ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
Эндотелий сосудов, образует барьер, регулирующий проникновение в ткани растворов, белков и лейкоцитов. При стимуляции клеток медиаторами воспаления, такими как фактор некроза опухоли (TNF), проницаемость обеспечивается преимущественно за счет открытия или разборки межклеточных контактов. Об участии митохондрий в регуляции эндотелиальной проницаемости практически ничего не известно. Ранее используя митохондриально-направленные проникающие катионы, мы показали, что индуцированная TNF проницаемость эндотелия зависит от митохондрий. Механизм митохондриально-зависимой индукции проницаемости включал снижение общего содержания в клетках белка адгезивных межклеточных контактов, VE-кадгерина, ведущее к разборке межклеточных контактов. Сейчас мы планируем детально исследовать обнаруженный нами механизм митохондриально-зависимой проницаемости эндотелия. Используя модуляторы митохондриальных функций (ингибиторы комплексов электрон-транспортной цепи, ингибиторы митохондриальной АТФ-синтазы, разобщители окислительного фосфорилирования, в том числе проникающие катионы и их конъюгаты с антиоксидантом пластохиноном) а также классические антиоксиданты мы планируем определить какие именно изменения физиологии митохондрий, необходимы для передачи сигнала эндотелиальной проницаемости. Затем мы планируем проверить какой из известных механизмов снижения уровня VE-кадгерина активируется митохондриями: (1) протеолитическое расщепление металлопротеазами внеклеточного матрикса (ММР); (2) эндоцитоз и протеолитическое расщепление в лизосомах; (3) снижение экспрессии мРНК VE-кадгерина. Кроме этого используя антитела против фосфорилированных аминокислотных остатков серина и тирозина мы планируем проверить регулируется ли митохондриями фосфорилирование VE-кадгерина. Также необходимо будет проверить связано ли снижение эндотелиальной проницаемости под действием проникающих катионов следствием наблюдаемого нами ранее подавления активации каспаз. Для этого будет оцениваться влияние общего ингибитора каспаз ZVAD, а также ингибиторов отдельных каспаз на эндотелиальную проницаемость и уровень VE-кадгерина. Кроме этого, важно проверить реализуется ли обнаруженный нами митохондриально-зависимый механизм регуляции эндотелиальной проницаемости in vivo. Для этого планируется оценить влияние проникающих катионов и других модуляторов митохондриальных функций на проницаемость сосудов печени, мозга, легких и кишечника у мышей после внутривенного введения рекомбинантного мышиного TNF.
Мы ожидаем, что в результате проведенных исследований будет в значительной мере изучен обнаруженный нами механизм регуляции эндотелиальной проницаемости митохондриями. Будет определено какие изменения митохондрий являются сигналом для снижения в эндотелиальных клетках содержания VE-кадгерина и увеличения проницаемости. Мы также ожидаем, что будет выяснено какой из известных механизмов снижения содержания VE-кадгерина активируется митохондриями (расщепление внеклеточными протеазами, расщепление в лизосомах или снижение экспрессии мРНК). Будет выяснено регулируется ли митохондриями фосфорилирование VE-кадгерина. Ожидается выяснить вовлечены ли каспазы в митохондриально-зависимый механизм проницаемости эндотелия. Мы ожидаем получить прямое подтверждение того, что обнаруженный нами in vitro механизм митохондриально-зависимой проницаемости эндотелия реализуется при повышении уровня TNF в крови у мышей.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 18 февраля 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Роль митохондрий в регуляции барьерной функции эндотелия |
Результаты этапа: В соответствии с заявленным планом мы сравнили действие разобщителей окислительного фосфорилирования, как протонофорного разобщителя DNP, так и проникающих катионов (C12TPP, и C4R1) и антиоксидантов как митохондриально-направленных (SkQ1 и SkQR1), так и распределяющихся по всей клетке (N-ацетилцистеин, Тролокс) на вызванную TNF проницаемость эндотелия. Ранее мы показали, что SkQ1 предотвращает вызваную TNF проницаемость монослоя эндотелия только после длительной (4 дня) предобработки им клеток [1]. Поэтому испытания действия остальных модуляторов митохондриальных функций мы проводили в тех же условиях. Все эти соединения в одинаковой степени подавляли вызванные TNF усиление проницаемости эндотелия для смеси высокомолекулярных конъюгатов TRITC-Dextran (на рис. 1 А приложения представлены данные для C12TPP, DNP, SkQ1 и Тролокс), разборку адгезионных межклеточных контактов (на рис. 1Б приложения представлены данные для C12TPP, DNP и SkQ1), а также снижение общего количества основного белка адгезионных контактов VE-кадгерина (на рис. 2 А представлены данные для C12TPP, DNP, SkQ1 и Тролокс). Действие разобщителей могло быть связано