Поведение основных типов клеток в ходе реагрегации и последующих восстановительных процессов у губок (Porifera)НИР

.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Поведение основных типов клеток в ходе реагрегации и последующих восстановительных процессов у губок (Porifera)
Результаты этапа: Диссоциация тканей губок и условия культивирования суспензий клеток В качестве модельных объектов исследования были использованы 2 вида губок – Halisarca dujardinii Johnston, 1842 (кл. Demospongiae) и Leucosolonia complicata (Montagu, 1814) (кл. Calcarea). В качестве дополнительного объекта исследования использовался вид Halichondria panicea (Pallas, 1766) (кл. Demospongiae) (см. раздел Динамики реагрегации клеток). Сбор образцов проводили в Кандалакшском заливе Белого моря в окрестностях Беломорской биологической станции МГУ (66°34′ N, 33°08′ E). Губок собирали в верхней сублиторали с глубин 0-2 м во время отлива и до начала экспериментов содержали в аквариумах с проточной морской водой при температуре 6-10°C не более 24 часов. Для определения наиболее эффективного метода диссоциации тканей ткани губок были диссоциированы одним из трех методов: 1. Механическая диссоциация (по Wilson, 1907). Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля в фильтрованной морской воде (FSW). Измельченные фрагменты тканей протирали сквозь мельничный газ с размером ячеи 50 мкм в емкость с FSW. 2. Химическая диссоциация (по Humphreys, 1963). Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля в безкальциевой и безмагниевой искусственной морской воде с добавлением ЭДТА (CMFSW-E). Измельченные фрагменты ткани в емкости с 40 мл CMFSW-E помещали на орбитальный шейкер на 60 минут при 70 об/мин. Через 60 минут сливали супернатант из емкости, а оставшиеся ткани заливали 40 мл чистой CMFSW-E и возвращали на шейкер на 120 минут при 70 об/мин. Через 120 минут супернатант, содержащий клетки, (супернатант 1) сливали в отдельную емкость, а оставшиеся ткани заливали 40 мл чистой CMFSW-E и возвращали на шейкер на 120 минут при 70 об/мин. Через 120 минут супернатант, содержащий клетки, (супернатант 2) сливали в отдельную емкость. Для удаления мусора, крупных многоклеточных агрегатов и спикул из супернатантов 1 и 2 применяли фильтрование через мельничный газ с размером ячеи 50 мкм. Супернатант 1 и 2 сливали вместе и центрифугировали 10 минут при 800 g для осаждения клеток. Для предотвращения нагревания образцов во время центрифугирования ротор центрифуги предварительно охлаждали. Осажденные клетки дополнительно отмывали от остатков CMFSW-E, которые могли негативно повлиять на последующий процесс реагрегации клеток. В ходе отмывок осажденные клетки заливали FSW, ресуспендировали и помещали на орбитальным шейкер при 70 об/мин. Каждые 30 минут проводили смену FSW – центрифугировали суспензии 3 минуты при 800g, а затем ресуспендировали в свежей порции FSW. Всего проводили по три смены FSW для каждой суспензии. 3. Механо-химическая диссоциация. Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля в CMFSW-E. Измельченные фрагменты тканей протирали сквозь мельничный газ с размером ячеи 50 мкм в емкость с CMFSW-E. Полученные суспензии клеток помещали на орбитальный шейкер на 60 минут при 70 об/мин. Через 60 минут суспензии клеток центрифугировали 10 минут при 800 g для осаждения клеток. Для предотвращения нагревания образцов во время центрифугирования ротор центрифуги предварительно охлаждали. Осажденные клетки дополнительно отмывали от остатков CMFSW-E, которые могли негативно повлиять на последующий процесс реагрегации клеток. В ходе отмывок осажденные клетки заливали FSW, ресуспендировали и помещали на орбитальным шейкер при 70 об/мин. Каждые 30 минут проводили смену FSW – центрифугировали суспензии 3 минуты при 800 g, а затем ресуспендировали в свежей порции FSW. Всего проводили по три смены FSW для каждой суспензии. Метод диссоциации тканей не оказывал заметного влияния на качественный состав суспензии и поведение клеток у обоих исследованных видов. Единственным отличием было уменьшение размеров групп клеток, состоящих из недиссоциировавших хоаноцитов, при использовании химической и механо-химической диссоциации. При дальнейшем культивировании клетки в суспензиях, полученных любым из методов диссоциации тканей, были способны к реагрегации и формированию первичных многоклеточных агрегатов. Суспензии, полученные химическим методом диссоциации тканей, всегда имели низкую концентрацию клеток (меньше, чем 1×107 кл/мл), которая не позволяла получать культуры с необходимой концентрацией клеток. С помощью механического и механо-химического методов диссоциации удавалось получить суспензии клеток сходных высоких концентраций (от 1×107 до 3×107 кл/мл). Но поскольку механо-механический метод требовал гораздо больше времени и включал в себя центрифугирование клеток при высоких ускорениях, в качестве основного метода диссоциации тканей был выбран механический. Полученные после диссоциации тканей суспензии клеток содержали в чистых пластиковых чашках Петри. Концентрация клеток в культурах составляла 1×107 кл/мл. Каждые 48 часов производили замену половины культуральной среды на свежую. Каждые 24 часа на протяжении всего времени культивирования проводили визуальное обследование чашек Петри. Для определения наилучших условий для содержания культур клеток, первые культуры содержались в различных условиях: 1) без термостатирования, при температуре 16-20°С, на шейкере (70 об/мин); 2) без термостатирования, при температуре 16-20°С, без качания на шейкере; 3) при температуре 10-12°С, на шейкере (70 об/мин); 4) при температуре 10-12°С, без качания на шейкере; 5) при температуре 8°С, без качания на шейкере; 6) при температуре 4°С, без качания на шейкере. В качестве культуральной среды использовали FSW или FSW c добавление антибиотика (пенициллин, канамицин, ампицилин, цефазолин или гентамицин). При культивировании суспензий клеток при комнатной температуре (16-20°С) к 24 часам после диссоциации (чпд) происходила гибель клеток губок и активное размножение инфузорий. При других температурах к 24 чпт формировались многоклеточные агрегаты из клеток губок. Инфузории могли присутствовать в культурах в небольших количествах. При долгосрочном культивировании было заметно отставание в развитии агрегатов, находящихся при температуре 4°С. Различий в развитии агрегатов при температурах 8°С и 10-12°С обнаружено не было. В дальнейшем культуры клеток содержали при температуре 10-12°С, т.