ИСТИНА

Проект посвящен изучению основных закономерностей развития и жизнедеятельности различных групп фототрофных серных бактерий, обитающих в реликтовых водоемах, находящихся на разной стадии изоляции от Белого моря. Широкое распространение фототрофных серных бактерий обусловлено их способностью использовать при фотосинтезе сероводород в качестве донора водорода. Эта физиологическая особенность позволяет фототрофным серобактериям занять особую экологическую нишу в меромиктических водоемах, имеющих анаэробную зону, доступную солнечному свету. Аноксигенные фототрофные бактерии, развивающиеся в хемоклине меромиктических водоемов, являются естественным биологическим фильтром, препятствующим проникновению сероводорода в верхние слои озер, и тем самым сохраняют баланс между аэробными и анаэробными водами. Поскольку берега Белого моря в районе Кандалакшского залива поднимаются со скоростью около 4 мм в год, некоторые морские лагуны со временем превращаются в озера. Экологическая система изолированных водоемов претерпевает катастрофические изменения – поверхностный слой воды постепенно опресняется, а в придонной воде возникает дефицит кислорода и сероводородное заражение. Морские фауна и флора постепенно деградируют и замещаются на солоноватоводные или пресноводные. Такие отделяющиеся водоемы интересны для изучения своей многослойностью: слои воды различаются не только температурой, соленостью и другими физико-химическими характеристиками, но и микроорганизмами, обитающими в них, содержанием растворенного органического вещества и оптическими свойствами. Сообщества аноксигенных фототрофных бактерий являются динамичными системами, видовой состав которых меняется в зависимости от сезона, физико-химических свойств воды, спектрального состава света и уровня освещенности. Фундаментальная задача данного проекта - исследование и разделение вкладов различных групп зеленых серных бактерий в состав микробного сообщества отделяющихся водоемов Кандалакшского залива Белого моря с использованием комплекса спектрально-оптических и физико-химических методов. Планируется отбор проб из отделяющихся водоемов на разной стадии изоляции от моря, содержащих зеленые серные бактерии, культивирование в различных условиях и дальнейшие спектральные исследования. Для разделения вкладов зеленоокрашенных и коричневоокрашенных зеленых серных бактерий будут применены недавно разработанные авторами заявки спектральные методы. По спектрам поглощения и флуоресценции ацетон-метаноловых экстрактов будет определен пигментный состав бактерий и разделение вкладов бактериохлорофиллов d и e. В результате выполнения проекта будет установлена взаимосвязь между групповым составом микробного сообщества аноксигенной зоны и условиями обитания фототрофных микроорганизмов в отделяющихся от Белого моря водоемах.

В конце 2016 года будут получены следующие результаты: 1. Будут проведены спектрально-флуоресцентные измерения двух типов чистых культур (зеленоокрашенные и коричневоокрашенные) зеленых серных бактерий в и в качестве смесей в различных пропорциях. Будет получена кривая положения максимума флуоресценции бактериохлорофилла в зависимости от соотношения концентраций двух групп бактерий. 2. Будут проведены спектрофотометрические измерения ацетон-метаноловых экстрактов культур зеленых серных бактерий для дальнейшего расчета концентраций бактериохлорофилла в клетках зеленых серных бактерий, будет получена кривая зависимости соотношения площадей под коротковолновыми максимумами поглощения света бактериохлорофиллом от соотношения концентраций бактериохлорофиллов d и e. Такая задача ставится впервые. 3. Будет проведена оценка содержания бактериохлорофилла в клетках зеленых серных бактерий по отдельности для групп зеленоокрашенных и коричневоокрашенных бактерий. 4. Будут проведены физико-химические и спектрально-оптические измерения образцов воды из пяти отделяющихся от Белого моря водоемов (лагуна на Зеленом мысу, озера Кисло-Сладкое, Еловое, Нижнее Ершовское и Трехцветное), содержащих зеленые серные бактерии в ходе полевой работы в июле-августе 2016 г. Будут определены условия положения слоев воды с бактериями в зависимости от распределения температуры, солености, pH, Eh, содержания растворенного кислорода и концентрации сероводорода в водоемах. Сравнение с измерениями, проведенными в разные сезоны 2013-2014 гг. позволит выявить сезонную динамику численности зеленых серобактерий в слое хемоклина, а также впервые оценить сезонную динамику соотношения разных групп бактерий (зеленоокрашенных и коричневоокрашенных) в слоях воды с разной глубины. 5. Будет проведен расчет соотношений концентраций зеленоокрашенных и коричневоокрашенных зеленых серных бактерий, а также бактериохлорофиллов d и e в слоях воды с использованием спектров флуоресценции образцов природной воды и спектров поглощения ацетон-метаноловых экстрактов. Будут построены кривые распределения по глубине концентраций разных типов аноксигенных микроорганизмов в отделяющихся водоемах и эти данные будут сопоставлены с распределением физико-химических характеристик. Подобный расчет ранее не проводился, задача является принципиально новой.