с их способностью тормозить синтез АТФ. Однако, в отличие от разобщителей и антиоксидантов ни ингибитор АТФ-синтетазы митохондрий, олигомицин, ни ингибитор дыхательной цепи, пьерицидин, не подавляли стимулированную TNF проницаемость эндотелия. Важно отметить, что в клетках EAhy926 и олигомицин и пьерицидин вызывали генерацию АФК (измерено при помощи дигидродихлорфлуоресцеина). Возможно именно этим объясняется неспособность данных соединений подавлять вызванную TNF активацию эндотелиальных клеток. Сходство в эффектах разобщителей и антиоксидантов указывает на возможность существования общего механизма их действия. Для проверки такой возможности была сделана конструкция для трансдукции клеток и получения культур с оверэкспрессией MnSOD. Трансдуцированные этой конструкцией клетки линии EAhy926 были охарактеризованы. Было показано, что в них действительно повышено содержание MnSOD. Используя новый зонд на основе BODIPY и трифенилфосфония мы показали, что оверэкспрессия MnSOD приводит к снижению базового уровня окисления липидов внутренней мембраны митохондрий, что указывало на функциональную активность рекомбинантного фермента. Оверэкспрессия MnSOD в отдельных опытах приводила к снижению чувствительности эндотелиальных клеток к индукции проницаемости под действием TNF. Однако, для получения статистически значимых результатов необходимо проведение дополнительных экспериментов. В соответствии с планом работ по проекту мы проверили предположение о том, что усиление проницаемости монослоя эндотелия связано с расщеплением VE-кадгерина металлопротеазой внеклеточного матрикса 9 (ММР9), и что этот процесс регулируется митохондриями. Было показано, что как общий ингибитор ММР, так и селективный ингибитор ММР9 значительно подавляют вызванную TNF проницаемость монослоя эндотелия (рис. 1 A). Действие разобщителей и антиоксидантов не суммировалось с действием ингибитора ММР9. Снижение общего уровня VE-кадгерина под действием TNF сопровождалось появлением в ростовой среде 90кДа продукта его расщепления ММР9, что предотвращалось разобщителями и антиоксидантами (рис. 2 Б). Кроме этого, мы показали, что TNF вызывает появление ММР9 в культуральной среде (рис. 2 В). И разобщители, и антиоксиданты подавляли действие TNF (рис. 2). Полученные данные указывают на ведущую роль ММР9 в индукции проницаемости эндотелия в клеточной модели, а также на то, что защитное действие разобщителей и антиоксидантов в значительной степени определяется их способностью подавлять содержание ММР9 в культуральной среде. Снижение уровня VE-кадгерина могло быть также связано со снижением транскрипции его гена. В соответствии с заявленными планами мы оценили действие TNF, а также разобщителей и антиоксидантов на экспрессию мРНК VE-кадгерина. Мы наблюдали некоторое снижение уровня мРНК VE-кадгерина через 48 часов после добавления TNF к клеткам. Однако, этот эффект TNF плохо воспроизводился, в то время как разобщители и антиоксиданты никак на него не влияли. Мы также проверили предположение о том, что подавление проницаемости эндотелия после предобработки как митохондриально-направленными, так и классическими антиоксидантами может быть связано с их способностью подавлять вызванный TNF апоптоз эндотелиальных клеток. Полученные результаты были опубликованы [2]. Было показано, что общий ингибитор каспаз ZVAD немного, но статистически значимо подавляет проницаемость монослоя эндотелия (рис. 4 [2]), а также разборку адгезионных контактов (рис. 2 и 3 [2] Было показано, что в низких концентрациях TNF не вызывает апоптоз, но вызывает активацию каспазы-3 (рис. 1 [2]) и каспаз-зависимое расщепление белка адгезионных контактов b-катенина (рис. 5 [2]). Антиоксиданты, как классические, так и SkQR1 блокировали этот процесс. Таким образом, было показано, что антиоксиданты помимо подавления расщепления VE-кадгерина ММР9 способны также блокировать расщепление другого белка адгезионных межклеточных контактов, b-катенина, каспазами и этот механизм вносит небольшой, но значимый вклад в подавление проницаемости эндотелия. 1. Demyanenko IA, Popova EN, Zakharova V V, Ilyinskaya OP, Vasilieva T V, Romashchenko VP, Fedorov A V, Manskikh VN, Skulachev M V, Zinovkin RA, Pletjushkina OY, Skulachev VP, Chernyak B V. Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 improves impaired dermal wound healing in old mice. Aging (Albany NY) 2015;7:475–485. 2. Галкин ИИ, Плетюшкина ОЮ, Зиновкин РА, Захарова ВВ, Черняк БВ, Попова ЕН. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 снижает проницаемость монослоя клеток эндотелия вызванную фактором некроза опухоли. Биохимия М.: М.; 2016;81:1826–1835. | ||
2 | 31 декабря 2016 г.-31 декабря 2017 г. | Роль митохондрий в регуляции барьерной функции эндотелия |