к. такие температуры воды характерны для местообитания (верхняя сублитораль) особей H. panicea, H. dujardinii и L. complicаta, использованных в экспериментах. Использование шейкера оказывало значительное влияние на протекание реагрегации клеток H. panicea, H. dujardinii и L. complicаta. Использование шейкера позволяло интенсифицировать контакты между клетками и получать более крупные многоклеточные агрегаты. Варьирование времени культивации суспензий клеток на шейкере показало, что оптимальное время для суспензии клеток H. panicea и L. complicata составляет 24 часа, а для суспензий H. dujardinii – 1 час. За это время в культурах обоих видов формировались первичные многоклеточные агрегаты сходных размеров (L. complicata – 105±37 мкм, H. panicea – 222±78 мкм, H. dujardinii – 90±30 мкм). Более продолжительное культивирование на орбитальном шейкере приводило к формированию одного или нескольких крупных агрегатов размером до 10 мм, в состав которых входила большая часть клеток культуры (Рисунок 1). Такие агрегаты были нежизнеспособны и погибали в течение нескольких последующих суток. Использование в качестве культуральной среды FSW c добавление любого из антибиотиков приводило к заметному уменьшению количество бактерий в культуральной среде. Начальные этапы процесса реагрегации клеток у исследованных видов губок в присутствии данных антибиотиков протекали нормально. Тем не менее, и при использовании в качестве культуральной среды FSW и ее регулярной смене не происходило сильного развития размножения бактерий, которое бы мешало протеканию реагрегации клеток исследованных видов. В дальнейших экспериментах в качестве культуральной среды использовали FSW, т.к. антибиотики могли оказывать негативное влияние на реагрегацию клеток при долговременном воздействии. Также было исследовано влияние на процесс реагрегации характера субстрата для прикрепления примморфов и переноса культур в аквариум с естественной морской водой. Для исследования возможности примморфов к различным субстратам, агрегаты переносили на один из четырех субстратов: 1) чистое покровное стекло размером 24×24 мм, 2) покровное стекло размером 24×24 мм, покрытое поли-D-лизином, 3) покровное стекло размером 24×24 мм, покрытое поли-L-лизином и 4) покровное стекло размером 24×24 мм, покрытое желатином. Каждое покровное стекло помещали в отдельную чашку Петри диаметром 30 мм с FSW, куда затем переносили 10-15 примморфов или ранних примморфов. Эксперимент повторяли 2-3 раза с агрегатами, полученными от разных особей каждого исследованного вида. Если агрегаты не прикреплялись к субстрату в течение трех суток, эксперимент заканчивали и считали, что агрегаты не способны прикрепляться к данному субстрату. Для оценки влияния переноса многоклеточных агрегатов в аквариум с естественной морской водой на их развитие дальнейшее развитие, часть агрегатов исследованных видов, сформировавшихся в культурах через 24 часа после диссоциации тканей, переносили в открытых чашках Петри диаметром 30 мм в аквариум с биологическими фильтрами для дальнейшего культивирования. Остальные условия культивирования данных агрегатов не отличались от стандартных условий. Использованные в экспериментах субстраты, кроме поли-L-лизина, не способствовали прикреплению примморфов ни у одного из исследованных видов и никак не влияли на их дальнейшее развитие. Поли-L-лизин оказывал негативное влияние на развитие примморфов у всех исследованных видов, вызывая разрушение примморфов в течение 1-2 суток. Перенос многоклеточных агрегатов в аквариум с естественной морской водой оказывал положительное влияние на их дальнейшее развитие у всех исследованных видов, которое выражалось в ускорении развития агрегатов, и позволяя им достигать более прогрессивных стадий развития (по сравнению с агрегатами, полученными от тех же особей, но культивировавшимися в чашках Петри). Динамика реагрегации клеток У H. dujardinii и L. complicata реагрегация клеток проходила сходным образом. В ходе этого процесса в культурах этих видов формировались многоклеточные агрегаты, которые проходили строго определенные стадии развития. В протекании процесса реагрегации проявлялись и видоспецифичные черты: у исследованных видов отличались скорости протекания реагрегации и завершающая стадия процесса (Таблица 1). Первая стадия реагрегации клеток у изученных видов – первичные многоклеточные агрегаты. Они представляли собой небольшие агрегаты клеток разнообразной формы – от округлой до сложно разветвленной. Очертания первичных агрегатов были крайне неровными (Рисунок 2А, Б , 3А). Первичные агрегаты в культурах H. dujardinii формировались очень быстро – через 1 час после диссоциации (чпд). У L. complicata этот процесс происходил значительно медленнее – первичные агрегаты формировались к 24 чпт (Таблица 1). Характерной особенностью первичных многоклеточных агрегатов L. complicata является наличие на их поверхности полых тонкостенных пузырей, стенка которых образована клетками агрегата (Рисунок 2А, Б). В некоторых культурах агрегаты сохраняли эти пузыри до финальных стадий развития (Рисунок 2Г). В ходе дальнейшего развития первичные агрегаты обоих видов преобразовывались в ранние примморфы. В культурах H. dujardinii это происходило к 3-5 чпд, а в культурах L. complicata – только к 5-7 суткам после диссоциации (спд) (Таблица 1). Ранние примморфы имели больший размер, округлую или овальную форму и более ровные очертания по сравнению с первичными агрегатами (Рисунок. 