После схода ледника в обрасти Карельского берега Белого моря около двенадцати тысяч лет назад твердые породы, придавленный ледяной горой, начали распрямляться, и их поднятие происходит до сих пор со скоростью около 4 мм в год, в результате чего некоторые лагуны постепенно отделяются от моря и превращаются в озера. В ходе отделения экологическая система изолированного озера претерпевает сильные изменения, в результате чего озера постепенно утрачивают морской облик и могут превращаться в солоноватые лагуны, меромиктические или пресноводные озера. Прекращение приливно-отливного перемешивания приводит к расслоению водной толщи: слои воды различаются не только температурой, соленостью и другими физико-химическими характеристиками, но и микроорганизмами, обитающими в них, содержанием растворенного органического вещества и оптическими свойствами. Известно, что реликтовые беломорские озера содержат цветные слои, окраска которых вызвана содержанием в них различных бактерий и одноклеточных водорослей . Оттенок и насыщенность цвета слоя зависит от вида и концентрации обитающих на этой глубине микроорганизмов. Отбор проб производили в месте максимальной глубины от поверхности до дна с шагом 0,5 м, уменьшая шаг до 0,1 м в области цветных слоев. Измерение спектров поглощения проводили в лабораторных условиях с помощью спектрофотометра HITACHI-557 в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. В спектрах поглощения разных фотосинтетических пигментов отличаются положения максимумов. Хлорофилл a водорослей поглощает в области длин волн от 600 до 700 нм, максимум поглощения бактериохлорофилла c,d,e зеленых серобактерий находится в диапазоне 700-800 нм, для бактериохлорофилла пурпурных бактерий пик располагается в дальней красной области спектра (более 800 нм). Измеряя спектр поглощения воды, можно определить преобладающую в ней группу фотосинтезирующих микроорганизмов.

В 2016 году проведены исследования чистых культур зеленых серных бактерий различных типов. Сотрудниками Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН (Лунина О.Н., Саввичев А.С.) были подготовлены чистые культуры зеленых серных бактерий, выделенные из образцов воды отделяющихся от Белого моря водоемов (озера Трехцветного, лагуны на Зеленом мысу): зеленоокрашенные зеленые серные бактерии Chlorobium luteolum (5,8*107 кл/мл) и коричневоокрашенные зеленые серные бактерии Chlorobium phaeovibrioides (3,1*107 кл/мл). В лаборатории физического факультета МГУ проведены предварительные исследования и подобраны оптимальные параметры спектральных установок для изучения зеленых серобактерий в воде методами абсорбционной и люминесцентной спектроскопии. Для определения флуоресцентных характеристик суспензии культур бактерий помещали в стандартные кварцевые кюветы с длиной оптического пути 10 мм и с помощью спектрофлуориметра Solar CM2203 (спектральные щели 5х5 нм, скорость сканирования «средняя») измеряли спектры испускания флуоресценции при возбуждении светом длинами волн 440 нм (максимум в спектрах поглощения и возбуждения флуоресценции для зеленоокрашенных культур) и 525 нм (максимум в спектрах поглощения и возбуждения флуоресценции для коричневоокрашенных культур). Так как в клетках зеленоокрашенных зеленых серных бактерий содержится бактериохлорофилл d, максимум в спектре испускания флуоресценции для данных культур располагается на длине волны 765 нм; в клетках коричневоокрашенных зеленых серных бактерий с бактериохлорофиллом e данный максимум расположен на длине волны 745 нм. В случае, когда в образцах одновременно присутствуют оба типа бактерий, данный максимум может располагаться в диапазоне 740-770 нм в зависимости от соотношения концентраций двух типов бактерий. Для определения положения данного максимума в зависимости от соотношения концентраций разных видов бактерий приготовлены смеси с различным процентным содержанием двух типов бактерий: (1) – только зеленоокрашенные культуры, (2) – 75% зеленоокрашенных культур и 25% коричневоокрашенных культур, (3) – 60% зеленоокрашенных культур и 40% коричневоокрашенных культур, (4) – 45% зеленоокрашенных культур и 55% коричневоокрашенных