![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Проект направлен на создание научных основ замены ферментов пероксидаз в диагностике (иммуно-ферментный анализ, ДНК- (РНК-) сенсоры) и применения пероксидазной активности в терапии, используя для этих целей нанозимы «искусственная пероксидаза». Предлагается решение следующих задач: - исследование нанозимов «искусственная пероксидаза» физическими и физико-химическими методами, установление структурно-функциональных взаимосвязей; - изучение каталитических свойств и механизма действия нанозимов «искусственная пероксидаза» в реакции восстановления пероксида водорода; - синтез композитных наночастиц ядро-оболочка для стабилизации нанозимов на основе берлинской лазури оболочкой гексацианоферрата никеля; - синтез сверхмалых нанозимов с размерами на уровне ферментов (4-6 нм); - электрохимический синтез нанозимов «искусственная пероксидаза»; - осаждение нанозимов «искусственная пероксидаза» на электроды и исследование электрокаталитических и аналитических свойств полученных электродов; - синтез нанозимов с функциональными группами для создания коньюгатов с биомолекулами; - включение нанозимов «искусственная пероксидаза» в липосомы с целью создания противовоспалительных лекарств; - синтез коньюгатов нанозимов «искусственная пероксидаза» с антителами и ДНК (РНК) для иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоров; - создание с использованием нанозимов «искусственная пероксидаза» иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоров на электрохимической платформе, пригодных к использованию «у постели больного». Комплексность решаемых задач подтверждает использование разнообразных физических и физико-химических методов, а также вовлечение в проект различных областей знания: нанотехнологий (синтез и исследование наночастиц), катализа (каталитический синтез, ферменто-подобная активность наночастиц), биохимии и молекулярной биологии (синтез коньюгатов наночастиц с антителами, ДНК, РНК), аналитической химии и медицинской диагностики (иммуно-ферментные тест-системы, ДНК- и РНК-сенсоры и электроаналитические системы на их основе).
The project is aimed to develop the scientific background for substitution of natural enzymes peroxidases in diagnostics (immuno-enzyme assays, DNA- (RNA-) sensors) and for applying peroxidase activity in therapy, using for this aim nanozymes “artificial peroxidase”. Immuno- and DNA- (RNA-) sensors as well as affinity based analytical kits comprise an important part of vital activity for modern society since they are used in a variety of areas from medicine to agriculture. Hence, current project, which deals with improvement of such analytical systems and devices targets the important challenges of the modern society. For signal generation these devices use labels, among which one of the leading positions belongs to the enzyme peroxidase. Novel rapidly growing field of modern science is synthesis of nanozymes – nanoparticles with enzyme-like activity. The term “nanozyme” is apparently not more than five years old. The most progressive and actual application of nanozymes is to substitute natural enzymes in various fields of science and technology allowing to avoid the most important problems of the enzymes: their inherent instability and relatively high cost. Nanozymes obviously require advanced catalysts. International scientific priority of the Principal Investigator (leader of the proposed project) for already 25 years is the Prussian Blue based most advantageous (thousands times more active and selective than platinum) electrocatalyst for hydrogen peroxide reduction, the very reaction catalyzed by the enzyme peroxidase. The project will be based on the one of the results of the finalizing RSF grant # 16-13-00010: catalytic synthesis of Prussian Blue nanoparticles and elaboration on it basis the nanozymes “artificial peroxidase”; the corresponding article is just issued in the most prestigious chemical journal: M.A. Komkova, E.E. Karyakina, A.A. Karyakin. Journal of the American Chemical Society 140 (2018) 11302, IF = 14.3. This provides not only scientific novelty, but also an international priority of the proposed investigations. Catalytic rate constants of the nanozymes are up to 4 orders of magnitude higher as compared to the natural peroxidase. Except for the activity defeating even the natural enzyme, the advantages of the reported PB nanoparticles over the known peroxidase-like nanozymes are: (i) enzymatic specificity (an absence of oxidase-like activity) and (ii) an ability to operate in physiological solutions, similarly to the enzymes. The elaborated nanozymes do not contain noble metals, thus their cost is negligible compared to the enzymes. Nanozymes are characterized by stability peculiar to inorganic materials, which is unreachable for the enzymes. For elaboration of scientific background for substitution of natural enzymes peroxidases in diagnostics and for applying peroxidase activity in therapy the following tasks are planned:- investigation of nanozymes “artificial peroxidase” by means of physical and physico-chemical methods, a discovery of structure-function relationships; - investigation of catalytic properties of nanozymes “artificial peroxidase”, and their mechanism of action in hydrogen peroxide reduction; - synthesis of composite core-shell nanoparticles for stabilization of Prussian Blue based nanozymes with nickel hexacyanoferrate shell; - synthesis of ultra-small nanozymes with dimensions comparable to the enzymes (4-6 nm); - electrochemical synthesis of nanozymes “artificial peroxidase”; - deposition of nanozymes “artificial peroxidase” onto the electrode surfaces and investigation of electrocatalytic and analytical properties of the resulting electrodes; - synthesis of nanozymes with functional groups for covalent linking with biomolecules; - entrapment of nanozymes “artificial peroxidase” in liposomes in order to elaborate anti-inflammatory drugs; - synthesis of conjugates of nanozymes “artificial peroxidase” with antibodies, DNA (RNA) for immuno- and DNA- (RNA-) sensors; - elaboration of immuno- and DNA- (RNA-) sensors on the basis of nanozymes “artificial peroxidase” and electrochemical platforms, suitable for “point of care” diagnostics. Complexity of the proposed tasks is illustrated by using of various physical and physico-chemical methods, as well as by involvement in the project different scientific areas: nanotechnology (synthesis and investigation of nanoparticles), catalysis (catalytic synthesis, enzyme-like activity of nanoparticles), biochemistry and molecular biology (synthesis of nanoparticle conjugates with antibodies and DNA, RNA), analytical chemistry and medical diagnostics (immuno-enzyme test systems, DNA- (RNA-) sensors and electroanalytical systems on their basis).