Результаты этапа: Мы продолжили исследование митохондриално-зависимых механизмов регуляции эндотелиального барьера. На первом этапе работ по проекту мы показали, что из целого ряда модуляторов митохондриальных функций только разобщители окислительного фосфорилирования (в низких концентрациях) и антиоксиданты способны подавлять стимулированные TNF снижение содержания основного белка межклеточных адгезионных контактов, VE-кадгерина, разборку межклеточных контактов и, как следствие, проницаемость монослоя эндотелия. Таким образом, было получено указание на возможность существования общего механизма действия разобщителей и антиоксидантов. Сейчас мы проверили возможность существования антиоксидантного механизма действия низких концентраций разобщителей окислительного фосфорилироваия в данной модели. Используя новый зонд мито-BODIPY, позволяющий оценивать степень перекисного окисления фосфолипидов внутренней мембраны митохондрий, мы показали, что TNF не вызывает заметного перекисного окисления фосфолипидов митохондрий. Мы также показали, что в эндотелиальных клетках разобщители не предотвращают вызванное пероксидом водорода перекисное окисление фосфолипидов митохондрий. Полученные данные хоть и не опровергают полностью возможности антиоксидантного действия разобщителей в используемой модели, но являются весомым свидетельством против нее. В соответствии с поставленными планами мы продолжили исследование митохондриально-зависимого механизма расщепления белка межклеточных контактов, VE-кадгерина. Мы показали, что разобщители ДНФ и C4R1 способны частично ингибировать вызванную TNF проницаемость монослоя эндотелия, не только в условиях долгой (несколько суток), но и в условиях кратковременной (2 часа) предобработки ими клеток. Показали, что механизм действия разобщителей в обоих случаях связан с предотвращением вызванного TNF появления в ростовой среде металлопротеазы внеклеточного матрикса 9 (ММР9) и, как следствие отщепления 90кДА внеклеточного домена VE-кадгерина этой протеазой. Было показано, что в случае длительной предобработки разобщители окислительного фосфорилирования, как и антиоксиданты (как общего действия, так и накапливающиеся в митохондриях) ингибируют вызванную ФНО экспрессию мРНК ММР9. Мы также определили, что и разобщители и антиоксиданты подавляют экспрессию мРНК ММР9 за счет предотвращения вызванной TNF активации NfkB. Эти данные вместе с полученными на первом этапе проекта были опубликованы (1). Мы также приступили к исследованию противовоспалительного действия разобщителей in vivo в моделях острого воспаления. Было показано, что разобщители предотвращают гибель мышей, вызванную введением летальной дозы рекомбинантного мышиного TNF (было опубликовано в (1)). В другой модели острого воспаления, вызванного введением каррагенана в подкожные воздушные мешки у мышей было показано, что выраженным противовоспалительным действием обладает антиоксидант SkQ1, но не разобщитель C12TPP (опубликовано (2)). В модели, где воспаление, вызванное повреждением тканей при формировании подкожного «воздушного мешка» не усиливали введением каррагенана, а также in vitro на клетках линии базофильной лейкемии крыс RBL2H3 было показано, что SkQ1 способен предотвращать дегрануляцию тучных клеток (опубликовано (3)). Поскольку, секретируя гистамин, ТК играют важнейшую роль в регуляции проницаемости сосудистой стенки, снижение степени их дегрануляции под действием SkQ1 может играть ключевую роль в противовоспалительной активности этого антиоксиданта наряду с его действием на эндотелиальные клетки. 1. Zakharova V V., Pletjushkina OY, Galkin II, et al.: Low concentration of uncouplers of oxidative phosphorylation decreases the TNF-induced endothelial permeability and lethality in mice [Internet]. Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis 2017; 1863:968–977[cited 2017 Feb 3] Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0925443917300376 2. Chelombitko MA, Averina OA, Vasil’eva T V., et al.: Comparison of the effects of mitochondria-targeted antioxidant 10-(6’-plastoquinonyl)decyltriphenylphosphonium bromide (SkQ1) and a fragment of its molecule dodecyltriphenylphosphonium on carrageenan-induced acute inflammation in mouse model of subcuteneo [Internet]. Bull Exp Biol Med 2017; 162:730–733[cited 2017 Dec 19] Available from: http://link.springer.com/10.1007/s10517-017-3699-9 3. Chelombitko MA, Averina OA, Vasilyeva T V., et al.: Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 (10-(6′-plastoquinonyl)decyltriphenylphosphonium bromide) inhibits mast cell degranulation in vivo and in vitro [Internet]. Biochem 2017; 82:1493–1503[cited 2017 Dec 19] Available from: http://link.springer.com/10.1134/S0006297917120082 | ||
3 | 31 декабря 2017 г.-31 декабря 2018 г. | Роль митохондрий в регуляции барьерной функции эндотелия |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".