культур, (5) – только коричневоокрашенные культуры. Анализ спектров испускания флуоресценции проводили по следующей разработанной авторами проекта методике. Флуоресцентный пик бактериохлорофилла аппроксимировали двумя кривыми гауссовой формы с максимумами на длинах волн 745 и 765 нм. Рассчитанное отношение площадей спектральных компонентов S765/S745 хорошо согласовалось с отношением концентраций двух видов бактерий. Апробированный метод в дальнейшем будет использован для разделения вкладов различных видов бактерий в образцах природной воды. Для дальнейшего исследования культур были приготовлены ацетон-метаноловые экстракты чистых культур и смесей (1-5 из предыдущего абзаца). Для получения экстрактов зеленых серных бактерий культуру осаждали центрифугированием, затем добавляли смесь ацетона с метанолом (7:2). После добавления экстрагирующей смеси пробирку закрывали герметически и заворачивали в фольгу, после чего помещали в холодильник на несколько суток. Затем смесь вновь центрифугировали и проводили измерения супернатанта. Спектры поглощения экстрактов культур регистрировались на спектрофотометре Unico в спектральном диапазоне 200-1100 нм. Спектры поглощения для экстрактов культур содержат два пика поглощения света хлорофильными пигментами бактерий: коротковолновый и длинноволновый. Длинноволновая полоса поглощения практически одинакова для различных культур, поэтому проводился анализ коротковолновой полосы. Экстракты зеленоокрашенных зеленых серных бактерий с бактериохлорофиллом d в их пигментном составе поглощают свет на длине волны 430 нм, коричневоокрашенных – 470 нм. Данное различие позволяет оценить соотношение различных типов зеленых серных бактерий в смешанной бактериальной популяции. Типичные спектры поглощения экстрактов смесей бактериальных культур или природных образцов включают в себя оба коротковолновых максимума. Чтобы определить соотношение концентраций бактериохлорофиллов d и e, экстрагированных из клеток, рассчитывалась соотношение площадей под двумя спектральными пиками (с учетом рассеивания света на частицах). Данное отношение хорошо коррелировало с отношением концентраций бактериохлорофиллов d и e, рассчитанными по эмпирической формуле из статьи [Лунина О.Н., Саввичев А.С., Кузнецов Б.Б., Пименов Н.В., Горленко В.М., Аноксигенные фототрофные бактерии стратифицированного озера Кисло-Сладкое (Кандалакшский залив Белого моря // Микробиология 83(1): с. 90-108, 2014] C(Бхл(d+e))=(1.315*E655’-0.643*E677’+0.005)v*106/(V+d*e*Бхл d), где C(Бхл(d+e)) – концентрация бактериохлорофиллов в мг/м3, Е655’=Е655-Е850, Е667’=Е667-Е850 – величины оптической плотности экстракта пигментов на длинах волн 655 и 667 нм соответственно (исключая мутность на длине волны 850 нм), v- объем ацетон-метанолового экстракта, V – объем профильтрованной пробы, d – ширина кюветы, e*Бхл d=98 мг/см – абсорбционный коэффициент. Это говорит о хорошей применимости нового спектроскопического алгоритма. Данным методом впервые рассчитано количество молекул бактериохлорофилла, содержащееся в одной клетке зеленой серной бактерии: в зеленокрашенной культуре зеленых серных бактерий содержалось в среднем 250•103 молекул бактериохлорофилла d, в коричневоокрашенной – 73•103 молекул бактериохлорофилла e на клетку. Наглядной моделью водной экосистемы, учитывающей влияние градиентов всех факторов, является «колонка Виноградского», которая демонстрирует распределение по глубине различных микроорганизмов (рис. 3). «Колонка Виноградского» в нашей работе - это модель прокариотной экосистемы острова Средний Кандалакшского залива Белого моря. В высоком стеклянном цилиндре на дне происходит разложение органического вещества в смеси ила и субстрата (газета - источник углерода в виде целлюлозы, яичная скорлупа - источник карбоната кальция, и яичный желток - источник серы). Сероводород в нижних слоях цилиндра возникает за счет сульфатредукции, а выше развиваются стратифицированные слои пурпурных и зеленых серобактерий за счет аноксигенного фотосинтеза. Освещение колонки рассеянным солнечным светом в течение месяца приводит к возникновению двух градиентов концентрации – кислорода (его