ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
Карцинома яичника является главной причиной смертности среди пациенток, страдающих от рака половых органов. На сегодня этот диагноз встречается в среднем у 10-12 женщин из 1000. При этом средняя 5-летняя выживаемость составляет 45%. Ранняя диагностика (до распространения опухоли за пределы органа) повышает выживаемость до 90%. Для мониторинга течения болезни и оценки эффективности терапии используются уровень белков СA-125 (углеводный антиген 125) и HE4 (человеческий эпидидимальный протеин 4), которые, к сожалению, не дают полной картины, позволяющей контролировать эффективность хирургического лечения карциномы яичников. Каспаза-2, как член семейства цистеиновых протеаз, главных ферментов апоптоза, обладает не только проапоптотическими, но и онкосупрессорными функциями, а также функциями поддержания генетической стабильности, и играет одну из ключевых ролей в запуске апоптотической гибели клеток в ответ на генотоксический стресс. Эксперименты с нокаутными по каспазе-2 мышами показали, что опухоли яичника в них отличаются по чувствительности к терапии от нормальных мышей. Успешное лечение рака яичника заключается в хирургическом вмешательстве и последующей терапии. Для разработки персонифицированных прогностических и таргетных подходов оценки эффективности хирургического лечения опухолей яичника будет исследован уровень экспрессии гена каспазы-2 и его мутаций, изоформ мРНК в сопоставлении с анализом белков СA-125 и HE4. С помощью методов Вестерн-блота с последующим количественным анализом, секвенирования следующего поколения (next-generation sequencing) и ПЦР в реальном времени будет проведена оценка уровня каспазы-2 и других проапоптотических факторов в нормальных и опухолевых образцах, полученных от больных с раком яичников. Будет проанализировано соотношение мРНК, кодирующих ее проапоптотическую L- и антиапоптотическую S-изоформы. Научная новизна исследования заключается в детальном анализе генетических изменений каспазы-2 в образцах, полученных от больных раком яичников, а также в возможности их использования в сопоставлении с белками СA-125 и HE4 в качестве прогностического фактора хирургического лечения данного заболевания. Уровень значимости подобного исследования трудно переоценить в связи с социальной ролью болезни. Междисциплинарность проекта заключается в комплексном подходе, включающим биохимический, молекулярно- и клеточно-биологический анализы в тесной совокупности с генетическими и клиническими исследованиями. Именно поэтому планируемый многофакторный анализ роли онкосупрессорного белка каспазы-2 в течении заболевания даст возможность использовать его в качестве нового молекулярно-генетического прогностического фактора контроля эффективности хирургического лечения карциномы яичников.
Ovarian carcinoma is the main cause of death among patients suffering from genital cancers. Today, 10-12 women out of 1000 are suffering this disease. Unfortunately, the average 5-year survival rate of diagnosed patients is 45%. Early diagnosis (before the spread of the tumor beyond the organ) raises the survival rate to 90%. To monitor the course of the disease and evaluate the effectiveness of therapy, the level of proteins CA-125 (carbohydrate antigen 125) and HE4 (human epididymal protein 4) is analysed, which, unfortunately, does not give a complete picture allowing to control the effectiveness of surgical treatment of ovarian carcinoma. Caspase-2, as a member of the family of cysteine proteases, the main enzymes of apoptosis, fulfil not only pro-apoptotic but also tumor suppressor functions, as well as maintains genetic stability, and plays a key role in triggering apoptotic cell death in response to genotoxic stress. Experiments with caspase-2 knockout mice showed that the ovarian tumors in these animals differ in sensitivity to therapy from normal littermates. Successful treatment of ovarian cancer consists of surgical intervention and subsequent therapy. To develop personalized prognostic and targeted approaches to assess the effectiveness of surgical treatment of ovarian tumors, the level of expression of the caspase-2 gene and its mutations, mRNA isoforms compared with the analysis of proteins CA-125 and HE4 will be investigated. Using western blot technique with subsequent quantitative analysis, next-generation sequencing and real-time PCR, the level of caspase-2 and other pro-apoptotic factors in normal and tumor samples obtained from patients with ovarian cancer will be analysed. The ratio of mRNA encoding its pro-apoptotic L- and anti-apoptotic S-isoforms will be investigated. The scientific novelty of this study consists includes a detailed analysis of the genetic changes in caspase-2 in samples obtained from patients with ovarian cancer, and in the possibility of using them in comparison with the proteins CA-125 and HE4 as a prognostic factor for the surgical treatment of this disease. The significance of such a study cannot be overestimated keeping in mind the social role of this disease. The interdisciplinarity of the project is based on the complex approach, including biochemical, molecular and cell-biological analyses in close conjunction with genetic and clinical studies. That is why the planned multifactorial analysis of the role of the tumor suppressor protein caspase-2 in the course of the disease will make it possible to use it as a new molecular genetic prognostic factor controlling the effectiveness of surgical treatment of ovarian carcinoma.
