ИСТИНА

Проект направлен на исследование роли транспорта и процессинга теломеразной РНК человека на ее функционирование. Ранее мы показали кодирующий потенциал теломеразной РНК человека, что открывает новый взгляд на ее функционирование. Теломеразная РНК входит в состав фермента теломеразы, предоставляя матрицу для синтеза теломер. Недавно мы продемонстрировали, что теломеразная РНК человека является матрицей для синтеза белка. Две функциональные роли предусматривают локализацию в разных частях клетки: теломераза удлиняет теломеры в ядре, а трансляция осуществляется в цитоплазме. Механизм биогенеза теломеразной РНК человека до сих пор остается нераскрытым. Известно, что длинный первичный транскрипт (используется в качестве матрицы для синтеза белка) подвергается процессингу с образованием более короткого продукта, входящего в состав теломеразного комплекса. Мы планируем выяснить роль некоторых факторов транскрипции и транспорта РНК в функционировании теломеразной РНК человека.

The investigation of the correlation between transport and processing of the human telomerase RNA with its functioning. Previous we have shown the coding capacity of the human telomerase RNA that uncover the new point for the investigations of its functioning and regulation. Telomerase RAN is used as a template for telomeres synthesis as a component of telomerase complex. Recently we have demonstrated that human telomerase RNA codes for the cell protective protein. Two functional roles are realized in different compartment of the cell: telomerase elongates the telomeres in the nucleus, however, translation occurs in the cytoplasm. The mechanism of biogenesis of the human telomerase RNA is investigated fragmentary. It is known that the long primary transcript (that is used as a template for protein synthesis) is processed to the short product that is a component of the telomerase complex. Here we will investigate the role of different factors involved in regulation of transcription and RNA transport in the human telomerase RNA functioning.

В конце первого года выполнения проекта мы получим данные о процессинге теломеразной РНК человека в условиях нокдауна ряда генов, вовлеченных в регуляцию транскрипции, транспорта и процессинга РНК. Мы планируем исследовать участие в процессинге теломеразной РНК человека не менее 5 генов.

В ходе исследований мы продемонстрировали кодирующий потенциал теломеразной РНК человека, а также доказали ее цитоплазматическую локализацию для чего были отработаны методики разделения ядерного и цитоплазматического экстрактов с последующим анализом распределения РНК в них. Получены антитела, специфически взаимодействующие с белком hTERP, и отработаны условия Вестерн-блоттинг анализа этого белка. В нашей лаборатории отработаны методики нокдаунов различных генов с последующей оценкой степени процессинга теломеразной РНК. Мы продемонстрировали, что корректный процессинг теломеразной РНК человека происходит ко-транскрипционно, причем именно промотор определяет судьбу транскрипта. Мы предполагаем, что при инициации транскрипции на промоторе собирается комплекс, содержащий все необходимые факторы для корректного процессинга теломеразной РНК. Таким образом, мы в совершенстве владеем всеми необходимыми для реализации настоящего проекта методиками, которые необходимо объединить в единую методологию для проверки гипотезы о поддержании баланса между различными функциями теломеразной РНК человека (активность теломеразы или кодирующий потенциал).

Проведен анализ литературы и выбраны гены-кандидаты в участники биогенеза теломеразной РНК человека. Отработана методика разделения экстрактов на ядерную и цитоплазматическую фракции. Подобраны siRNA специфичные к выбранным генам. Осуществлен анализ эффективности нокдаунов исследуемых генов. Подобраны оптимальные условия (концентрация siRNA и продолжительность) проведения нокдауна выбранных генов. Проведен анализ изменения количества теломеразной РНК человека, ее предшественника, их локализации, а также теломеразной активности в клетках со сниженной экспрессией исследуемых генов. Нокдаун гена PHAX приводит к активации теломеразы. Снижение экспрессии PHAX приводит к накоплению малой ядерной РНК U2 в ядре клетки. Нокдаун гена ARS2 приводит к снижению содержания малой ядерной РНК U2 и теломеразной РНК человека в ядре клетки. Получены репортерные линии для изучения влияния условий культивирования клеток на процессинг теломеразной РНК человека. Мы проверили влияние нескольких параметров среды на процессинг теломеразной РНК. Оказалось, что содержание глутамина в проверенном диапозоне концентраций не влияет на процессинг теломеразной РНК человека. Снижение рН среды культивирования ингибирует процессинг и приводит к накоплению предшественника теломеразной РНК человека, а ингибирование гликолиза демонстрирует обратный эффект. Снижение рН, а также метаболизм по пути гликолиза являются характеристиками раковой трансформации клеток, и мы можем сказать, что именно в таких условиях, по всей видимости, снижается эффективность процессинга теломеразной РНК человека, что должно приводить к накоплению предшественника теломеразной РНК человека и синтезу белка hTERP, который, как показано нами ранее, защищает клетки от апоптоза и регулирует аутофагию в стрессовых условиях.