В результате проекта будут разработаны новые методы синтеза и получены новые нанозимы «искусственная пероксидаза» на их основе: стабилизированные для функционирования в щелочных растворах, сверхмалые (сравнимые по размеру с белками), содержащие функциональные группы для ковалентной пришивки к биомолекулам. Знание механизма действия, очевидно, позволит, с одной стороны, выбрать оптимальные условия применения нанозимов, и, с другой стороны, найти пути улучшения их каталитической активности. Будут синтезированы коньюгаты нанозимов с биомолекулами: антителами и ДНК (РНК). Для целей противовоспалительной терапии будут получены липосомы, содержащие нанозимы «искусственная пероксидаза»: как обычные полученные методом каталитического синтеза, так и стабилизированные гексацианоферратом никеля композиты ядро-оболочка. Все это позволит создать в заключение проекта электрохимические иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоры и аналитические системы, пригодных к использованию «у постели больного». Оценивая значимость результатов проекта, следует отметить, что применение ферментов в анализе биологических объектов основано, как правило, на их высокой специфичности. Например, глюкозооксидаза превращает только свободную глюкозу, не окисляя ни ее изомеров, ни олиго-сахаридов на ее основе. Такой специфичности по органическому субстрату вряд ли следует ожидать от нанозимов. Что же касается использования ферментов в качестве меток, то для них наряду с высокой активностью достаточна специфичность только к окислителю, и пероксидаза – яркий тому пример. Таким образом, нанозимы «искусственная пероксидаза» являются первыми и, возможно, единственными нанозимами, востребованными для медицинской диагностики. Научная значимость проекта также определяется развитием современной и быстро растущей области: самому термину «нанозим» порядка 5-и лет. Отметим, что синтезированные в (M.A. Komkova, E.E. Karyakina, A.A. Karyakin. Journal of the American Chemical Society 140 (2018) 11302) нанозимы «искусственная пероксидаза» являются первыми наночастицами, обладающими свойствами природного фермента: каталитической активностью, даже превосходящей на несколько порядков активность пероксидазы, и присущей этому ферменту селективностью (отсутствием катализа оксидазной реакции – восстановления молекулярного кислорода). Проект является мультидисциплинарным. Его результаты также важны для нанотехнологий, биохимии и молекулярной биологии, аналитической химии и упомянутой медицинской диагностики. Общественная значимость проекта определяется, главным образом, развитием диагностических систем. Иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоры, а также аналитические наборы на основе афинных взаимодействий используются в самых различных его сферах от медицины до сельского хозяйства. Таким образом, улучшение данных аналитических систем и устройств лежит в русле развития современного общества.
25 лет назад в работах нашей научной группы был открыт гексацианоферрат железа, или берлинская лазурь, как наиболее эффективный электрокатализатор восстановления пероксида водорода. В нейтральных водных растворах, наиболее благоприятных для биоаналитических приложений, преимуществами электродов, модифицированных берлинской лазурью, по сравнению с обычно используемой платиной являются: (а) на три порядка величины более высокая каталитическая активность в реакции восстановления пероксида водорода, представленная в 1000 раз более высокой электрохимической константой скорости, а также (б) на три порядка более высокая селективность в реакции восстановления пероксида водорода по сравнению с восстановлением кислорода. Более того, как было нами недавно показано, катализ реакции восстановления пероксида водорода является эксклюзивным свойством берлинской лазури; гексацианоферраты прочих переходных металлов, в том числе и соседей железа по триаде в Периодической системе, каталитически неактивны.Двадцати пяти летний опыт работы с электрокатализатором на основе берлинской лазури, включая как создание электрохимического сенсора с рекордными аналитическими характеристиками, так и бестоковый способ модификации электродов, предопределили успех синтеза нанозимов, имитирующих пероксидазную активность. Нами предложен каталитический способ синтеза наночастиц берлинской лазури, обеспечивающий максимально возможную каталитическую активность получаемых наночастиц . Созданные нанозимы «искусственная пероксидаза» характеризуются в реакции восстановления пероксида водорода каталитической константой, до нескольких тысяч раз превосходящей каталитическую константу нативной пероксидазы. Кроме высокой каталитической активности, синтезированные наночастицы характеризуются каталитическими свойствами, присущими природным ферментам: специфичностью (отсутствием оксидазной активности – восстановления молекулярного кислорода), а также способностью функционировать в физиологических растворах.
1. Синтез новых нанозимов «искусственная пероксидаза». С целью более полного контроля свойств нанозимов на стадии производства, а также для упрощения последнего разработан электрохимический способ синтеза. Для этого разработана проточная ячейка типа wall-jet с рабочим электродом на основе графитового войлока. Наночастицы наименьшего диаметра (50-60 нм) получаются из растворов, содержащих 100-150 мМ реагентов (эквимолярная смесь Fe3+ и [Fe(CN)6]3-) при потенциалах 0.2-0.4 В (Ag|AgCl). Для всех синтезированных нанозимов каталитическая константа (kкат, см раздел 4) превышает таковую для пероксидазы (из корней хрена), а для наночастиц диаметром 200 нм kкат в 200 раз выше. Будучи простым и безреагентным, электрохимический подход также позволяет осуществлять контроль размера нанозимов на стадии синтеза, что делает его перспективным для задач биотехнологии. Синтез сверхмалых нанозимов (ø < 20 нм) проводили в системах обращенных мицелл (октан/АОТ/вода). Установлено, что синтез при степени гидратации 10 позволяет получать структуры с диаметром менее 8 нм. Рамановские спектры наночастиц подтверждают наличие структуры берлинской лазури, а также полианилина, если в качестве восстановителя использовали анилин. Промывкой удается удалить поверхностно-активное вещество (АОТ), что также подтверждено Рамановской спектроскопией. Каталитические свойства сверхмалых нанозимов (см раздел 4) исследовали в системе обращенных мицелл. Бимолекулярные константы второй, скорость лимитирующей стадии, (k2) составили 63 M−1 с−1 для пирогаллола и 0.83 M−1 с−1 для гваякола. Стабилизированные нанозимы ядро-оболочка (БЛ-NiГЦФ). С целью получения стабилизированных нанозимов ядро берлинской лазури (БЛ) покрывалось оболочкой гексацианоферрата никеля (NiГЦФ). NiГЦФ наносили на каталитически синтезированные наночастицы БЛ (ø = 37 нм) из растворов, содержащих ионы никеля (Ni2+) и феррицианида ([Fe(CN)6]3‒). Для стабилизации оболочки дополнительно использовали гексаметафосфат натрия. Нанозимы БЛ-NiГЦФ значительно превосходят по активности фермент пероксидазу. Так для нанозимов диаметром 66 нм кажущиеся каталитические константы скорости для пирогаллола и ферроцианида превышают kкат пероксидазы в 25 и 35 раз, соответственно. После полугодового хранения в водной суспензии при комнатной температуре нанозимы БЛ-NiГЦФ сохраняют, как свой размер, так и физико-химические свойства: каталитические, электрохимические. В связи с перспективами применения нанозимов «искусственная пероксидаза» в противовоспалительных лекарствах исследовалась их стабильность в физиологических рН. Константа инактивации (по оптической плотности при 700 нм: БЛ) для нанозимов ядро-оболочка БЛ-NiГЦФ (ø=114 нм) в 16 раз меньше, чем для наночастиц БЛ. При этом оболочки NiГЦФ вызывают не более чем двукратное понижение каталитической активности. Будучи иммобилизованными на электроде (см раздел 3), нанозимы ядро-оболочка БЛ-NiГЦФ (ø = 45 нм) составляли основу сенсора на пероксид водорода, чувствительность которого была такой же, как и для сенсора с использованием чистой берлинской лазури. Однако в то время как отклик последнего в жестких условиях (25 минут в 1 мМ H2O2) падал до 7.5%, сенсор на основе нанозимов БЛ-NiГЦФ сохранял более 75% своей начальной чувствительности. Таким образом, нанозимы ядро-оболочка БЛ-NiГЦФ призваны открыть новые горизонты при разработке как противовоспалительных лекарств, так и биосенсоров. 