концентрация уменьшается сверху вниз) и сульфида (в противоположном направлении). Эти два градиента способствуют росту различных микроорганизмов, таких как Clostridium, Desulfovibrio, Chlorobium, Chromatium, Rhodomicrobium и Beggiatoa, а также других видов бактерий, цианобактерий и водорослей. В бескислородной зоне начинают развиваться пурпурные серные бактерии, под ним располагаются зеленые серные бактерии, изучаемые в работе. В ходе экспедиции в июле 2016 г. отобраны пробы воды из пяти отделяющихся от Белого моря водоемов с одновременной регистрацией их физико-химических и люминесцентных характеристик. Проанализированы результаты, полученные для двух озер: Трехцветного и Елового, которые практически полностью отделились от Белого моря. Вода в этих озерах состоят из трех слоев, имеющих принципиальное различие в спектрально-флуоресцентных и физико-химических характеристиках: практически прозрачный поверхностный слой с фототрофными организмами, ярко окрашенный (изумрудно-зеленый в озере Трехцветном и буро-коричневый в озере Еловом) слой с максимальной концентрацией зеленых серных бактерий в области хемоклина соответствует переходу от оксигенной среды к аноксигенной и лимонно-желтый придонный слой, содержащий зеленые серные бактерии, с высоким содержанием сероводорода и низким уровнем освещенности. Для образцов воды из озер Трехцветного и Елового без пробоподготовки измерены спектры флуоресценции. Используя разработанный исполнителями проекта метод разделения вкладов разных типов бактерий с помощью анализа формы полосы флуоресценции в области 740-770 нм, впервые были построены вертикальные распределения относительной интенсивности флуоресценции бактериохлорофиллов двух типов зеленых серных бактерий. По спектрам поглощения ацетон-метаноловых экстрактов рассчитаны концентрации бактериохлорофиллов d+e и построены вертикальные распределения содержания фотосинтетических пигментов в озерах Трехцветном и Еловом. В озере Трехцветном слой с наибольшим содержанием зеленых серных бактерий имел толщину около 30 см и располагался на глубине 1.7-2.0 м. Данный слой характеризуется резким скачком концентрации бактерий и таким же резким падением. Максимальная концентрация пигментов зеленых серных бактерий была обнаружена на глубине 1.825 м, концентрация бактериохлорофиллов d+e составляла 15885 мг/м3. было обнаружено, что распределение интенсивности флуоресценции бактериохлорофиллов по глубине не соответствовало распределению по концентрации пигментов. График вертикального распределения интенсивности флуоресценции характеризовался резким увеличением флуоресценции возле глубины 1.7 м с максимальным значением на 1.925 м, затем плавным падением до глубины 4 м и последующим нарастанием ее интенсивности с глубиной.. Положения максимумов распределений концентрации пигментов и интенсивности флуоресценции бактериохлорофиллов не совпадали и находились на расстоянии 10 см друг от друга по глубине. В озере Еловом зеленые серные бактерии появлялись на глубине 2.7 м. Их концентрация резко возрастала с увеличением глубины до 2.95 м и составляла 4131 мг/м3 в максимуме. Затем наблюдалось резкое уменьшение концентрации бактерий, но более плавное, чем в озере Трехцветном. С глубины 3.5 м и ниже концентрация зеленых серных бактерий практически не изменялась. Увеличение флуоресценции бактериохлорофилла начинается с увеличением концентрации зеленых серных бактерий на глубине 2.7 м и резко растет до глубины 2.9 м. Затем присутствовало небольшое плавное возрастание флуоресценции с максимумом на глубине 3.075 м, после чего наступал резкий спад интенсивности и не изменялся в слоях 3.2-5.0 м. Используя разработанные спектральные методы разделения вкладов зеленоокрашенных и коричневоокрашенных типов зеленых серных бактерий впервые проведена оценка концентраций двух форм серобактерий непосредственно в природной воде на различной глубине: в озере Еловом в области хемоклина присутствовало около 40 % коричневоокрашенных бактерий, затем их содержание по сравнению с зеленоокрашенными увеличивалось до 65 % у дна озера; в озере Трехцветном не обнаружено коричневоокрашенных форм зеленых серных бактерий.