В ходе выполнения работы планируется: 1. Получить данные о различных параметрах каспазы-2 как прогностического маркера при хирургическом лечении и последующей терапии опухолей яичников и сравнить их с используемым в настоящее время прогностическими факторами СA-125 и HE4. 2. Полученные ранее в нашей лаборатории данные свидетельствуют, что обработка химиотерапевтическими препаратами раковых клеток линии карциномы яичников приводит к индукции нескольких типов клеточной гибели – апоптоза, некроптоза и митотической катастрофы. Дальнейшее исследование позволит определить роль данного белка в индукции гибели опухолевых клеток в тканях пациентов. 3. Поскольку существуют предпосылки участия каспазы-2 не только непосредственно в апоптозе, но и в других процессах, вызванных повреждениями ДНК, то также будут получены данные о влиянии каспазы-2 на систему детекции повреждений ДНК и запуск р53-опосредованного молекулярного пути гибели раковых клеток. 4. Совмещение молекулярно-генетического анализа (секвенирование) и медицинского подхода в отображении клинической картины течения заболевания у пациентов позволит сделать выводы о роли каспазы-2 в прогрессировании опухоли, степени ее агрессивности и перспективности хирургического и последующего терапевтического лечения. Таким образом, будет впервые непосредственно показана роль каспазы-2 как прогностического фактора при хирургическом лечении и последующей терапии опухолей яичников.
Forsberg J., Zhivotovsky B., Olsson M. Caspase-2 – an orphan enzyme out of the shadows. Oncogene, издательство Nature Publishing Group (United Kingdom), том 36, с. 5441-5444 Aksenova V.I., Kopeina G.S., Zamaraev A.V., Zhivotovsky B.D., Lavrik I.N. Mechanism of caspase-2 activation upon DNA damage. Doklady Biochemistry and Biophysics, издательство M A I K Nauka - Interperiodica (Russian Federation), том 467, № 1, с. 132-135
В результате выполнения данного проекта нами получены новые данные о различных параметрах каспазы-2 как прогностического маркера при хирургическом лечении и последующей терапии опухолей яичников. Установлено, что в зависимости от концентрации обработка химиотерапевтическими препаратами раковых клеток линии карциномы яичников приводит как к индукции апоптоза и некроптоза, так и к состоянию митотической катастрофы, которая в дальнейшем может быть реализована в виде апоптоза, некроптоза или аутофагии. Нами показана роль каспазы-2 в детекции повреждений ДНК и в зависимом от белка р53 апоптозе раковых клеток. Впервые показана роль каспазы-2 в негативной регуляции некроптоза. Было показано, что в образцах карциномы яичника происходит снижение уровня каспазы-2 по сравнению с нормальными тканями того же пациента. При этом повышался уровень каспазы-8 и каспазы-3. Нами было выполнено таргетное секвенирование экзонов гена CASP2 и фланкирующих интронных последовательностей в интраоперационных биоматериалах большинства пациентов, включённых в исследование. При анализе данных NGS не было выявлено значимого мозаицизма в исследуемых биоптатах. Всего было выявлено 7 полиморфных локусов. Кроме того, нами был выполнен сравнительный анализ уровней мРНК обеих изоформ каспазы-2 — каспазы-2L и каспазы-2S — в ряде образцов здоровых и поражённых участков яичников пациентов с раком яичника. На основании полученных данных были определены соотношения уровней транскриптов в проанализированных образцах биоматериалов. Нормализация уровня мРНК длинной изоформы каспазы-2 по уровню мРНК микроглобулина показала разброс относительных количеств каспазы-2L в образцах яичников женщин, больных раком этого органа, более чем на 2 порядка (и более чем на порядок при исключении крайних значений). Таким образом, совмещение молекулярно-генетического анализа (секвенирование) и медицинского подхода в отображении клинической картины течения заболевания у пациентов позволило сделать выводы о роли каспазы-2 в прогрессировании опухоли, степени ее агрессивности и перспективности хирургического и последующего терапевтического лечения.