2. Исследование полученных нанозимов физическими и физико-химическими методами. Фазовый состав каталитически синтезированных наночастиц на основе берлинской лазури подтвержден методами рентгенофазового анализа, мессбауэровской спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Гранулометрический анализ наночастиц берлинской лазури осуществлен методами динамического светорассеяния, растровой электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, полученные результаты согласуются. Коэффициент экстинкции наночастиц БЛ определен методами спектроскопии и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП МС). Фазовый состав наночастиц ядро-оболочка БЛ-NiГЦФ исследовали методом ИСП МС. Энергодисперсионная рентгеновская микроскопия применялась для доказательства обогащения оболочки атомами Ni. Электрохимические методы включали циклическую вольтамперометрию и хроноамперометрию. 3.Осаждение нанозимов «искусственная пероксидаза» на электроды; свойства полученных (био)сенсоров. Результатом нанесения суспензии нанозимов на поверхность с последующим высушиванием являются электроды, модифицированные берлинской лазурью, с высокой электрохимической и электрокаталитической активностью, что существенно упрощает приготовление последних. Доля электроактивного материала не зависит от поверхностной концентрации берлинской лазури, а определяется размером частиц, падая с ростом диаметра и асимптотически приближаясь к 25%. Морфология поверхности сенсоров на основе наночастиц берлинской лазури (БЛ) позволяет достичь чувствительности по отношению к Н2О2 (0.85±0.05 А·М-1·см-2), на 30 % превосходящей таковую для сенсоров на основе пленок БЛ. Время единичного измерения с помощью таких сенсоров и биосенсоров не превышает 10 с, а линейный диапазон определяемых концентраций H2O2 охватывает 4 порядка величины: от 2·10-7 М до 1·10-3 М. Путем послойной иммобилизации нанозимов «искусственная пероксидаза» и ферментов на поверхности электрода созданы биосенсоры типа «энзим-нанозим». Система «энзим-нанозим» по всем параметрам превосходит известные биферментные датчики на основе фермента пероксидазы. Биосенсоры «энзим-нанозим» являются более чувствительными, чем биосенсоры на основе пленок БЛ, за счет высокой площади поверхности слоя иммобилизованных нанозимов. Так коэффициент чувствительности биосенсора на лактат в периодическом режиме тестирования составляет 210±20 мА·М-1·см-2, что в 2 раза выше чувствительности аналогичного биосенсора, модифицированного пленкой БЛ. 4. Кинетика и механизм действия нанозимов «искусственная пероксидаза». Для исследования механизма действия нанозимов впервые был применен подход ферментативной кинетики. Зависимость начальной скорости каталитической реакции от концентрации субстратов практически всегда имеет вид функции Михаэлиса, кроме линейной зависимости от концентрации H2O2 для тетраметилбензидина (ТМБ). Последняя объясняется более высокой скоростью диссоциации ТМБ из-за высокого редокс потенциала. Полная кинетическая кривая линеаризуется в координатах Уокера-Шмидта. Интегральная кинетика указывает на замедленный выброс продукта. Кинетический анализ также учитывает, что редокс состояние берлинская лазурь неактивно ни в окислении, ни в восстановлении H2O2. Таким образом, кинетический механизм действия нанозимов состоит из стадий: присоединения восстанавливающего субстрата, окисления полученного комплекса пероксидом водорода (необратимая каталитическая стадия) и выброса окисленной формы восстанавливающего субстрата. Каталитические константы скорости для низкопотенциальных субстратов катехола, пирогаллола и ферроцианида калия составляют 2.6±0.1∙107 М-1с-1, 1.3±0.1∙108 М-1с-1 и 1.9±0.1∙108 М-1с-1, соответственно, и превосходят константу скорости взаимодействия активного центра пероксидаз с H2O2: (1–2)∙107 М-1с-1. Однако для пероксидаз скорость-лимитирующей является реакция Соединения II с электрон-донорными субстратами, протекающая, как минимум, на порядок медленнее. Таким образом, скорость-лимитирующая стадия реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами, как минимум в 100 раз превосходит таковую для реакции с участием пероксидаз. Кинетический анализ также позволяет оценить константу скорости присоединения субстрата на первой стадии (k1). В случае ТМБ k1>3‧109 М-1с-1, что также на два порядка выше, чем для пероксидаз. Таким образом, выявлено новое преимущество нанозимов по сравнению с ферментами: повышенные на два порядка бимолекулярные константы скорости, - что может быть связано с равнодоступной поверхностью нанозимов, исключая влияние ориентации на диффузионно-контролируемые процессы. 5. Органические пероксиды как субстраты нанозимов. Каталитическая активность нанозимов снижается в ряду пероксидов: пероксид водорода – пероксид мочевины – пероксид метилэтилкетона – трет-бутилгидропероксид – гидропероксид кумола. Установлено, что для небольших по размеру пероксидов каталитическая реакция имеет место по всему объему наночастиц, восстановление пространственно разветвленных пероксидов протекает только на поверхности нанозимов. Также установлено, что нанозимы не только каталитически активнее пероксидазы из корней хрена, но и более селективны к пероксиду водорода. Так для наночастиц (ø = 68 нм) коэффициенты селективности превышают таковые для пероксидазы хрена до 4 раз. 6. Синтез и исследование свойств гибридных наночастиц нанозим-миРНК, включенных в липосомы. С целью создания противоопухолевых лекарств терапии двойного действия показана возможность совместного включения каталитически синтезированных нанозимов различного размера и миРНК в липидные частицы (подтверждено методом электронной криомикроскопии). При этом нанозимы даже в высокой концентрации (до 0.1 мМ БЛ) не влияют на митохондриальную активность клеток и не цитотоксичны. Методом проточной цитометрии показано вызванное нанозимами значительное (на 70 %) снижение уровня активных форм кислорода, подтверждая, таким образом, противовоспалительную активность. 7. Электроаналитические системы на основе ДНК(РНК)-сенсоров/иммуносенсоров с использованием биоконъюгатов нанозим-олигонуклеотид/нанозим-антитело. С целью функционализации нанозимов при синтезе в качестве восстановителей смеси соли железа (III) и феррицианида использовали азидометил-этилендиокситиофен (ЭДОТ), анилин, антраниловую кислоту. Наличие азидо-, амино- и карбоксильной функциональностей подтверждали Рамановской спектроскопией. Нанозимы с азидо-группами коньюгировали с олигонуклеотидами клик-реакцией, биоконьюгацию наночастиц БЛ с антителами проводили с использованием дициклогексилкарбодиимида. Электроды модифицировали электрополимеризацией азидометил-ЭДОТ. Показано, что полимерное покрытие, с одной стороны, снижает неспецифическую сорбцию, и, с другой стороны, существенно повышает скорость электрохимических реакций известных медиаторов. Отклик ДНК- и иммуно- сенсоров регистрировался, соответственно, по прямому и медиаторному электрокатализу восстановления Н2О2 меткой (нанозимом). Минимальная детектируемая концентрация меченых олигонуклеотидов HULC составила 0.1 нМ, что достаточно для создания реальных ДНК-сенсоров. Работа таких сенсоров, как предполагается, будет основана на гибридизации поверхностно иммобилизованного и коньюгированного с нанозимом олигонуклеотидов с разными участками ДНК-мишени, таким образом, приводя к иммобилизации метки на электроде. Перспективы создания реальных иммуно-сенсоров обусловлены наблюдаемым повышением чувствительности соответствующего пероксидного сенсора в 20 раз в ответ на специфическое связывание. 8. Подготовка обзоров, чтение пленарных лекций. По материалам проекта подготовлены к публикации глава в издании Comprehensive Inorganic Chemistry III (Elsevier) и обзорная статья для журнала Microchimica Acta (IF = 5.83, Q1). Оба обзора находятся в печати. Руководитель проекта выступил с пленарными лекциями на престижных международных конференциях. 9. Публикации в высокорейтинговых журналах. По результатам проекта опубликовано 11 статей в журналах Q1: Analytical Chemistry (IF=6.976, Nature Index), Journal of Physical Chemistry Letters (2) (IF=6.475, Nature Index), Current Opinion in Electrochemistry (IF=7.271). Electrochimica Acta (IF=6.9), Talanta (2) (IF=6.057), Electrochemistry Communications (IF=4.724), ChemElectroChem (IF=4.59), Journal of Electroanalytical Chemistry (IF=4.464), Dalton Transactions (IF=4.39). 10. Участие в научных конференциях. Участники проекта выступили с докладами на 14 Международных и 1 Всероссийской конференциях. Сделано 3 пленарных, 1 приглашенный, 15 устных и 17 стендовых докладов. 11. Участие студентов в научных конкурсах. Исполнители проекта получили награды за победы в научных конкурсах. 12. Защита диссертаций, курсовых и дипломных работ на химическом факультете МГУ Под руководством участников научного коллектива защищены: одна диссертация на соискание ученой степени кандидата наук (02.00.02 – аналитическая химия), 9 дипломных работ, из них 4 особо отмечены Аттестационной комиссией, 25 курсовых работ.
