальные различия между отдельными клетками по уровню АТФ/АДФ вполне вероятны. В связи с этим, детекция метаболического статуса будет осуществляться в единичных клетках, но общая оценка старения клеток популяции будет осуществляться на уровне популяции в целом. Кроме того, старение клеток популяций МСК, полученных от молодых и пожилых доноров, а также клеток с индуцированным клеточным старением может производиться путем сравнения уровня экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ p21 при помощи вестерн-блоттинга. Сравнение адипогенного потенциала МСК, полученных от доноров различного возраста и МСК с индуцированным клеточным старением будет производиться путем запуска клеток в адипогенную дифференцировку. Для этого будет использован стандартный коктейль индукторов адипогенной дифференцировки. Коктейль включает в себя изобутилметилксантин (IBMX), синтетический глюкокортикоид дексаметазон и инсулин. Инсулин является ключевым индуктором адипогенной дифференцировки МСК. Неселективный конкурентный ингибитор фосфодиэстераз IBMX, который может быть также заменен на активатор аденилатциклазы форсколин, ведет к повышению внутриклеточного уровня цАМФ. Повышение внутриклеточного уровня цАМФ ассоциировано с критическими событиями процессов адипогенной дифференцировки, такими как супрессия Wnt10b (Bennett et al., J.Biol.Chem., 2002) и индукция C/EBPβ (CCAAT/enhancer-binding protein β) (Yeh et al., Genes Dev., 1995). Кроме того, цАМФ принимает участие в регуляции PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), мастер-гена адипогенной дифференцировки (Tzameli et al., J.Biol.Chem., 2004). Дифференцировка клеток будет производиться в режиме реального времени под микроскопом Nikon Eclipse Ti, оснащенным культуральным модулем и моторизованным столиком. Эта конфигурация микроскопа позволяет поддерживать жизнеспособность клеток и наблюдать за процессом адипогенной дифференцировки на протяжении 2 недель в режиме реального времени. Эта методика уже отработана в нашей лаборатории и широко применяется в настоящее время. При помощи данного метода будут измерены следующие параметры дифференцировочного процесса: доля дифференцированных клеток в популяции в разные моменты времени на протяжении процесса дифференцировки; скорость дифференцировки клеток; размер жировых капель и его изменение на протяжении процесса дифференцировки. Задача 2. Отработать протокол трансфекции первичных МСК из жировой ткани человека плазмидами, кодирующими биосенсоры для детекции активных сигнальных киназ. Известно, что первичные культуры клеток млекопитающих очень плохо трансфицируются. В рамках выполнения данной задачи проекта будут испытаны липофильные реактивы для трансфекции труднотрансфицируемых клеток от различных производителей. Кроме этого, будет опробована методика введения генетического материала в клетку при помощи нуклеофекции. Как указывалось выше, популяция МСК гетерогенна, поэтому введение плазмиды не во все клетки может привести к артефактам, связанным с разной эффективностью трансфекции клеток из различных субпопуляций МСК. В связи с этим, метод введения плазмид при помощи нуклеофекции видится предпочтительным, поскольку это полностью случайный процесс попадания движущихся в электрическом поле частиц в клетку. В случае введения плазмид в клетку случайным образом получение даже небольшого числа трансфицированных клеток будет вполне репрезентативным экспериментом. Учитывая, что работа будет вестись на уровне одиночных клеток, невысокая эффективность трансфекции не будет препятствием для дальнейшего выполнения работы. Задача 3. Все используемые в данной работе биосенсоры позволяют наблюдать за активацией и выключением сигнальных каскадов в одиночных живых клетках в режиме реального времени. В связи с этим, с их помощью будет регистрироваться, во-первых, доля клеток популяции, отвечающих на конкретный стимул одним или несколькими из детектируемых сигнальных каскадов. Во вторых, при помощи ингибиторного анализа, налаженного в нашей лаборатории, будет установлено, какие конкретно участники изучаемых сигнальных каскадов принимают участие в проведении гормонального сигнала в клетках, подверженных или не подверженных клеточному старению. Плазмиды, кодирующие все используемые в данной работе биосенсоры, имеются в наличии в нашей лаборатории. При помощи биосенсора, регистрирующего активность протеинкиназы А (PKA-Spark) (Zhang, Huang et al., MolCell, 2018) будет детектироваться активность и временные характеристики цАМФ-зависимого сигнального каскада в одиночных клетках. Наибольшее значение этот сигнальный каскад имеет для гормонов, связывающихся с семидоменными рецепторами, норадреналина и серотонина. Бета-адренорецепторы, связывающие норадреналин, а также 4, 6 и 7 изоформы рецепторов серотонина (5-HTR4, 5-HTR6 и 