ИСТИНА

Успехи последних лет в секвенировании ДНК позволили идентифицировать многочисленные соматические мутации в генах ДНК-метилтрансфераз (МТаз) у пациентов со злокачественными опухолями. Особенно много точечных мутаций наблюдается при лейкемии у МТазы человека DNMT3A (обозначается большими буквами). Вместе с тем, на сегодняшний день мутации в DNMT3A за исключением наиболее распространенной мутации R882H/C практически не изучены с точки зрения их влияния на функционирование фермента. Одним из подходов определения роли соматических мутаций при раке является изучение метилирующей активности продуктов мутированных генов in vitro. Особенно важно изучить молекулярные механизмы, которые лежат в основе влияния мутаций на функционирование фермента, так как их детальное понимание способствовало бы в дальнейшем разработке ранней диагностики и таргетной терапии рака. Целью проекта является структурно-функциональный анализ мутантных форм DNMT3a человека, найденных при гематологических и других злокачественных новообразованиях. В работе будет исследовано влияние наиболее распространенных точечных мутаций, обнаруженных в каталитическом и регуляторном домене МТазы человека DNMT3A при острой миелоидной лейкемии, миелодиспластическом синдроме и других онкологических заболеваниях, на функционирование МТазы мыши Dnmt3a. Будут получены мутантные формы каталитического домена МТазы мыши Dnmt3a-CD и полноразмерного фермента Dnmt3a2 (в Dnmt3a2 мутации будут в PWWP-домене). Будет изучено влияние этих мутаций на метилирующую активность ферментов и отдельные этапы реакции метилирования, а также на взаимодействие мутантных ферментов с белком-активатором Dnmt3L и хроматином. Будет исследовано функционирование мутантных форм Dnmt3a-CD при действии противораковых препаратов. Будет проведен анализ полученных данных с точки зрения возможных последствий наличия мутаций у пациентов с лейкемией и другими типами рака.

Recently, advances in DNA sequencing have made it possible to identify numerous somatic mutations in the DNA methyltransferase (MTase) genes in patients with malignant tumors. Many point mutations in leukemia are observed in human MTase DNMT3A gene (denoted by capital letters). However, to date, mutations in DNMT3A have not been studied in any significant way from the point of view of their effect on the functioning of the enzyme, with the exception of the most common mutation of R882H/C. One approach to identify the role of somatic mutations in cancer is to study the methylation activity of mutated gene products in vitro. It is especially important to study the molecular mechanisms that underlie the influence of mutations on the functioning of the enzyme, as their detailed understanding would contribute to the further development of early diagnosis and targeted cancer therapy. The aim of the project is the structural and functional analysis of human DNMT3a mutations that are found in hematological and other malignant neoplasms. We will investigate the effect of the most common point mutations found in the catalytic and regulatory domains of human MTase DNMT3A in acute myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome and other oncological diseases, on the functioning of the murine MTase Dnmt3a. Mutants of the catalytic domain of murine MTase Dnmt3a-CD and the full-length enzyme Dnmt3a2 will be obtained (in Dnmt3a2 the mutations will be in the PWWP domain). The effect of these mutations on the methylation activity of the enzymes and the individual steps of the methylation reaction will be studied, as well as on the interaction of mutant enzymes with the Dnmt3L activator protein and chromatin. The functioning of Dnmt3a-CD mutants under the action of anticancer drugs will also be investigated. The data will be analyzed in terms of the possible consequences of the presence of mutations in patients with leukemia and other types of cancer.

Ген МТазы человека DNMT3а является одним из самых регулярно мутируемых при развитии опухолей, в первую очередь при разных видах лейкемии. В проекте впервые будет проведен анализ многочисленных точечных мутаций в каталитическом домене DNMT3а, сделана большая выборка наиболее важных из них (за исключением изученной ранее R882-мутации), сконструированы плазмиды для получения белков, отработаны методики и выделены соответствующие мутантные формы Dnmt3a-CD мыши и подробно изучены разные аспекты механизма их действия in vitro. Исследованные мутанты будут разбиты на группы согласно их метилирующей активности и будут даны рекомендации о том, какие мутанты оказывают наиболее сильное влияние на функцию. Учитывая большую выборку, есть основания полагать, что будут найдены важные мутации, которые кардинально меняют функционирование МТазы человека DNMT3а. Таким образом, будет заложена основа для оценки роли отдельных мутаций в канцерогенезе. Можно предположить, что доказанные в рамках проекта нарушения функциональности DNMT3 in vitro играют роль в развитии таких онкологических заболеваний как острый миелоидный лейкоз и миелодиспластический синдром.