2В, Г, 3Б). В большинстве культур L. complicata ранние примморфы не претерпевали дальнейшего развития и были завершающей стадией реагрегации клеток (Таблица 1). Ранние примморфы H. dujardinii были способны преобразовываться в настоящие примморфы, которые характеризовались абсолютно гладкой поверхностью (Рисунок 3В). Формирование настоящих примморфов H. dujardinii происходило уже к 1-3 спд (Таблица 1). В одной культуре L. complicata ранние примморфы также преобразовывались в настоящие примморфы к 10-11 спд. Ранние и настоящие примморфы этого вида не были способны к дальнейшему прогрессивному развитию, но могли сохранять жизнеспособность в культуре до 25 спд. Настоящие примморфы H. dujardinii, напротив, были способны к прогрессивному развитию, которое заканчивалось восстановлением функционирующих и жизнеспособных губок (Таблица 1). В ходе этого процесса происходило прикрепление примморфов к субстрату, формирование в них элементов новой водоносной системы (каналов и хоаноцитных камер) (к 4-6 спд) и, на завершающих этапах, формирование оскулюма (к 10-13 спд) (Рисунок 3Г, Д, Е). Восстановившиеся губки долгое время сохраняли жизнеспособность (Рисунок 3Ж). В ходе экспериментов максимальная продолжительность жизни восстановившихся особей H. dujardinii составила более 70 суток. Реагрегация клеток H. dujardinii и L. complicata изучалась в июле и августе. Во всех культурах клеток L. complicata процесс реагрегации происходил одинаково, по схеме, описанной выше. Однако в случае культур H. dujardinii приведенные выше данные описывают протекание этого процесса в культурах клеток, полученных от особей в августе. В культурах клеток, полученных от особей H. dujardinii в июле, реагрегация протекала медленнее и не всегда заканчивалось восстановлением исходной организации губки: 1) настоящие примморфы формировались только к 3-6 спд, 2) полости в них появлялись к 8-10 спд, 3) восстановление губок происходило только к 18 спд, но не во всех культурах. Вероятно, такие различия в протекании процесса реагрегации связаны с изменениями структуры и физиологического состояния тканей H. dujardinii в связи протеканием жизненного цикла этого вида. Поскольку изменения в протекании реагрегации клеток в разные месяцы наблюдались только в культурах H. dujardinii, но не в культурах L. complicata, для более детального изучения этого явления и выявления его причин в проект был добавлен еще один модельный объект из класса Demospongiae – Halichondria panicea (Pallas, 1766). На данный момент изучена динамика протекания реагрегации клеток этого вида в июле. В целом, характер протекания реагрегация у этого вида сходен с протеканием этого процесса у L. complicata и H. dujardinii, однако имеет и видоспецифичные особенности. Первичные многоклеточные агрегаты формируются в культурах через 24 чпд и представляют собой небольшие агрегаты разнообразной формы (Таблица 1, Рисунок 4А). К 3 спд начинается процесс трансформации первичных агрегатов в ранние примморфы. У H. panicea этот процесс сопровождался формированием вокруг агрегатов полупрозрачной оболочки, которая состояла из мертвых клеток и клеточного дебриса (Рисунок 4Б). Вероятно, эта оболочка выделалась самими агрегатами. К 5-8 спд агрегаты освобождались от оболочки и представляли собой ранние примморфы (Таблица 1, Рисунок 4В). В течении следующих двух суток ранние примморфы преобразовывались в настоящие примморфы (Рисунок 4Г). Настоящие примморфы H. panicea были завершающей стадией реагрегации. Они сохраняли жизнеспособность в культуре, но не были способны к прогрессивному развитию (Таблица 1). Строение многоклеточных агрегатов и примморфов Часть полученных в культурах многоклеточных агрегатов L. complicata и H. dujardinii, а также интактные ткани обоих видов губок фиксировали. Многоклеточные агрегаты фиксировали каждые 48 часов на протяжении всего времени культивирования. Зафиксированные агрегаты и ткани исследовали гистологическими, ультраструктурными и иммуногистохимическими методами. Фиксацию проводили 2,5% глютаровым альдегидом на фосфатном буфере Миллонига (Millonig, 1964). Для проведения гистологических и ультраструктурных исследований дополнительно проводили постфиксацию 1% тетраоксидом осмия на том же буфере. Для проведения гистологических и ультраструктурных исследований с использованием трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ) зафиксированные образцы обезвоживали и заключали в эпоксидную смолу Araldite502/Embed-812 embedding media в соответствии с инструкциями производителя. Для исследований под сканирующим электронным микроскопом (СЭМ) образцы постепенно обезвоживали, высушивали в критической точке и напыляли золотом и платиной. В ходе иммуногистохимических исследований образцы окрашивали DAPI для выявления клеточных ядер и антителами к α тубулина для выявления хоаноцитов (по окраске жгутиков). Первичные многоклеточные агрегаты L. complicata и H. dujardinii представляют собой агрегаты клеток без четко выраженной структуры. Клетки в их составе упакованы неплотно, и клетки на поверхности не отличаются от глубжележащих клеток (Рисунок 5А, Б, Д, 11А, 15А, Б). Большая часть первичных многоклеточных агрегатов L. complicata имеет крайне неровную поверхность (Рисунок 5В) и несет на ней пузыри, стенка которых образована теми же клетками, что и основная часть агрегата (Рисунок 5Г, Е). На ранних этапах реагрегации стенки пузырей образованы несколькими слоями клеток (Рисунок 5Г). С увеличением возраста агрегатов большая часть пузырей приобретает стенки, построенные из одного слоя клеток, которые имеют трапециевидную форму, что приводило к увеличению площади контактов между соседними клетками (Рисунок 5E). Все клетки в составе первичных многоклеточных агрегатов имеют размеры 5 9 мкм. Среди них удается выделить только хоаноциты, которые имеют естественные ультраструктурные маркеры (Рисунок 6). Эти клетки несут жгутик и воротничок из микроворсинок. Ядро хоаноцитов имеет характерную каплевидную форму (Рисунок 6А, Б). Кинетосома жгутика лежит рядом с заостренной частью ядра. От