ИСТИНА

Данный проект направлен на исследование роли Hhex в развитии ожирения и ассоциированной с ним неалкогольной жировой болезни печени (НЖБП). Ожирение является чрезвычайно распространённой медицинской проблемой современного мира и приводит к развитию сахарного диабета 2 типа (СД2) и сердечно-сосудистым патологиям. Накопление жира во внутренних органах, в первую очередь, в печени, приводит к развитию неалкогольной жировой болезни печени (НЖБП). С учётом эпидемической распространённости данных патологических состояний, изучение механизмов, лежащих в основе их возникновения, является актуальным и значимым. Hhex - важный в процессе эмбриональной дифференцировки фактор транскрипции. Во взрослом организме Hhex поддерживает дифференцированное состояние во многих органах и тканях. В процессе адипогенеза задействованы транскрипционные регуляторы, такие как PPARG, FXR, с-Myc. Эти же факторы транскрипции значимы в патогенезе НЖБП. Hhex взаимодействует с данными факторами и влияет на их активность, однако значение данных взаимодействий в контексте адипогенеза и развития НЖБП не изучены. Мы ожидаем, что Hhex важен для поддержания дифференцировки адипоцитов и гепатоцитов. Его выключение в преадипоцитах, по нашим предположениям, будет нарушать их дифференцировку, направляя адипогенез по гипертрофическому типу. Нокаут Hhex в печени на модели НЖБП у мышей будет усугублять патологический процесс, способствовать развитию инсулинорезистентности и ожирения. Значение Hhex в адипогенезе к настоящему моменту не изучено. Роль Hhex на животной модели НЖБП не установлена. С учётом имеющихся данных о значимой функции Hhex по поддержанию дифференцированного состояния в других органах (в том числе, и в поджелудочной железе), ключевом значении Hhex в закладке печени и поджелудочной железы на этапе эмбриогенеза, данных о его возможной роли в адипогенезе, а также ввиду корреляции полиморфизмов в гене Hhex с инсулинорезистентностью и СД2, изучение биологической функции Hhex на клеточных и животных моделях, воспроизводящих адипогенез и НЖБП, может способствовать разработке новых диагностических и лечебных подходов в терапии ожирения и ассоциированных с ним состояний. Сокращения: Hhex - hematopoietically-expressed homeobox – гематопоэтический гомеобоксный фактор транскрипции Hhex. PPARG - peroxisome proliferator-activated receptor gamma - гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом. FXR - farnesoid X receptor – фарнезоидный рецептор Х.

This project is intended to study the putative role of Hhex in development of obesity and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Obesity is a highly prevalent medical condition with the morbidity close to epidemic. Obesity is strongly associated with type 2 diabetes (T2D) and cardio-vascular diseases. Obesity leads to fat deposition in visceral organs, predominantly in the liver. Fatty liver (NAFLD) is associated with insulin resistance (IR) and overproduces glucose and triglycerides, thus far aggravating obesity. In accordance with growing prevalence of obesity and NAFLD the determination of mechanisms underlying these two conditions is relevant and significant. Hhex is a transcription factor very import in embryonic development. In adults Hhex maintains differentiated state of several tissue types. Transcription factors PPARG, FXR, с-Myc are involved in both adipogenesis and NAFLD. Hhex interacts with all of them but the precise consequence of these interactions in the context of adipogenesis and NAFLD are unexplored. We expect that Hhex is significant in maintenance of differentiated state of adipocytes and hepatocytes. We propose that Hhex knockout in preadipocytes would disrupt their differentiation and favor the hypertrophic type of adipogenesis, which is associated with insulin resistance. We speculate that Hhex selective knockdown in the liver of animals with NAFLD would aggravate the pathological process and dispose to IR and obesity. The significance of Hhex in adipogenesis and NAFLD is still uninvestigated. In line with known importance of Hhex in differentiation maintenance in several organs (among them pancreatic δ-cells), Hhex pivotal role in liver and pancreas development, in accordance with data on Hhex possible role in adipogenesis and due to strong correlation in Hhex gene polymorphism with IR and T2D the study of Hhex biological functions in cellular and animal models of adipogenesis and NAFLD is considered relevant and may facilitate development of new therapeutic and diagnostic approaches in the management of obesity and associated disorders.

