ИСТИНА

Для исследований различных белков, способных связывать стероиды в качестве субстратов или лигандов, используются флуоресцирующие производные стероидов (ФПС), способные обратимо связываться в активном центре ферментов вследствие сходства их структур с природными субстратами белка, а также производные стероидов, содержащие группы, способные образовывать фотоинициируемые ковалентные сшивки (фотоактивируемые сшивающие (ФАС) группы). В связи с большим научно-практическим интересом к белкам, осуществляющим транспорт и метаболизм стероидов, поиск различных молекулярных зондов для исследований таких белков представляется актуальной задачей. Общей целью проекта является получение и тестирование новых фотоаффинных и флуоресцирующих производных для исследования структурно-функциональных свойств белков и биологических процессов с участием стероидов в клетках. В рамках проекта планируется осуществить дизайн структур и синтез новых флуоресцирующих и ФАС-производных. Будет проведена оценка свойств этих соединений в качестве лигандов альбумина, холестерол-гидроксилирующих цитохромов P450 CYP7А1, CYP7B1 и CYP11A1 и переносчика холестерина STARD1 с использованием докинга (аффинность, ориентация), и определены параметры связывания полученных соединений с белками CYP7B1 и STARD1 с использованием методов конкурентного титрования, флуориметрии, селективного протеолиза, хроматографии и масс-спектрометрии. Также будут синтезированы производные бордифтор-дипирометена (BODIPY)-, 7-нитробензоксадиазол (NBD)- и индол-содержащие флуоресцирующие производные и проведена оценка способности данных соединений к фотохимическим превращениям в составе белковых комплексов. В проекте будут отработаны режимы фотоактивации исследуемых соединений УФ-светом. Планируется исследовать процессы включения, внутриклеточного распределения и стабильность исследуемых соединений в клетках дрожжей и бактерий, включая клетки трансгенных штаммов, осуществляющие экспрессию цитохрома Р450 CYP11A1, оценить способность таких соединений связываться со стерол-превращающими ферментами и возможность их применения для исследований стероидогенных ферментов в живых клетках.

For studies of various proteins capable of binding steroids as substrates or ligands, fluorescent steroids derivatives (FPS) are used. They can reversibly bind in the active center of enzymes due to the similarity of their structures to natural protein substrates, as well as steroids derivatives containing groups capable of forming photo-initiating covalent crosslinks (photo-activated cross-linking (FAS) groups). Due to the great scientific and practical interest in proteins that carry transport, reception and metabolism of steroids, the search for various molecular probes for their studies seems to be an urgent task. The overall goal of the project is to obtain new photoaffine and fluorescent derivatives and study the possibility of their use for establishing the structural and functional properties of proteins and studying bioprocesses involving steroids in cells. Within the framework of the project it is planned to carry out design of structures and synthesis of new fluorescent and FAS-derivatives. The properties of these compounds as ligands of albumin, cholesterol-hydroxylating cytochromes P450 CYP7A1, CYP7B1 and CYP11A1 and cholesterol carrier STARD1 using docking (affinity, orientation) will be evaluated and binding parameters of the resulting compounds to isolated CYP7B1 and STARD1 proteins are determined using competitive titration methods, fluorimetry, selective proteolysis, chromatography and mass spectrometry. Bordipyrometene (BODIPY)-, 7-nitrobenzoxadiazole (NBD) - and indole-containing fluorescent derivatives will also be synthesized, and the ability of these compounds to be photochemically converted in protein complexes will be evaluated. In the project, the modes of photoactivation of the investigated compounds by UV light will be worked out. It is planned to investigate the processes of inclusion, intracellular distribution and stability of the test compounds in yeast and bacterial cells, including cells of transgenic strains carrying out the expression of cytochrome P450 CYP11A1, to assess their ability to bind to sterol-converting enzymes and the possibility of their application for the study of steroidogenic enzymes in living cells.