проксимальной части кинетосомы отходят корешки в сторону ядра, а от боковых частей – микротрубочки. Дополнительная центриоль лежит рядом с кинетосомой и повернута относительное нее на 90 градусов (Рисунок 6Б). Остальные клетки в составе первичных многоклеточных агрегатов не имеют специфических черт строения, и их принадлежность к каким-либо клеточным типам установить не удалось. Эти клетки рассматривались нами как амебоциты (Рисунок 7). Помимо клеток самой губки в состав многоклеточных агрегатов L. complicata входили палочковидные бактерии (Рисунок 5Г, 7В). Начиная с момента преобразования первичных агрегатов L. complicata в ранние примморфы на их поверхности появляются группы клеток полигональной формы, часть из которых уплощена (Рисунок 8). Вероятно, это центры эпителизации. В составе этих очагов присутствуют и хоаноциты, которые легко идентифицируются по наличию жгутика и воротничка микроворсинок. Упаковка клеток в ранних примморфах плотная, все клетки имеют полигональную форму. Во внутренней части примморфов отсутствуют крупные полости, хотя небольшие свободные пространства между клетками все еще присутствуют. С увеличением возраста ранних примморфов упаковка клеток становится более плотной, в большинстве случаев между клетками сохраняются лишь небольшие свободные пространства (Рисунок 9). С увеличением возраста ранних примморфов в них могут появляются небольшие полости, заполненные неклеточным материалом (Рисунок 9А, Б). Вероятно, это очаги дегенерации клеток. На поверхности ранних примморфов увеличивается число и размер очагов эпителизации, а клетки, входящие в их состав, приобретают более уплощенную форму. Клеточный состав и ультрастуруктура клеток в ранних примморфах почти не отличаются от таковых в первичных многоклеточных агрегатах. Частичная или полная потеря воротничков из микроворсинок хоаноцитами на поверхности ранних примморфов L. complicata была единственным признаков дедифференцировки хоаноцитов в ходе реагрегации клеток данного вида. Большинство хоаноцитов сохраняли характерные признаки (каплевидное ядро и жгутик, окруженный воротничков микроворсинок) на протяжении всего процесса реагрегации клеток: полностью дифференцированные хоаноциты всегда присутствовали во внутренней части ранних примморфов (Рисунок 6В, Г, 9В). Исследования первичных агрегатов и ранних примморфов разных возрастов методом иммуногистохимии показали, что количество хоаноцитов в агрегатах не претерпевало значительных изменений в ходе реагрегации клеток (Рисунок 10). Первичные многоклеточные агрегаты H. dujardinii состоят из клеток размером 10-20 мкм. Все клетки активно образуют псевдоподии и, судя по их форме, находятся в процессе активного движения (Рисунок 11А). В составе первичных многоклеточных агрегатов H. dujardinii были идентифицированы хоаноциты, ряд типов клеток со специфическими включениями (гранулярные, микрогранулярные и сферульные клетки), ядрышковые амебоциты (Рисунок 11Б-Е). Нам удалось проследить судьбу клеток со специфическими включениями и хоаноцитов в ходе развития многоклеточных агрегатов H. dujardinii благодаря тому, что эти типы клеток имеют естественные ультраструктурные маркеры. Маркерами клеток со специфическими включениями являются сами включения, имеющие уникальную ультраструктуру в каждом типе клеток (Рисунок 11Г-Е). Маркерами хоаноцитов на ранних этапах развития многоклеточных агрегатов являлись жгутик, окруженный воротничком микроворсинок, каплевидное ядро и ассоциированная с ним кинетосома жгутика, а также аппарат Гольджи, представленный двумя стопками диктиосом (Рисунок 11В). На более поздних этапах – специфические мелкие электронно-плотные включения (см. ниже). Остальные типы клеток, характерные для интактных тканей H. dujardinii (экзо-, эндо-, базопинакоциты, лофоциты), вероятно, испытывают дедифференцировку на ранних этапах реагрегации и становились неотличимыми от ядрышковых амебоцитов. В результате происходило формирование в составе первичных агрегатов H. dujardinii гетерогенного пула ядрышковых амебоцитов, который состоял из ядрышковых амебоцитов интактных тканей губки и дедифференцировавшихся клеток (Рисунок 12). Иммуногистохимические исследования показали, что в ходе дальнейшего развития агрегатов H. dujardinii происходят изменения количества хоаноцитов. Количество хоаноцитов резко уменьшается при трансформации первичных многоклеточных агрегатов в ранние примморфы и примморфы (Рисунок 13). На этом этапе хоаноциты претерпевают дедифференцировку, в результате которой постепенно теряют характерные признаки и становятся неотличимы от ядрышковых амебоцитов, пополняя гетерогенный пул ядрышковых амебоцитов (Рисунок 12). В ходе этой дедифференцировки хоаноциты проходят стадию, когда в их цитоплазме появляются мелкие электронно-плотные включения (Рисунок 14). На ранних стадиях дедифференцировки электронно-плотные включения встречаются в клетках, которые все еще обладают характерными признаками хоаноцитов (Рисунок 14А). В дальнейшем электронно-плотные включения становятся единственным отличительным признаком дедифференцирующихся хоаноцитов и позволяют прослеживать судьбу хоаноцитов вплоть до 6-7 спд (Рисунок 14Б, В). В ходе дальнейшего прогрессивного развития примморфов количество хоаноцитов снова резко возрастает на финальных этапах восстановления исходной организации губки, когда происходит окончательная дифференцировка клеток в составе зачатков хоаноцитных камер (Рисунок 13Д). Также в ходе трансформации первичных многоклеточных агрегатов H. dujardinii в примморфы происходит эпителизация их поверхности. В ходе преобразования первичных агрегатов в ранние примморфы (5-7 чпд) на их поверхности появляться первые уплощенные клетки, которые затем покрывают почти всю поверхность агрегатов. В основном экзопинакоциты возникают из гетерогенного пула ядрышковых амебоцитов (Рисунок 12). Однако среди поверхностных клеток встречаются и хоаноциты, находящиеся в процессе трансдифференцировки в экзопинакоциты: их удается выделить благодаря