ЭЛТА | Соисполнитель |
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 9 апреля 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Нанозимы искусственная пероксидаза для медицинской диагностики и терапии |
Результаты этапа: 1. Изучение каталитических свойств и механизма действия нанозимов на основе берлинской лазури. Для изучения механизма действия нанозимов был применен формально-кинетический подход, принятый в ферментативной кинетике. За реакцией восстановления пероксида водорода, катализируемого нанозимами, следили по изменению концентрации восстановленной формы второго субстрата (или накоплению его окисленной формы) спектрофотометрически. Кинетика реакции восстановления Н2O2, катализируемой синтезированными нанозимами на основе берлинской лазури исследована в присутствии наиболее используемых субстратов пероксидазы из корней хрена. Механизм восстановления пероксида водорода нанозимами на основе берлинской лазури описывается двустадийной схемой. При этом первой является обратимая стадия взаимодействия нанозимов с восстанавливающим субстратом, которая протекает по бимолекулярному механизму без образования комплекса, а окисление берлинского белого пероксидом водорода на второй стадии протекает необратимо. Соотношение прямой и обратной констант первой стадии определяется разностью потенциалов медиатора и берлинской лазури (PB|PW). Таким образом, нанозимы на основе берлинской лазури являются низкопотенциальной «искусственной пероксидазой» (≈0.15 В, Ag|AgCl), вплоть до 200 раз превосходящей по каталитической константе природный фермент даже в присутствии высокопотенциальных восстановителей, например, тетраметилбензидина. Статья подготовлена к печати. 2. Стабилизация нанозимов: синтез композитных наночастиц ядро-оболочка с ядром из каталитического материала (гексацианоферрат железа) и стабилизирующей оболочкой (гексацианоферрат никеля); Разработан протокол синтеза стабилизированных наночастиц берлинской лазури: применен подхода ядро-оболочка (ядро из каталитического материала – берлинская лазурь, оболочка – гексацианоферрат никеля, изоструктурный берлинской лазури, но более стабильный механически и химически). Исследована зависимость размера получаемых наночастиц от концентрации солей (хлорида никеля и гексацианоферрата железа) в растворе для синтеза. С увеличением концентрации солей в реакционной смеси диаметр полученных наночастиц возрастает. Размеры наночастиц, определенные с помощью метода динамического светорассеяния, составили от 40-50 нм до >100 нм. Стабильность наночастиц в нейтральной среде (pH 7.4), охарактеризованная константой инактивации, повышена на порядок. Путем модификации поверхности рабочего электрода наночастицами берлинской лазури и композитными наночастицами берлинская лазурь – гексацианоферрат никеля разработаны сенсоры на пероксид водорода, определена чувствительность и операционная стабильность датчиков. Эти исследования будут продолжены на 2 году выполнения проекта. 3. Синтез сверхмалых нанозимов «искусственная пероксидаза» с размерами на уровне размеров ферментов (4-6 нм); Осуществлен синтез наночастиц берлинской лазури размером 4-5 нм в трехфазных системах вода/октан/ПАВ путем восстановления смеси ферроцианида и хлорида железа (III) с использованием анилина в качестве восстановителя. Получено распределение ультрамалых наночастиц берлинской лазури частиц по размерам методами динамического светорассеяния и электронной микроскопии. Средний размер частиц составил 4.7±0.3 и 4.4 нм соответственно. Ультрамалые наночастицы БЛ выделены из обращенных мицелл и стабилизированы в водном фосфатно-цитратном буферном растворе (рН 5.0) путем включения в мицеллы Triton X-100. Исследована каталитическая активность ультрамалых наночастиц берлинской лазури, получены kcat/KM 0.36*10-3 с-1M-1 по ТМБ и kcat/KM 0.65 с-1M-1 по H2O2. Работы будут продолжены на втором году выполнения проекта. 4. Электрохимический синтез нанозимов «искусственная пероксидаза» с ис- пользованием проточных электродов. Для регулируемого электрохимического синтеза нанозимов на основе берлинской лазури разработана проточная ячейка типа wall-jet с возможностью интеграции сменных электродов на основе графитового войлока. Показана возможность потенциостатического синтеза наночастиц берлинской лазури в разработанной проточной системе, при этом размер частиц регулируется задаваемым потенциалом. Возможность синтеза наночастиц электрохимически позволяет достичь большей воспроизводимости свойств материала, чем в случае химического осаждения. С другой стороны, такой подход масштабируем и пригоден для массового производства препаратов электроактивных наночастиц. Электрохимически синтезированные наночастицы берлинской лазури имеют узкое распределение по размерам. Для всех синтезированных образцов каталитическая активность в реакции восстановления Н2O2 в присутствии тетраметилбензидина превосходит таковую для фермента пероксидазы из корней хрена. Для частиц с диаметром 135 нм kкат составляет ≈ 7500 с-1, что в 35 раз выше, чем для пероксидазы. 5. Осаждение нанозимов «искусственная пероксидаза» на электроды для изучения их электрокаталитических свойств в сравнении с обычными электродами, модифицированными берлинской лазурью 5.1.-5.4. Сенсоры на пероксид водорода. Стабилизированные лактатные биосенсоры на основе смешанных и композитных мембран силоксан-ПФС. Покрытия на основе иммобилизованных нанозимов на основе берлинской лазури обладают высокой электроактивностью. В редокс-процессе задействована вся толщина покрытия, при этом доля электроактивного материала определяется размером частиц, при увеличении последнего доля экспоненциально приближается к 25%. Предложенный способ иммобилизации нанозимов на поверхности электрода прост, позволяет контролировать размер наносимых частиц и, как результат, плотность и морфологию электроактивного покрытия. Развитая морфология поверхности сенсоров на основе наночастиц берлинской лазури позволяет достичь чувствительности по отношению к Н2О2, на 30 % превосходящей таковую для сенсоров на основе пленок БЛ (0.85 A·M-1·cm-2). Операционная стабильность электрокаталитического слоя на основе нанозимов не уступает таковой для сплошной пленки или даже несколько выше при функционировании в составе биосенсора для определения лактата: 90% первоначального отклика такого слоя на 0.1 мМ Н2О2 сохраняется в течение около 1.5 ч. Коэффициент чувствительности сенсоров на пероксид водорода на основе иммобилизованных нанозимов берлинская лазурь составил 0.85±0.05 А·М-1·см-2 (n=3, P=0.95), тогда как для сенсора на основе пленки берлинской лазури – на 30% ниже. Такое увеличение чувствительности, вероятно, связано с более развитой морфологией поверхности сенсора на основе НЧ БЛ. Время единичного измерения с помощью таких сенсоров и биосенсоров не превышает 10 с, а линейный диапазон определяемых концентраций H2O2 охватывает 4 порядка величины: от 2·10-7 до 1·10-3 М. Коэффициент чувствительности биосенсора на лактат в периодическом режиме тестирования, составляет 210 ± 20 мА·М-1·см-2, что в 2 раза выше чувствительности аналогичного биосенсора, модифицированного пленкой БЛ. Наибольшая операционная стабильность была зарегистрирована для биосенсоров, с мембраной из смеси 1.5% γ-аминопропилтриэтоксисилана и 0.2% ПФС. Операционная стабильность биосенсора с точки зрения количества инъекций лактата при сохранении > 95% активности (> 80) почти в 3 раза выше, чем для биосенсора, изготовленного без добавления ПФС, и соответствует требованиям для применения в клинических анализаторах. При этом чувствительность снижается только на 35%. Результаты работы опубликованы: Vokhmyanina Darya V., Andreeva Ksenia D., Komkova Maria A., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A.