Предполагается, что фактор транскрипции Hhex значим в процессе дифференцировки преадипоцитов, поддерживает дифференцированное состояние, обуславливает наступление дифференцировки. Возможным механизмом может быть подавление активности с-Myc или циклина D1. Также возможно, что Hhex является геном-мишенью FXR/PPARG, запускает процессы дифференцировки в преадипоцитах после активации регулирующих его активность генов. Мы ожидаем, что Hhex важен в поддержании адипогенеза и ожидаем получить результаты о том, что подавление активности Hhex и последующее прекращение дифференцировки преадипоцитов могут направлять ожирение по неблагоприятному гипертрофическому типу. Следует отметить, что роль Hhex в адипогенезе остаётся не установленной, предлагаемые подходы и методы (создание нокаутных по Hhex клеточных культур 3T3L1, СКЖТ) являются новыми и ранее не описаны. В процессе адипогенеза задействованы важные его регуляторы, такие как PPARG, FXR, с-Myc. Эти же факторы транскрипции значимы в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП). Мы предполагаем, что, аналогично функции в других органах и тканях (щитовидной железе, поджелудочной железе, органах кроветворения, молочной железе) функция Hhex в печени связана с поддержанием дифференцированного состояния. Мы ожидаем получить данные о том, что выключение Hhex в гепатоцитах на модели НАЖБП будет приводить к усугублению патологического процесса. Селективное выключение Hhex в печени ранее описано не было. К настоящему моменту нет публикаций, в которых бы исследовалась роль Hhex на животной модели НАЖБП. Таким образом, мы полагаем, что в основе ожирения и НАЖБП лежат общие дисрегуляторные механизмы. В ходе реализации проекта ожидается получить экспериментальные данные об участии Hhex в процессах адипогенеза и НАЖБП. Изучение роли Hhex как одного из возможных регуляторов на нокаутных клеточных и животных моделях является раннее не исследованным и представляется важным для разработки новых диагностических и лечебных подходов в терапии ожирения и ассоциированной с ним НАЖБП.

Работы in vitro: 1. Налажен протокол адипогенной дифференцировки для клеточных культур 3T3L1, СКЖТ (см. Файлы, Рисунок 1) 2. На клеточной линии 3T3L1 обнаружено увеличение уровня белка Нhех на 5-ые сутки после индукции адипогенной дифференцировки (см. Файлы, Рисунок 2) 3. Создана CRISPR/Cas9 конструкция, несущая gRNA к гену Нhех. С помощью данной конструкции проведена трансдукция клеточной линии 3T3L1, отобраны клоны со встроенным вектором (по маркёрному белку GFP). Полученные моноклональные линии отсеквенированы для установления успешного нокаута Нhех (см. Файлы, Рисунок 3) 4. Налажен протокол вирусной трансдукции СКЖТ (см. Файлы, Рисунок 4) 5. Налажен метод полуколичественной оценки уровня белков, в том числе Hhex (вестерн-блоттинг) (см. Файлы, Рисунок 5). 6. В распоряжении заявителей все необходимые компоненты для работы с аденовирусной системой. Работы на животных: 1. Налажена методика выделения гепатоцитов из печени мыши и ведение данной первичной культуры. 2. Разработана животная модель фиброза печени, индуцированного действием CCl4 (см. Файлы, Рисунок 6) . 3. Разработана животная модель механической желтухи, вызванной перевязкой общего желчного протока (см. Файлы, Рисунок 7). 4. Разработан протокол болюсного введения генно-терапевтических конструкций непосредственно в печень животного через нижнюю полую вену (см. Файлы, Рисунок 8).

В ходе проделанной за первый год работы нам удалось показать, что фактор транскрипции Hhex значим для адипогенной дифференицровки. На клеточной культуре мышиных преадипоцитов мы показали, что при подавлении Hhex происходит подавление адипогенеза. Эффект дозозависимый, то есть, степень подавления адипогенеза прямо пропорционально степени подавления HHex. Механизм действия Hhex связан с трансляцией или посттрансляционными модификациями ключевого фактора адипоцитарной дифференцировки, PPARG. Нам удалось показать, что при подавлении Hhex происходит подавление уровня белка PPARG, так же прямо пропорционально степени подавления Hhex. При этом уровень мРНК PPARG не изменяется относительно контроля, это значит, что регуляция транскрипции не нарушена, то есть, выше стоящие регуляторы PPARG (CEBP/beta)не контролируются Hhex.