наличию жгутика и воротничка микроворсинок (Рисунок 12, 15А, Б, В). На этой стадии большинство клеток в составе экзопинакодермы формирует большое количество псевдоподий (Рисунок 15Г). Окончательная эпителизация агрегатов происходит при преобразование ранних примморфов в настоящие примморфы на 1-3 спд (Рисунок 15Е). К этому времени часть экзопинакоцитов начинает принимать Т-образную форму, характерную для интактных экзопинакоцитов H. dujardinii. Во внутренней части примморфов происходит незначительное уплотнение упаковки клеток, но между ними остаются свободные пространства, заполненные многочисленными отростками клеток (Рисунок 16А). Примморфы H. dujardinii способны к прогрессивному развитию, которое заканчивается формирование функциональной и жизнеспособной особи. На гистологическом уровне это развитие проявляется в постепенном возникновении структур характерных для интактной губки – каналов водоносной системы, хоаноцитных камер, мезохила и т.д. Одновременно с полной эпителизацией агрегатов происходит формирование первых зачатков каналов водоносной системы. Эти зачатки представляют собой небольшие полости между клетками, у которых пока отсутствует выстилка из эндопинакоцитов (Рисунок 16Б). К 5-7 спд в развивающихся примморфов появляются многочисленные зачатки хоаноцитных камер, которые выглядят как плотные розетки клеток (Рисунок 16В, Г). Клетки в составе этих зачатков имеют столбчатую форму, с радиально ориентированной длинной осью (Рисунок 17А). Судя по их ультраструктуре клетки зачатков хоаноцитных камер возникают из гетерогенного пула ядрышковых амебоцитов (Рисунок 12). В ходе дальнейшего развития эти клетки начинают дифференцироваться в хоаноциты и постепенно приобретают признаки, характерные для этого типа клеток: каплевидное ядро, стопки диктиосом аппарата Гольджи с двух сторон от узкой части ядра, а также жгутик и микроворсинки, которые смотрят в полость в центральной части зачатка (Рисунок 17Б, В, Е). К этому времени зачатки каналов водоносной системы увеличиваются в размерах и приобретают выстилку из эндопинакоцитов, возникающих из гетерогенного пула ядрышковых амебоцитов (Рисунок 12, 16Г, 17Г). Экзопинакодерма также претерпевает изменения – большинство экзопинакоцитов принимает Т-образную форму. Кроме того, под экзопинакодермой формируется поддерживающий слой из волокон коллагена. Весь остальной объем агрегата представляет собой развивающийся мезохил будущей губки. На гистологическом уровне в мезохиле также происходят значительные структурные изменения по сравнению с предыдущими стадиями развития – в мезохиле остается лишь небольшое количество клеток, а его основной объем составляет вновь синтезированный фибриллярный внеклеточный матрикс. За синтез внеклеточного матрикса, скорее всего, отвечают лофоциты, которые, вероятно, возникают из гетерогенного пула ядрышковых амебоцитов, к 4-5 спд (Рисунок 12, 17Д). Также в мезохиле значительно увеличивается количество клеток с включениями. К 9-10 спд в структуре развивающегося примморфа появляются многие черты характерные для интактной особи: 1) водоносная система хорошо развита (Рисунок 16Е, Ж); 2) в мезохиле еще больше увеличивается количество внеклеточного матрикса и уменьшается количество свободных клеток (Рисунок 16Ж); 3) все экзопинакоциты приобретают Т-образную форму, и в экзопинакодерме появляются остии (Рисунок 16Г, З И). В это же время начинается формирование зачатков оскулюмов. После их открытия губка имеет полностью сформированную и функциональную водоносную систему и по своей организации близка к рагону. Подбор метода окраски пролиферирующих клеток Нами был произведена подбор метода окраски пролиферирующих клеток губок с помощью 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) (маркирует клетки, в которых происходит синтез ДНК), поскольку стандартная методика окраски, приведенная в инструкции производителя, оказалась нерабочей в случае губок. Для подбора метода окраски пролиферирующих клеток использовали только интактные ткани L. complicata и H. dujardinii. В ходе экспериментов варьировали время инкубации (6, 12, 24 часа) и концентрацию EdU (10, 20, 50, 100 мкМ). Последующее выявление метки во всех случаях проводили с помощью Click-реакции по стандартной инструкции производителя. Также производилась DAPI для выявления ядер и антителами к α тубулина для выявления хоаноцитов (по окраске жгутиков). Препараты тканей исследовали с помощью лазерного конфокального микроскопа Nikon A1. В случае тканей L. complicata клетки, синтезирующие ДНК (пролиферирующие), выявлялись после инкубации губок в течении 6 часов в морской воде с 20 мкМ EdU при температуре 11ºC. Почти все пролиферирующие клетки были сосредоточены на уровне хоанодермы, и в большинстве случаев можно с уверенностью сказать, что пролиферируют именно хоаноциты. На уровне экзопинакодермы встречались единичные клетки с EdU-меткой (Рисунок 18А). В случае тканей H. dujardinii клетки, синтезирующие ДНК (пролиферирующие), выявлялись после инкубации губок в течении 24 часов в морской воде с 100 мкМ EdU при температуре 11ºC. В этом случае большинство делящихся клеток – хоаноциты, но встречаются и единичные клетки мезохила с EdU-меткой (Рисунок 18Б). В ходе дальнейших исследований эти протоколы позволят изучить пролиферацию клеток в ходе процесса реагрегации L. complicata и H. dujardinii. Разделение фракций клеток H. dujardinii Нами были сделаны попытки подбора методики выделения чистых или обогащенных фракций клеток из суспензий H. dujardinii с помощью центрифугирования на плотностных градиентах Percoll. Для этих экспериментов суспензии клеток получали с помощью механо-химического метода диссоциации. В ходе центрифугирования клетки оставались в CMFSW-E, что должно предотвращать их преждевременную агрегацию. В ходе экспериментов были опробованы следующие варианты градиентов (числа означают концентрацию Percoll в каждом слое градиента): 1) 10% / 20% / 30% / 40%; 2) 32% /34 % / 36 %/ 38 % / 40%; 3) 30% / 40 % / 50%; 4) 40% / 50 % / 60 % / 70 %. На каждом градиенте производилось центрифугирование с помощью центрифуги LMC-3000 в четырех режимах: 1) 400g, 15 минут, 2) 400g, 30 минут, 3) 800g, 15 минут; 4) 800g, 30 минут. Ни в одном из экспериментов не удалось получить фракций клеток, во всех случаях клетки перемещались по градиенту единой группой. При использовании ускорения 400g клетки останавливались на границе слоя 40% Percoll, а в случае ускорения 800g – проходили весь градиент насквозь, формируя осадок на дне пробирок. Возможной причиной такого поведение суспензий клеток является присутствие в них большого количества тяжей внеклеточного матрикса из тканей интактных губок, который попадает туда в суспензии в ходе диссоциации механо-химическим методом. Вероятно, это матрикса связывает все или почти все клетки вместе, потому они всегда передвигаются по градиенту вместе. В ходе дальнейших исследований мы планируем получать суспензии клеток H. dujardinii химическим методом диссоциации тканей. Этот метод дает менее концентрированные суспензии клеток, но позволит избежать попадания в суспензии тяжей внеклеточного матрикса, т.к. в нем отсутствует механическое протирание тканей губки. Кроме того, мы планируем включить в эксперименты по разделению фракций клеток L. complicata, которая не имеет такого можно развитого внеклеточного матрикса.
2 5 мая 2017 г.-12 апреля 2018 г. Поведение основных типов клеток в ходе реагрегации и последующих восстановительных процессов у губок (Porifera)
Результаты этапа: Разделение фракций клеток H. dujardinii и окрашивание клеток липотрейсерами В течении двух лет реализации проекта нами были сделаны попытки подбора методики выделения чистых или обогащенных фракций клеток из суспензий H. dujardinii с помощью центрифугирования на плотностных градиентах Percoll. В первый год для этих экспериментов суспензии клеток получали с помощью механо-химического метода диссоциации, во второй год – с помощью химического метода. В обоих случаях ходе центрифугирования клетки оставались в CMFSW-E, что должно предотвращать их преждевременную агрегацию. Ни в одном из экспериментов не удалось получить фракций клеток, во всех случаях клетки перемещались по градиенту единой группой. При использовании ускорения 400g клетки останавливались на границе слоя 40% Percoll, а в случае ускорения 800g – проходили весь градиент насквозь, формируя осадок на дне пробирок. Возможной причиной такого поведение суспензий клеток является присутствие в них большого количества тяжей внеклеточного матрикса из тканей интактных губок, который попадает туда в суспензии в ходе диссоциации. Вероятно, этот матрикс связывает все или почти все клетки вместе, потому они передвигаются по градиенту вместе. Мы обнаружили, что на границе воды (которая содержала суспензию клеток губки) и первого слоя Percoll в ходе центрифугирования происходила концентрация бактерий. При этом на границах глубже лежащих слоев мы никогда не обнаруживали бактерий, в том числе и в суспензии клеток губки после центрифугирования. Вероятно, таким способом можно получать суспензии клеток губок без их симбиотических бактерий, что позволит исследовать роль и влияние симбиотических бактерий на процесс реагрегации клеток губок. Поскольку нами не удалось подобрать методику выделения чистых фракций клеток H. dujardinii, мы не смогли провести исследования поведения и судьбы конкретных клеточных типов, меченных липотрейсерами, в ходе реагрегации клеток и восстановления исходной организации губки. Тем не менее, нами была отработана методика окрашивания клеток H. dujardinii и L. complicata липотрейсерами SP-DiOC18(3) и DiO. Липотрейсер SP-DiOC18(3) не окрашивал клетки L. complicata и H. dujardini в исследованных концентрациях и времени экспозиции. Липотрейсер DiO, напротив, окрашивал клетки исследованных видов при всех исследованных комбинациях концентрации и времени экспозиции. Во всех случаях DiO окрашивал 10-15% клеток в суспензии. Количество меченых клеток не зависело от концентрации липотрейсера и времени экспозиции. Однако повышение концентрации DiO и времени экспозиции приводило к выпадению не связанного с клетками липотрейсера в осадок, что усиливало фоновую флуоресценцию. Поэтому оптимальной стратегией мечения клеток с помощью этого липотрейсера является короткое (2 ч) экспонирование клеток губок низкой концентрации (2 мкМ) DiO. Клетки L. complicata и H. dujardini, окрашенные DiO, полностью сохраняли свою жизнеспособность и были способны к полноценной реагрегации. Через 24-48 ч после экспозиции липотрейсеру в цитоплазме изначально не меченных клеток появлялись мелкие флуоресцирующие включения. Впоследствии такие включения могут передаваться другим клеткам. Динамика процесса реагрегации клеток губок: внутривидовая вариабельность В протекании реагрегации клеток нами была обнаружена и внутривидовая вариабельность этого процесса. В первый год реализации проекта мы обнаружили, что в разные месяцы в культурах H. dujardinii и H. panicea реагрегация клеток протекала с разной скоростью и останавливалась на разных стадиях развития. Одной из причин внутривидовой вариабельности протекания процесса реагрегации клеток могут быть различия в физиологическом состоянии губок, которое меняется в ходе жизненного и репродуктивного циклов, а также в разные сезоны года. Поэтому во второй год реализации проекта, нами были проведены эксперименты по реагрегации клеток H. dujardinii и H. panicea в культурах, полученных от губок на разных стадиях репродуктивного цикла (поскольку физиологическое состояние губок, а также структура их соматических тканей очень сильно зависят от стадии жизненного и репродуктивного циклов). У обоих видов динамика процесса во многом зависит от стадии репродуктивного цикла. Реагрегация клеток наиболее успешно проходит в культурах, полученных от особей период роста. В таких культурах реагрегация идет наиболее быстро, и во всех культурах многоклеточные агрегаты достигают наиболее прогрессивной для каждого из видов стадии развития (примморфы