‘Artificial peroxidase’ nanozyme – enzyme based lactate biosensor. Talanta, 2020, 208, 120393 DOI: 10.1016/j.talanta.2019.120393 Биосенсоры также были апробированы в качестве картриджа для прототипа серийного анализатора лактата в крови производства ЗАО «ЮНИМЕД». 6. Исследование наночастиц «искусственная пероксидаза» физическими и физико-химическими методами. Фазовый состав каталитически синтезированных наночастиц на основе берлинской лазури подтвержден методами рентгенофазового анализа, мессбауэровской спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Установлено, что катализатор, синтезируемый в присутствии ряда органических мономеров, представляет собой композит берлинская лазурь/проводящий полимер. Гранулометрический анализ наночастиц берлинской лазури осуществлен методами динамического светорассеяния, растровой электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, полученные результаты согласуются. Частицы берлинской лазури имеют субмикро- и наноразмеры, а их диаметр можно контролировать на стадии синтеза. Гидратный состав НЧ БЛ установлен методом термогравиметрии. Высокий коэффициент экстинкции ε=4.85·104 М-1·см-1 наночастиц БЛ (определен методами спектроскопии и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой) позволяет рассматривать их в качестве потенциально применимых колориметрических меток для создания ДНК-/РНК-биосенсоров. 7.Аналитический обзор литературных источников; По материалам выполняемого проекта и проекта РНФ, успешно завершенного в 2018 году, и также основанного на применении электрокатализатора на основе Берлинской лазури, была подготовлена заявка на конкурс РФФИ “ Экспансия “ для написания обзорной статьи по материалам грантов РНФ. Заявка не получила поддержку Фонда РФФИ. Однако Авторы подают аналогичную заявку на написание обзора литературы по теме “Берлинская лазурь: от высокоэффективного электрокатализатора восстановления пероксида водорода до нанозимов, побеждающих природный фермент пероксидазу” в редакцию журнала Успехи химии для публикации в 2020-21 гг. 8. Дополнительно к заявленному Плану работ на 1 год проекта разработан амперометрический способ детекции неэлектроактивных ионов и молекул, альтернативный классической потенциометрии. Поскольку берлинская лазурь представляет собой ред-окс активный материал, обменивающийся катионами с раствором для компенсации заряда, ее целесообразно использовать в качестве сенсора на катионы щелочных металлов. Для детекции неэлектроактивных ионов в качестве альтернативы традиционной потенциометрии предложена амперометрия в проточно-инжекционном режиме. Отклик сенсора представляет собой пару разнонаправленных пиков (катодный и анодный) в проточно-инжекционном режиме и один пик в режиме постоянного потока аналита. Сравнение характеристик показало, что проточно-инжекционном режиме аналитически значимым является первый пик. По своим аналитическим характеристикам амперометрические сенсоры превосходят потенциометрические: соотношение сигнал-шум повышается в 20-25 раз. Результаты исследования опубликованы: Zavolskova Marina D., Nikitina Vita N., Maksimova Ekaterina D., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A. Constant Potential Amperometric Flow-Injection Analysis of Ions and Neutral Molecules Transduced by Electroactive (Conductive) Polymers Analytical Chemistry, 2019, 91, № 12, 7495-7499 DOI 10.1021/acs.analchem.9b00934 9. Патентный поиск и подготовка патента. Подача патентов по материалам работы перенесена на 2-3 годы выполнения проекта. 10. Подготовка публикаций в высокорейтинговых журналах. Опубликовано и подготовлено к публикации 5 статей в журналах Q1. 2 статьи опубликованы, 2 статьи находится в печати (Journal of the Electroanalytical Chemistry и ChemElectroChem) и 1 статья подготовлена к печати. 11. защита кандидатской диссертации. Награды и премии. Подготовлена к защите и защищена кандидатская диссертация аспирантки Карповой Е.В. (защита 18 декабря 2019 г.). В материалах диссертации использованы данные о модификации электродов нанозимами БЛ. Участники работ по гранту, в том числе молодые ученые и студенты 2-5 курсов, приняли участие в 5 конференциях и школах в РФ и за рубежом, также в конкурсах и выставках, отмечены премиями и стипендиями. Карпова Е.В. и Комкова М.А. стали лауреатами стипендии Президента Российской Федерации молодым ученым и аспирантам. Карякин А.А., Комкова М.А. и Карякина Е.Е. –победители Конкурса работ, способствующих решению задач Программы развития Московского университета (раздел выдающиеся научные публикации)– 2019. | ||
2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Синтез нанозимов с функциональными группами и конъюгатов с биомолекулами |
Результаты этапа: 1. Скриннинг органических соединений как восстановителей смеси соли железа (III) и феррицианида для синтеза нанозимов. Синтез нанозимов за счет восстановления смеси соли железа (III) и феррицианида органическими соединениями. Был осуществлен синтез наночастиц с использованием в качестве восстановителей для смеси соли железа (III) и феррицианида предшественников проводящих полимеров: пиррола, анилина, тиофена, а также их производных. Включение проводящего полимера в состав наночастиц берлинской лазури, помимо функционализации, приводит к стабилизации катализатора. Наибольшую операционную стабильность, заметно превосходящую таковую не только для нефункционализированных наночастиц, но и для пленок берлинской лазури, демонстрируют нанозимы на основе самодопированного полианилина (полимера 3-аминофенилборной кислоты). Одной из наиболее удобных функциональных групп для последующей конъюгации с биомолекулами является азид (клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения). Для функционализации азидо-группами осуществлен синтез нанозимов с использованием азидометил-ЭДОТа (азидометил-этилендиокситиофена) в качестве восстановителя феррицианида железа (III). Функционализация наночастиц подтверждена методом рамановской спектроскопии. 2. Заключительная оптимизация методов синтеза нанозимов, разрабатываемых в течение первого года проекта (электрохимический, ядро-оболочка, сверхмалых нанозимов). 