НМИЦ АГП им. Кулакова | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 3 сентября 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Каспаза-2 – новый молекулярно-генетический прогностический фактор контроля эффективности хирургического лечения карциномы яичника |
Результаты этапа: Исследован уровень экспрессии гена каспазы-2 и его мутаций, изоформ мРНК в сопоставлении с анализом белков СA-125 и HE4. С помощью методов Вестерн-блота с последующим количественным анализом, секвенирования следующего поколения (next-generation sequencing) и ПЦР в реальном времени проведена оценка уровня каспазы-2 и других проапоптотических факторов в нормальных и опухолевых образцах, полученных от больных с раком яичников. | ||
2 | 9 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Каспаза-2 – новый молекулярно-генетический прогностический фактор контроля эффективности хирургического лечения карциномы яичника |
Результаты этапа: 1. Прооперированы 60 пациентов, поступивших на лечение в Центр и собраны соответствующие образцы здоровой и патологической тканей, которые были проанализированы в патологоанатомическом отделении. 2. Кроме того, проведен анализ пациентов по различным критериям, включая, возраст, количество рецидивов, акушерско-гинекологический анамнез, наличие экстрагенитальных заболеваний, стадии заболевания, размеру опухоли и состоянию лимфоузлов. Был исследован гистотип полученных образцов от больных и уровень экспрессии маркеров Ki-67 и p53. На основании полученных результатов спланирована программа дальнейших исследований. 3. Был проведен анализ молекулярных механизмов гибели клеточных линий карциномы яичника при обработке их ДНК-повреждающими химиотерапевтическими препаратами. Было показано, что в клетках карциномы яичника происходит активация каспазы-2 наряду с другой инициаторной каспазой-8. При этом обе каспазы формируют независимые друг от друга комплексы. | ||
3 | 9 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Каспаза-2 – новый молекулярно-генетический прогностический фактор контроля эффективности хирургического лечения карциномы яичника |
Результаты этапа: 1. Прооперированы 70 пациентов и собраны соответствующие образцы здоровой и патологической тканей. 2. С помощью разработанного нами метода получения экстрактов из здоровой и патологических тканей пациентов с раком яичника был проведен анализ уровня ряда ключевых белков, отвечающих за процесс апоптоза. Была проведена оценка уровня инициаторных каспазы-2 и каспазы-8, эффекторной каспазы-3, а также субстрата эффекторных каспаз - Поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), фермента, участвующего в репарации повреждений ДНК. Было показано, что в образцах карциномы яичника происходит снижение уровня каспазы-2 по сравнению с нормальными тканями того же пациента. При этом повышался уровень каспазы-8 и каспазы-3. Было отмечено, что уровень р53 практически не менялся, однако уровень его фосфорилированной формы сильно понижался в патологических тканях. Также было установлено, что содержание как проапоптических белков Bak, Bax, Bim и Bid, так и антиапоптотических Mcl-1, Bcl-xL существенно увеличивалось в образцах злокачественных образований. 3. Анализ маркера повреждений ДНК показал, что и в линиях Сaov-4 дикого типа и нокаутных по каспазе-2 и HeLa дикого типа накопление γН2АХ продолжалось даже после устранения воздействия агента, повреждающего ДНК. Таким образом, при исследовании процесса репарации после обработки клеток Caov-4 и HeLa было обнаружено, что повреждения ДНК, вносимые доксорубицином или цисплатином не репарировались в линии Caov-4 и HeLa дикого типа и нокаутных по каспазе-2. 