у H. panicea; функционирующие и жизнеспособные губки у H. dujardinii). Период гаметогенеза является чуть менее благоприятным для реагрегации клеток: реагрегация идет немного медленнее, но в большинстве культур многоклеточные агрегаты достигают наиболее прогрессивной для каждого из видов стадии развития (в небольшом количестве культур многоклеточные агрегаты гибнут на более ранних стадиях развития). Наименее благоприятными для реагрегации клеток стадиями репродуктивного цикла являются стадия эмбриогенеза и стадия восстановления соматических тканей после выхода личинок. Реагрегация клеток в таких культурах идет заметно хуже: 1) у H. panicea скорость протекания реагрегации не изменяется по сравнению с культурами клеток, полученными от особей на стадии гаметогенеза, однако завершающей стадией процесса являются или первичные многоклеточны агрегаты, или ранние примморфы; 2) у H. dujardinii, полученных от особей на стадиях реагрегация идет медленно, и, кроме того, в большинстве культур примморфы не способны преобразовываться в функционирующих и жизнеспособных губок. Наблюдаемые изменения динамики процесса реагрегации клеток H. panicea и H. dujardinii на разных стадиях репродуктивных циклов этих видов, скорее всего, связаны с перестройками соматических тканей губок, которые сопровождают половое размножение. Развитие многоклеточных агрегатов: морфогенезы и судьба клеток Первичные многоклеточные агрегаты L. complicata и H. dujardinii представляют собой агрегаты клеток без четко выраженной структуры. Клетки в их составе имеют одинаковый размер, упакованы неплотно, и клетки на поверхности не отличаются от глубжележащих клеток. В составе первичных многоклеточных агрегатов изученных видов были идентифицированы хоаноциты и ряд типов клеток со специфическими включениями (гранулярные, микрогранулярные, вакуолярные и сферульные клетки) (в агрегатах H. dujardinii). Остальные клетки в составе первичных многоклеточных агрегатов не имеют специфических черт строения, и их принадлежность к каким-либо клеточным типам установить не удалось. Эти клетки рассматривались нами как амебоциты. Мы считаем, что отсутствие в агрегатах других типов клеток (например, таких как экзо- и эндопинакоциты, лофоциты) связано с тем, что эти типы клеток теряют характерные для них признаки на ранних этапах реагрегации и приобретают сходную морфологию и ультраструктуру с ядрышковыми амебоцитами, что может быть рассмотрено как процесс их дедифференцировки. В результате этих процессов в агрегатах формируется крайне гетерогенны пул амебоцитов, который включает в себя как амебоциты интактных тканей губки, так и дедифференцированные клетки. В состав первичных агрегатов обоих видов входят бактерии, имеющие те же морфотипы, что и симбиотические бактерии этих видов губок. На стадии ранних примморфов у исследованных видов начинается процесс эпителизации. В процессе эпителизации у обоих видов участвуют амебоциты и хоаноциты, которые отличаются благодаря наличию жгутики и воротничка микроворсинок. При этом у ранних примморфов H. dujardinii на поверхности появляются отдельные экзопинакоциты, а у примморфов L. complicata – центры эпителизации, где в экзопинакоциты трансформировалась сразу группа клеток. В обоих случаях эпителизации происходит благодаря подвижности и изменениям формы отдельных клеток на поверхности агрегатов. Эти клетки постепенно уплощаются, трансдифференцируясь в экзопинакоциты. Позже соседние экзопинакоциты вступают в контакт друг с другом и формируют экзопинакодерму. То есть эпителизации поверхности примморфов происходит благодаря мезенхимально-эпителиальной трансформации поверхностных клеток агрегатов. На этой же стадии развития H. dujardinii происходит дедифференцировка хоаноцитов во внутренних частях агрегатов. Дедиференцирующиеся хоаноциты пополняют гетерогенный пул амебоцитов. В ходе этой дедифференцировки хоаноциты проходят промежуточную стадию, характерной чертой которой является наличие в цитоплазме мелких электронно-плотных включений. Они позволяют еще некоторое время прослеживать судьбу хоаноцитов, не смотря на потерю ими основных характерных признаков. Хоаноциты L. complicata и клетки со специфическими H. dujardinii, напротив, сохраняют свою исходную дифференцировку на протяжении всего процесса реагрегации. Последующая трансформация ранних примморфов в настоящие примморфы сопровождается у обоих видов формированием на их поверхности сплошной экзопинакодермы. Примморфы были последней стадией реагрегации клеток L. complicata. Вероятно, это связано с крайне плотной упаковкой клеток в их составе, что препятствовало движению и изучению формы клеток, без которых не возможны дальнейшие морфогенезы. Примморфы H. dujardinii способны к прогрессивному развитию, которое заканчивается формированием функционирующих особей. В составе примморфов этого вида упаковка клеток неплотная, между клетками сохраняются свободные пространства, что дает им возможность активной локомоции. Эта подвижность клеток обеспечивает все последующее развитие. На гистологическом уровне это развитие проявляется в постепенном возникновении структур, характерных для интактной губки. Центральное место в процессе развитие примморфа в губку занимает восстановление водоносной системы, которое включает в себя формирование каналов и хоаноцитных камер. Оба типа структур формируют благодаря движению клеток и последующей мезенхимально-эпителиальной трансформации. В ходе формирования каналов клетки расходятся, оставляя свободное пространство между собой, которое пока не имеет эндопинакоцитной выстилки. Это пространство является полостью будущего канала водоносной системы. Эндопинакоцитная выстилка формируется позже, скорее всего, за счет уплощения клеток, которые ограничивали полость канала. Формирование хоаноцитных камер происходит благодаря движению клеток друг к другу. Клетки, которые участвуют в этом процессе имеют морфологию ядрышковых амебоцитов. В результате формируются плотные сферические группы клеток, являющиеся