5-HTR7) ассоциированы с тримерными Gs-белками, которые активируют аденилатциклазу и синтез цАМФ, запуская цАМФ-зависимый сигнальный каскад. При помощи биосенсора, регистрирующего активность сигнальных МАР-киназ Erk1/2 (Erk-Spark) (Zhang, Huang et al. 2018) будет детектироваться активность и временные характеристики МАР-киназного сигнального каскада в одиночных клетках. Этот сигнальный каскад наибольшее значение имеет для тирозинкиназных рецепторов, в частности, рецептора инсулина. Тем не менее, известно, что в некоторых случаях МАР-киназный сигнальный каскад запускается и Gs-ассоциированными семидоменными рецепторами и регулирует цАМФ-зависимые пути проведения сигнала (Lee, Shen et al., MolCarcinog, 2016). В связи с этим, в данной работе будет установлено, запускается ли МАР-киназный сигнальный каскад в МСК при действии на них норадреналина и серотонина. Биосенсоры PKA-Spark и Erk-Spark содержат в своем составе пептидные последовательности, специфически фосфорилирующиеся сигнальной киназой. При фосфорилировании биосенсоры подвергаются олигомеризации, сигнал флуоресцентного белка обратимо меняет локализацию в цитоплазме, позволяя наблюдать за активацией протеинкиназ (Zhang, Huang et al. MolCell 2018). Биосенсор для детекции внутриклеточного уровня пероксида водорода, выступающего в качестве вторичного посредника, HyPer (Belousov, Fradkov et al., NatMet, 2006; Ткачук, Тюрин-Кузьмин и др., Биомемб., 2012; Tyurin-Kuzmin et al., PLOSone, 2016; Tyurin-Kuzmin et al., BiolChem, 2018) будет использоваться для регистрации активности инсулинового рецептора в одиночных клетках. Н2О2 в последнее время рассматривается как потенциально важный регулятор миграции и пролиферации клеток, функционирующий в качестве вторичного посредника при активации тирозинкиназных рецепторов (San Martin и Griendling, 2010, Ткачук, Тюрин-Кузьмин и др., Биомемб, 2012). HyPer является рациометрическим биосенсором, что делает его показания не зависящими от уровня экспрессии биосенсора в конкретной клетке и кажущихся изменений яркости флуоресценции за счет перемен в форме клетки. Активность кальциевого сигнального каскада будет регистрироваться при помощи низкомолекулярных флуоресцентных красителей Fluo8 и Fura2. Ацетометильные формы этих красителей свободно проникают в цитоплазму, где они деацетилируются и становятся гидрофильными и непроникающими через мембрану. Таким образом, для регистрации кальциевой сигнализации не требуется особых сложных методов ведения генетического материала в клетку. Fluo8 флуоресцирует в зеленой области спектра, там же, где и используемые в данной работе генетически-кодируемые биосенсоры. В связи с этим, нет возможности одновременного наблюдения нескольких сигнальных каскадов в одной клетке. Флуоресценция красителя Fura2 возбуждается в ультрафиолетовой области спектра, что позволяет использовать его совместно с другими биосенсорами. Таким образом, в данной работе будет реализована возможность одновременного прижизненного наблюдения динамики нескольких сигнальных каскадов (в частности, цАМФ- и Са2+-зависимого) в одной клетке при действии гормона. Флуоресцентные биосенсоры будут наблюдаться при помощи широкопольного флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti и конфокального флуоресцентного микроскопа Zeiss LSM780. Оба микроскопа имеются в неограниченном доступе для исполнителей проекта. Для поддержания жизнедеятельности клеток будут использованы специальные инкубационные камеры на микроскопах, поддерживающие температуру 37°С и 5% СО2. Комбинация из используемых нами проточной камеры, специального осветителя на основе светодиодов и очень высокочувствительной EMCCD камеры позволяет непрерывно регистрировать функциональную активность МСК на протяжении двух часов без выгорания красителя и видимого повреждения клеток. Снижение частоты регистрации сигнальных событий в клетках позволяет поддерживать жизнедеятельность клеток с одновременной регистрацией сигнальных процессов в них на протяжении нескольких дней. Оба микроскопа оснащены также моторизованными предметными столиками, управляемыми через компьютер, что позволяет производить съемку клеток сразу в нескольких полях зрения (до 40 одновременно). Это существенно повышает количество исследуемых клеток для набора статистики. Эти методики были отработаны нами ранее и частично уже опубликованы (Kotova et al., BBA, 2014; Tyurin-Kuzmin et al., Sci.Rep, 2016; Tyurin-Kuzmin et al., PLOSone, 2016; Tyurin-Kuzmin et al., BiolChem, 2018). Механизмы проведения внутриклеточного сигнала будут выясняться при помощи ингибиторного анализа.
2 8 декабря 2019 г.-10 ноября 2020 г. Сравнение чувствительности популяций МСК, полученных от доноров различного возраста, а также клеток с индуцированным старением к гормонам
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".