Нами накоплен большой опыт в изучении прокариотических ДНК-метилтрансфераз (МТаз) и эукариотической МТазы Dnmt3a: получение конструкций и выделение ферментов, исследование механизма метилирования и разработка ингибиторов, моделирование структуры комплекса МТаза-ДНК. Определено влияние различных повреждений остатка гуанина в CpG-сайте на функционирование этих ферментов и роль малобороздочных лигандов во взаимодействии МТаз с ДНК in vitro и в опухолевых клетках. Непосредственно в этом проекте мы будем опираться на разработанные методы определения активности МТазы Dnmt3a. Важным для проекта явится разработанный нами подход определения функциональной значимости отдельных аминокислот в функционировании МТаз. Ранее нами были проведены исследования по взаимодействию Dnmt3a2 с нуклеосомой, содержащей поврежденную бензо[a]пиреном ДНК. Весь этот опыт окажется полезным для успешного выполнения предлагаемого проекта. Лаборатория снабжена необходимым оборудованием и материалами.

В клетках злокачественных опухолей наблюдаются точечные мутации в гене ДНК-метилтрансферазы DNMT3А, отвечающей за метилирование цитозина в CpG-сайтах ДНК. Особенно распространены мутации в каталитическом домене (CD) фермента при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ). При гематологических заболеваниях наблюдаются мутации и в регуляторном PWWP-домене, отвечающем за привлечение DNMT3А человека к хроматину за счет связывания с «хвостом» гистона H3, триметилированным по 36-ому остатку лизина (H3K36me3). В проекте на примере Dnmt3a мыши исследованы структурно-функциональные особенности мутантных форм фермента, найденных у пациентов при гематологических заболеваниях. (1) На основе баз данных, содержащих информацию о пациентах с онкологическими заболеваниями, для изучения выбраны 6 мутаций в CD- и 3 мутации в PWWP-доменах Dnmt3a мыши. Впервые разработаны критерии такой выборки. (2) Метилирующая активность 6-ти мутантов Dnmt3a-CD резко уменьшалась и в некоторых случаях была блокирована, причем даже если мутации не попадали в функциональные мотивы фермента. Постадийное изучение механизма действия мутантов показало, что нарушается способность фермента связываться с ДНК, выводить метилируемый цитозин из двойной спирали и образовывать ковалентный ДНК-белковый интермедиат реакции. Эти данные дополнены компьютерным анализом еще 15-ти мутаций в CD гена DNMT3A у пациентов и предсказаниями возможных последствий таких замен. Выявлены потенциально «опасные» замены, наличие которых вероятнее всего приведет к значительному снижению активности DNMT3A. (3) Сформулировано общее представление о роли мутаций в каталитическом домене, ассоциированных с ОМЛ, в функционировании DNMT3A. Наблюдаемое критическое уменьшение метилирования у мутантных форм фермента может свидетельствовать о подавлении функции DNMT3A при развитии болезни. Это, в свою очередь, предполагает связанное с онкологией изменение профиля метилирования ДНК, что имеет катастрофические последствия для клетки. (4) В случае мутаций в PWWP-домене исследовано их влияние на метилирующую активность фермента и его способность к связыванию H3K36me3 и ДНК. Для этого созданы модельные системы, включающие 30-звенный ДНК-субстрат, 19-звенный пептид, имитирующий триметилированный «хвост» гистона H3, а также мутанты изолированного PWWP и этого же домена в полноразмерном ферменте. Исследуемые мутации независимо от их локализации в PWWP-домене привели либо к снижению метилирования (R326H), либо к практически полному ингибированию полноразмерного фермента (P307R и W409R). В случае R326H наблюдалось ослабление взаимодействие PWWP-домена с ДНК-субстратом. (5) Впервые обнаружен удивительный факт: мутации вне CD (в PWWP-домене) могут оказывать влияние на функционирование DNMT3A и предположительно вызывать нарушение функции этого фермента при онкогенезе.