2.1. Проведена заключительная оптимизация условий электрохимического синтеза нанозимов «искусственная пероксидаза». Размер наночастиц, синтезируемых в проточной ячейке типа wall-jet с интегрированным электродом на основе углеродного волокна, определяется в основном концентрацией реагентов и восстановительным потенциалом. При этом увеличение концентрации солей и снижение потенциала приводят к уменьшению диаметра наночастиц (до 50-60 нм). Заключительная оптимизация условий электрохимического синтеза позволила синтезировать нанозимы с каталитической константой, до 200 раз превосходящей kкат для пероксидазы из корней хрена. Будучи простым и безреагентным, электрохимический подход также позволяет осуществлять контроль размера нанозимов на стадии синтеза, что делает его перспективным для задач биотехнологии. 2.2. Стабилизированные нанозимы ядро-оболочка были синтезированы путем экспонирования наночастиц берлинской лазури (БЛ) в растворы, содержащие ионы никеля (Ni2+) и ферроцианида ([Fe(CN)6]3‒) для покрытия гексацианоферратом никеля (NiГЦФ). В качестве стабилизатора получаемых наночастиц использовали гексаметафосфат натрия. Стабильность нанозимов ядро-оболочка в нейтральных pH, характеризуемую оптической плотностью при 700 нм (берлинская лазурь), судя по константе инактивации, удалось повысить почти на порядок, в частности, для частиц диаметром ≈120 нм kin (БЛ) = 2.4∙10-3 с-1, kin (БЛ-NiГЦФ) = 3.1∙10-4 с-1. Сенсоры на пероксид водорода (методика их создания на основе наночастиц разработана в течение первого года выполнения проекта) в случае использования нанозимов ядро-оболочка также характеризуются значительно более высокой операционной стабильностью. Так в жестких условиях мониторирования 1 мМ пероксида водорода для сенсоров на основе наночастиц БЛ-NiГЦФ время полуинактивации в 3 раза выше, а константа инактивации в 5 раз ниже, чем для сенсоров на основе наночастиц берлинской лазури. 2.3 Проведена оптимизация условий синтеза сверхмалых нанозимов на основе берлинской лазури в системах обращенных мицелл (октан/АОТ/вода). Синтез проводили каталитическим способом: к мицеллярной смеси, содержащей соли гексацианоферрата железа (III) и хлорида железа (III), добавляли мицеллярный раствор восстановителя – анилина. Методом динамического светорассеяния определен средний диаметр наночастиц в мицеллярной среде: 4.7±0.5 нм, что подтверждено просвечивающей электронной микроскопией. Получить нанозимы сверхмалых размеров (7 нм) в водном растворе возможно после однократного осаждения ацетоном из мицеллярной системы и ресуспендирования в фосфатно-цитратном буферном растворе при рН 5.0. 3. Исследование полученных нанозимов физическими и физико-химическими методами. Фазовый состав наночастиц берлинской лазури, стабилизированных гексацианоферратом никеля (частицы типа «ядро-оболочка»), исследовали методом ИСП МС. Для образцов с высоким содержанием ГЦФ никеля соотношение Fe:Ni стремится к 1. Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии, образцы с высоким и низким содержанием гексацианоферрата никеля состоят из слабокристаллических зерен со средним размером 7-20 нм. Для обоих образцов зерна агрегированы в более крупные частицы размером 40-150 нм. Согласно данным локального рентгеноспектрального анализа, соотношение Fe и Ni для стабилизированных наночастиц с d = 40 нм составляет около 13, для наночастиц с d = 115 нм – около 3. Предположительно синтез наночастиц типа «ядро-оболочка» протекает как путем адсорбции ГЦФ никеля на поверхности наночастицы БЛ, так и путем агрегации с коллоидными частицами ГЦФ никеля, образующимися в реакционной смеси. Наночастицы большого диаметра с высоким содержанием ГЦФ никеля представляют собой агломераты наночастиц берлинской лазури, покрытых тонким слоем ГЦФ никеля, и наночастиц ГЦФ никеля. 4. Исследование каталитических свойств полученных нанозимов. Зависимость начальной скорости каталитической реакции от концентрации субстратов практически всегда имеет вид функции Михаэлиса. Интегральная кинетика указывает на замедленный выброс продукта (окисленной формы восстанавливающего субстрата). Кинетический механизм действия нанозимов состоит из стадий: присоединения восстанавливающего субстрата, окисления полученного комплекса пероксидом водорода (необратимая каталитическая стадия) и выброса окисленной формы восстанавливающего субстрата. Каталитические константы скорости для низкопотенциальных субстратов катехола, пирогаллола и ферроцианида калия составляют 2.6±0.1∙107 М-1с-1, 1.3±0.1∙108 М-1с-1 и 1.9±0.1∙108 М-1с-1, соответственно, и превосходят константу скорости взаимодействия активного центра пероксидаз с H2O2: (1–2)∙107 М-1с-1. Однако для пероксидаз скорость-лимитирующей является реакция Соединения II с электрон-донорными субстратами, протекающая, как минимум, на порядок медленнее. Таким образом, скорость-лимитирующая стадия реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами, как минимум в 100 раз превосходит таковую для реакции с участием пероксидаз. Для нанозимов типа «ядро-оболочка» каталитическая константа примерно в 2-2.5 раза ниже. Однако в нейтральных растворах ее значение для нестабилизированных наночастиц уменьшается на 50 % за 5 часов, в то время как нанозимы «ядро-оболочка» сохраняют до 80% ее величины в течение 50 часов. 5. Исследование органических пероксидов как субстратов нанозимов «искусственная пероксидаза». Каталитическая активность НЧ БЛ снижается в ряду пероксидов: пероксид водорода – пероксид мочевины – пероксид метилэтилкетона – трет-бутилгидропероксид – гидропероксид кумола. Установлено, что для небольших по размеру пероксидов (пероксиды водорода и мочевины) каталитическая реакция имеет место по всему объему наночастиц, восстановление больших пероксидов (трет-бутилгидропероксид, гидропероксид кумола) протекает только на поверхности нанозимов. Также установлено, что нанозимы не только каталитически активнее пероксидазы из корней хрена, но и более селективны к пероксиду водорода. Так для наночастиц (dср = 68 нм) коэффициенты селективности превышают таковые для пероксидазы хрена до 4 раз. Разрабатываемые нанозимы, таким образом, могут применяться в системах бесферментного определения пероксидов и биохимическом анализе. 6. Включение нанозимов «искусственная пероксидаза» в липосомы с целью создания противовоспалительных лекарств. Показана принципиальная возможность совместного включения каталитически синтезированных наночастиц БЛ (d = 50 нм) и миРНК в липосомы. Согласно данным динамического светорассеяния, диаметр гибридных наночастиц составляет около 100 нм. Включение наночастиц в липидный слой незначительно блокирует транспорт веществ, а каталитическая активность меняется не более чем на 30 %. Установлено, что каталитически синтезированные наночастицы БЛ, а также частицы типа «ядро-оболочка» на основе БЛ, стабилизированной гексацианоферратом никеля, не цитотоксичны. Проведены предварительные эксперименты, подтверждающие возможность аккумуляции наночастиц в клетках (AML12) и снижения таким образом уровня активных форм кислорода. 