4. Выполнено таргетное секвенирование экзонов гена CASP2 и фланкирующих интронных последовательностей в интраоперационных биоматериалах большинства пациентов, включённых в исследование. При анализе данных NGS не было выявлено значимого мозаицизма в исследуемых биоптатах. Всего было выявлено 7 полиморфных локусов. В качестве сравнения приведены частоты минорных аллелей этих же локусов по данным проекта Allele Frequency Aggregator, приводящим средние частоты на выборках не менее 1 млн. чел. Для локуса rs4647291 ДИ не включает в себя соответствующее значение проекта ALFA, а для локуса rs4647336 — значение ALFA находится на границе достоверности, полученного по результатам текущего исследования. Стоит отметить, что оба этих локуса расположены в интронах гена CASP2. Тогда как для всех трёх локусов, расположенных в кодирующей части гена, значимых различий с данными ALFA не наблюдается. 5. Выполнен сравнительный анализ уровней мРНК обеих изоформ каспазы-2 — каспазы-2L и каспаз-2S — в ряде образцов здоровых и поражённых участков яичников пациентов с раком яичника. На основании полученных данных были определены соотношения уровней транскриптов в проанализированных образцах биоматериалов. Нормализация уровня мРНК длинной изоформы каспазы-2 по уровню мРНК микроглобулина показал разброс относительных количеств каспазы-2L в образцах яичников женщин, больных раком этого органа, более чем на 2 порядка (и более чем на порядок при исключении крайних значений). 6. Опубликованы три статьи в международных журналах International Review of Cell and Molecular Biology (ИФ= 4.9, Q1), Oncogene (ИФ= 7.9, Q1) и Cell Death and Disease (ИФ= 6.3, Q1). | ||
4 | 11 января 2021 г.-31 августа 2021 г. | Каспаза-2 – новый молекулярно-генетический прогностический фактор контроля эффективности хирургического лечения карциномы яичника |
Результаты этапа: В процессе выполнения данного этапа нами получены данные об уровне экспрессии белков JNK/SAPK в образцах карциномы яичника и нормальных тканях пациенток. Более того, нам удалось получить новые данные об уровне фосфорилированных форм этих белков в образцах карциномы яичника и нормальных тканях пациенток и установлена корреляция между уровнем каспазы-2 и детектированием повреждений ДНК. Детальный анализ клинического материала не выявил корреляции между уровнем каспазы-2 и степенью течения тяжести заболевания. Однако, получены данные о корреляции между уровнем антиапоптотических белков семейства Bcl-2: Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL, уровем проапоптотических белков данного семейства: Bak, Bax, Bim и Bid со степенью течения тяжести заболевания. Кроме того нами проведена оценка чувствительности клеток карциномы яичника к селективным ингибиторам белка Mcl-1 на различных клеточных моделях солидных опухолей. Исследуемые препараты относятся к классу BH3-миметиков – химических веществ, которые способны высокоаффинно и селективно связываться с различными антиапоптотическими белками семейства Bcl-2. Показанно, что благодаря своим уникальным свойствам, BH3-миметики способны эффективно запускать гибель опухолевых клеток. Нами было установлено, что ключевую роль в запуске гибели при помощи антагонистов Mcl-1 играет белок Bak. Кроме того, мы обнаружили, что повышенная экспрессия другого белка семейства Bcl-2 - Bcl-xL является важным фактором как исходной, так и приобретенной устойчивости опухолевых клеток к подавлению Mcl-1. Наконец, проведенный нами анализ уровней белков семейства Bcl-2 в тканях пациентов с диагностированной аденокарциномой легкого, проходивших лечение в РОНЦ им. Н.Н. Блохина, позволяет предсказать потенциальную эффективность ингибиторов Mcl-1 в терапии определенных видов опухолей, что представляет особую важность в контексте развития подходов персонализированной медицины. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".