зачатками будущих камер, которые на гистологических срезах выглядят как розетки клеток. Затем в этих зачатках появляется полость, а клетки начинают дифференцироваться в хоаноциты и постепенно приобретают признаки, характерные для этого типа клеток – каплевидное ядро, кольцевой аппарат Гольджи, конечно, жгутик и воротничок микроворсинок. Одновременно с формированием элементов будущей водоносной системы в развивающихся примморфах происходят прогрессивные изменений в мезохиле. Поскольку большая часть клеток принимает участие в формировании хоаноцитных камер и выстилки каналов, в мезохиле остается лишь небольшое количество свободных клеток, а свободные пространства между ними заполняются фибриллярным внеклеточным матриксом – вероятно, коллагеном, который синтезируется вновь дифференцировавшимися лофоцитами. Основными типами клеток в мезохиле будущей губки становятся разнообразные клетки с включениями. На финальных этапах этого развития происходит формирование остий в экзопинакодерме и закладка оскулюмов, после чего губка начинает фильтровать воду. В этот момент по своей организации она близка к рагону – молодой губке, сформировавшейся непосредственно после оседания личинки. Весь процесс развития от суспензии клеток до функционирующей и жизнеспособной губки занимает 10-13 суток. Таким образом, основным источником дифференцировки недостающих клеточных типов при прогрессивном развитии агрегатов H. dujardinii является гетерогенный пул амебоцитов, в меньшей степени хоаноциты, дающие экзопинакоциты, а клетки с включениями не меняют своей исходной дифференцировки на протяжении всего развития. Пролиферация клеток в ходе реагрегации и развития многоклеточных агрегатов В первый год реализации проекта были отработаны методики маркирования и выявления пролиферирующих клеток в интактных тканях исследуемых видов. В случае тканей L. complicata пролиферирующие клетки выявлялись после инкубации губок в течении 6 часов в морской воде с 20 мкМ EdU при температуре 11ºC. Почти все пролиферирующие клетки были сосредоточены на уровне хоанодермы, и в большинстве случаев можно с уверенностью сказать, что пролиферируют именно хоаноциты. На уровне экзопинакодермы и мезохила встречались единичные клетки с EdU-меткой. В случае тканей H. dujardinii пролиферирующие клетки выявлялись после инкубации губок в течении 24 часов в морской воде с 100 мкМ EdU при температуре 11ºC. В этом случае большинство делящихся клеток – также хоаноциты, но встречаются и единичные клетки мезохила с EdU-меткой. Во второй год реализации проекта были проведены исследования пролиферации ходе реагрегации клеток исследуемых видов с использованием протоколов, отработанных на интактных тканях губок. Клеточная пролиферация наблюдается на всех стадиях реагрегации H. dujardinii, но происходят изменения количества и локализации делящихся клеток. На стадии первичных агрегатов/ранних примморфов (0-24 чпд) в составе агрегатов находится множество делящихся клеток, которые распределены равномерно по объему агрегата. При трансформации в настоящие примморфы (24-48 чпд) количество пролиферирующих клеток начинает снижаться, но их локализация не меняется. После начала развития водоносной системы наблюдается минимум клеточной пролиферации: на этой стадии агрегаты могут содержать лишь единичные меченные клетки. В дальнейшем, после начала формирования зачатков хоаноцитных камер, количество пролиферирующих клеток опять начинает расти. При этом изменяется и их локализация – теперь большинство делящихся клеток входит в состав зачатков хоаноцитных камер, и лишь единичные меченные клетки обнаруживаются в мезохиле развивающейся губки. К концу развития губки из примморфов количество и локализация делящихся клеток в них сходна с интактными тканями H. dujardinii – множество делящихся клеток в составе хоаноцитных камер и единичные в мезохиле. В составе многоклеточных агрегатов L. complicata пролиферирующие клетки не были выявлены ни на одной из стадий реагрегации. Возможно, развитие агрегатов этого вида происходит без участия клеточной пролиферации или же требуются дополнительные модификации протокола для выявления делящихся клеток в составе агрегатов этого вида (например, удлинение времени инкубации в EdU). Апоптоз в ходе реагрегации и развития многоклеточных агрегатов Во второй год реализации проекта были отработаны методики выявления апоптотирующих клеток в интактных тканях H. dujardinii и L. complicata. В тканях H. dujardini успешном удалось визуализировать клетки в состоянии апоптоза. Все примененные методы выявляли небольшое количество клеток, в которых они окрашивали мелкие цитоплазматические включения. Меченные клетки преимущественно находились в мезохиле губки, но реже могли встречаться и в составе хоаноцитных камер. В образцах положительного контроля количество окрашенных клеток резко возрастало, особенно в поверхностных участках губки, которые подвергались наибольшему воздействию индуцирующих апоптоз факторов. Принципиально одинаковая картина апоптоза клеток в тканях губки, выявляемая разными методами, и резкое увеличение количества меченных клеток в положительных контролях служат подтверждением специфичности полученных окрасок. В тканях L. complicata, напротив, ни один из методов не выявил клеток в состоянии апоптоза, что может указывать как на редкость данного процесса в тканях этой губки, так и на необходимость модификации стандартных протоколов визуализации апоптоза для работы с известковыми губками. Затем нами были проведены исследования апоптоза клеток в ходе реагрегации и развития многоклеточных агрегатов H. dujardinii. На стадии первичных многоклеточных агрегатов апоптотирующие клетки присутствуют в небольшом количестве на поверхности агрегатов. На стадии ранних примморфов такие клетки становятся единичными, и некоторые из них лежат во внутренних частях агрегатов. Наконец, на стадии настоящих примморфов в составе агрегатов не было обнаружено апоптотирующих клеток.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".