7. Синтез конъюгатов нанозимов с ДНК. С целью создания безреагентных электрохимических ДНК/РНК-сенсоров предложено использовать наночастицы берлинской лазури, функционализированные азидо-группами, позвляющими осуществить биоконъюгацию клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения. На примере фрагмента гена HULC с использованием флуоресцентных меток установлено, что в полученных конъюгатах на один нанозим приходится в среднем 10-15 олигонуклеотидных фрагментов. Дзета-потенциалы нанозимов подтверждают протекание процесса биоконъюгации. Получены биоконъюгаты с различной удаленностью каталитической метки «искусственная пероксидаза» от 5′ конца (от 5 до 70 нуклеотидов). Показано, что электроактивность нанозимов в составе биоконъюгатов сохраняется. Таким образом, заложены основы использования нанозимов «искусственная пероксидаза» в качестве редокс/электрокаталитических меток. 8. Подготовка обзорной научной статьи. Исполнителями проекта получено приглашение подготовить к публикации главу в издании Comprehensive Inorganic Chemistry III (Elsevier). 9. Патентный поиск и подготовка патента. Получен патент на изобретение «Биосенсор на основе мембран полиалкоксисилана с повышенным коэффициентом чувствительности», 2 731 411, 2 сентября 2020 г. 10. Подготовка публикаций в высокорейтинговых журналах. На втором этапе настоящего проекта опубликовано 4 статьи в журналах Q1. Подготовлены к публикации 3 статьи: по механизму действия нанозимов, по электрохимическому синтезу нанозимов и по суперстабильным нанозимам «ядро-оболочка». 11. Участие в научных конференциях. Результаты работ по проекту представлены на трех Международных и Всероссийских научных конференциях, в том числе 71st Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry (Белград, Сербия). Конференции ESEAC-20 и Фрумкинский Симпозиум, указанные в плане, перенесены на 2021 год из-за коронавируса. 12. Участие студентов в научных конкурсах. Исполнители проекта получили награды за победы в научных конкурсах. | ||
3 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Синтез нанозимов с функциональными группами и конъюгатов с биомолекулами |
Результаты этапа: 1. Исследование физико-химических и каталитических свойств сверхмалых нанозимов. Проведено всестороннее исследование сверхмалых нанозимов (d = 4-5 нм), синтезированных каталитически в обращенных мицеллах в течение предыдущих этапов проекта, физико-химическими методами (оптическими, электрохимическими). Установлено, что синтез нанозимов в системе обращенных мицелл при степени гидратации 10 позволяет получать структуры с диаметром менее 8 нм. На рамановском спектре нанозимов, синтезированных в обращенных мицеллах, наблюдаются пики соответствующие колебаниям характеристических групп в структуре берлинской лазури (БЛ). Уширенный пик при 1500 см-1 на спектре композитных наночастиц БЛ-полианилин следует отнести к структуре последнего. При этом колебания, соответствующие поверхностно-активному веществу (ПАВ), отсутствуют, свидетельствуя о полном удалении ПАВ при отмывке нанозимов. Сверхмалые нанозимы иммобилизовали на поверхности электрода путем адсорбции. На циклических вольтамперограммах наблюдается пара пиков при потенциале 0.12 В (отн. ХСЭ), соответствующая редокс-переходу берлинская лазурь/берлинский белый. Электроды с иммобилизованными сверхмалыми нанозимами были протестированы в режиме амперометрической детекции пероксида водорода. Малый размер частиц катализатора обеспечивает высокую чувствительность детекции Н2О2 – (0.74 ± 0.09 А∙М-1∙см-2). Каталитические свойства сверхмалых нанозимов на основе берлинской лазури исследовали в системе обращенных мицелл. Показано, что зависимость начальной скорости реакции восстановления пероксида водорода от степени гидратации имеет максимум в диапазоне последней от 7 до 10, что соответствует условиям синтеза нанозимов. Начальная скорость реакции имеет гиперболическую зависимость от концентрации восстанавливающего субстрата (пирогаллол, гваякол), типичную для ферментативной кинетики. Найденные из этих зависимостей каталитические константы, в свою очередь, линейно зависят от концентрации пероксида водорода. Из тангенса угла наклона полученных линейных зависимостей представляется возможным определить бимолекулярную константу второй, скорость лимитирующей стадии (k2). Константы скорости k2 составили 63 M−1 с−1 для пирогаллола и 0.83 M−1 с−1 для гваякола. Для сверхмалых нанозимов, синтезированных в мицеллах, тангенс угла наклона зависимости наблюдаемой каталитической константы от диаметра наночастиц в билогарифмических координатах составил 2.6, что свидетельствует о протекании катализа не только на поверхности, но также в объеме частицы. Значения констант, полученных для нанозимов, как в водной, так и в мицеллярной системах, принадлежат одной зависимости. Таким образом, каталитические свойства сверхмалых нанозимов типичны для каталитически синтезированных наночастиц на основе берлинской лазури. 2. Исследование свойств гибридных наночастиц нанозим-миРНК, включенных в липосомы, для снижения активных форм кислорода в клетках. В течение заключительного этапа проекта продолжены работы, направленные на разработку противоопухолевых лекарств. Присутствие берлинской лазури в составе гибридных наночастиц призвано обеспечить снижение уровня активных форм кислорода (АФК) в поврежденных клетках, а также способствовать повышению эффективности РНК интерференции, защищая миРНК от деградации. Установлено, что наночастицы на основе БЛ могут накапливаться в клетках гепатоцитов мыши (AML12). При этом нанозимы даже в высокой концентрации (до 100 мкМ БЛ) не оказывают влияния на митохондриальную активность клеток и не цитотоксичны. Методом проточной цитометрии с использованием красителя дихлорфлуоресцеина показано, что при введении нанозимов в культуру клеток наблюдается значительное (на 70 %) снижение уровня АФК. Показана принципиальная возможность совместного включения каталитически синтезированных нанозимов различного размера (30 нм и 120 нм) и миРНК в липидные частицы. Согласно данным динамического светорассеяния, размер гибридных наночастиц составляет 100-140 нм и определяется размером липидной оболочки. Включение нанозимов в состав липосом подтверждено методом электронной криомикроскопии. Увеличение дзета-потенциала наночастиц берлинской лазури после формулирования также косвенно подтверждает включение нанозима в липосомы. Исследована кинетика реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами в составе гибридной частицы. Каталитическая константа для наночастиц, включенных в липосомы, закономерно снижается, а константа Михаэлиса – увеличивается, по сравнению с таковыми для свободных нанозимов. Тем не менее, снижение каталитической активности незначительно. Более того, предполагается, что при доставке в клетки липидная оболочка будет разрушаться, высвобождая нанозимы и миРНК непосредственно в цитоплазму. Таким образом, синтезированные гибридные наночастицы обладают высокой каталитической активностью в реакции восстановления Н2О2 и потенциально применимы для терапии двойного действия, а в перспективе позволят существенно снизить уровень АФК в очагах воспаления для повышения эффективности РНК интерференции. 3. Синтез биоконъюгатов нанозим-олигонуклеотид/нанозим-антитело и исследование каталитических и электрокаталитических свойств нанозимов в их составе. С целью применения в иммунохроматографии были синтезированы нанозимы различного размера, а также композитные наночастицы БЛ/полианилин (также с включением антраниловой и аминофенилборной кислот), БЛ/полиэтилендиокситиофен (ПЭДОТ), БЛ/азидометил-ПЭДОТ и его конъюгаты. Установлено, что независимо от размера частиц (30 или 100 нм), поверхностного потенциала (-25 мВ или 4 мВ), использования ПАВ (полиэтиленгликоль, белки), движения наночастиц или их конъюгатов с олигонуклеотидами вдоль нитроцеллюлозной мембраны не наблюдается. Таким образом, замена наночастиц серебра и золота на нанозимы берлинской лазури в иммунохроматографическом анализе не представляется возможной. С целью создания безреагентных электрохимических ДНК сенсоров на втором этапе проекта были синтезированы функционализированные азидо-группами наночастицы берлинской лазури. В ходе завершающего этапа проекта показана эффективность катализа реакции одновалентной медью по Мельдалю и Шарплессу (CuAAC или Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition). Установлено, что использование катализатора позволяет значительно повысить эффективность конъюгации и, как результат, в 5-10 раз увеличить чувствительность детекции меченых олигонуклеотидов. Методом флуориметрии контролировали количество олигонуклеотидов на поверхности нанозима. В дальнейшем использовали конъюгаты, содержащие 10-20 последовательностей. Электрокаталитическая активность конъюгатов в реакции восстановления пероксида водорода изучалась после их иммобилизации на поверхности электрода. Установлено, что максимальные коэффициенты чувствительности в случае коньюгатов (0.41 А∙М-1∙см-2) лишь незначительно уступают таковым для неконъюгированных наночастиц БЛ/азидометил-ПЭДОТ (0.45 А∙М-1∙см-2). Наблюдаемая каталитическая константа в реакции восстановления пероксида водорода в присутствии катехола для биоконъюгатов (3∙104 с-1) менее чем в 2 раза уступает таковой для свободных нанозимных меток на основе композита БЛ/азидометил-ПЭДОТ (5.5∙104 с-1). При этом наблюдаемая константа Михаэлиса увеличивается почти в 2 раза (до 7 мМ), что, вероятно, обусловлено ограниченной диффузией субстрата к поверхности нанозима в составе конъюгата. Для получения конъюгатов с антителами синтезировали нанозимы с амино- и карбоксильными группами. Использовали антитела европейского кролика (Oryctolagus cuniculus), выработанные к иммуноглобулинам полевой мыши (Apodemus agrarius), а также антитела домашнего осла (Equus asinus), к иммуноглобулинам европейского кролика. Реакцию биоконъюгации проводили с помощью дициклогексилкарбодиимида. 4. Разработка и испытание электроаналитических систем на основе ДНК(РНК)-сенсоров/иммуносенсоров с использованием биоконъюгатов нанозим-олигонуклеотид/нанозим-антитело. Поверхность графитовых электродов модифицировали электрополимеризацией азидометил-ЭДОТ, толщина покрытия от 50 до 300 нм. Сохранение азидо-функциональности подтверждено методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области. Редокс превращения известных медиаторов (ферри-/ферроцианид) на поверхности азидометил-ПЭДОТ в физиологических рН характеризуются значительно более высокими электрохимическими константами по сравнению с чистым электродом. Для создания ДНК- и иммуно-сенсоров олигонуклеотиды иммобилизовали на поверхности как азидометил-ПЭДОТ, так и нанозимов клик-реакцией, антитела коньюгировали с нанозимами карбодиимидным способом, на графитовой поверхности антигены и олигонуклеотиды закрепляли путем адсорбции. Регистрацию метки (нанозима) осуществляли по безмедиаторной реакции электровосстановления пероксида водорода. Показано, что специфическое взаимодействие, обусловленное гибридизацией комплементарных ДНК, приводит к увеличению чувствительности пероксидного сенсора по крайней мере на порядок. Определены градуировочные зависимости детекции олигонуклеотидов HULC, меченых нанозимами. Для электрода с азидометил-ПЭДОТ, снижающим неспецифическую сорбцию, минимальная детектируемая концентрация составила 0.1 нМ. Таким образом, разработанный подход пригоден для создания реальных ДНК сенсоров, работа которых, как предполагается, будет основана на гибридизации иммобилизованного на электроде и коньюгированного с нанозимом олигонуклеотидов с разными участками ДНК-мишени, которая, таким образом, будет приводить к иммобилизации электрокаталитической метки на электроде. Аналогично регистрировалась электрокаталитическая активность нанозима в отсутствии (неспецифическая сорбция) и в присутствии иммобилизованных антител. Возможно, ввиду экранирования белковыми молекулами прямой электрокатализ в данном случае оказывается неэффективным, поэтому в систему был добавлен медиатор (катехол). Показано, что специфическое связывание приводит к повышению чувствительности соответствующего пероксидного сенсора в 20 раз, таким образом, открывая перспективы создания реальных иммуно-сенсоров. Высокая электрокаталитическая активность разработанных нанозимов, а также возможность их ковалентной пришивки к биомолекулам (антителам и олигонуклеотидам) позволила разработать прототипы электрохимических иммуно- и ДНК сенсоров, которые позволят осуществлять экспрессную детекцию суб-наномолярных концентраций соответствующих аналитов. 5. Подготовка обзорной статьи и чтение пленарных лекций. Руководителю проекта было предложено написать обзорную статью для журнала Microchimica Acta (IF = 5.83, Q1), что было сделано по результатам проекта; обзор находится в печати. Руководитель проекта выступил с пленарными лекциями, посвященными результатам проекта на двух престижных международных конференциях. 6. Публикации в высокорейтинговых журналах. На третьем этапе по результатам проекта опубликовано 5 статей в журналах Q1: Journal of Physical Chemistry Letters (2) (IF = 6.475, Nature Index), Electrochimica Acta (IF = 6.9), Electrochemistry Communications (IF = 4.724), Dalton Transactions (IF = 4.39). 7. Участие в научных конференциях. Результаты работ по проекту представлены на Международных и Всероссийских научных конференциях: The Eighteenth International Symposium on Electroanalytical Chemistry (18th ISEAC), Changchun, China, XXVIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Cluj-Napoca, Romania, The 10th International Workshop on Surface Modification for Chemical and Biochemical Sensing, Warsaw, Poland, European Biosensor Symposium “EBS 2021 online”, Wildau, Germany. Студенты приняли участие в Международной научной конференции «Ломоносов-2021» (Москва, Россия). Конференции ESEAC-20 и Фрумкинский Симпозиум, указанные в плане, перенесены на 2022 год из-за коронавируса. 8. Участие студентов в научных конкурсах. Исполнители проекта получили награды за победы в научных конкурсах. 9. Защита курсовых и дипломных работ студентами химического факультета МГУ Под руководством участников научного коллектива выполнены и защищены с отличной оценкой 8 дипломных работ по аналитической химии, 4 дипломные работы отмечены аттестационной комиссией. Защищены 4 курсовые работы по аналитической и физической химии. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".